過氧化氫酶米氏常數(shù)的測(cè)定

1、生化實(shí)驗(yàn)過氧化氫酶米氏常數(shù)的測(cè)定傅璐 1211400122013/11/28過氧化氫酶米氏常數(shù)的測(cè)定傅璐 121140012-、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? . 了解米氏常數(shù)的測(cè)定方法2 .學(xué)習(xí)提取生物組織中的酶二、實(shí)驗(yàn)原理1 .米氏反應(yīng)動(dòng)力學(xué)米氏方程(Michaelis-Menten Equation):文檔底物濃度網(wǎng)對(duì)醯反應(yīng)速度的影響V 181米氏方程常見的一些餐的1,但n底物UH也Uffe Ihi 4)ILU,IS己他總衲(JH)IL 15黠L(fēng)*演的看1%HCt)；y聯(lián)整乳JiFt的II沉附的茶酷H-&Wi幃，年甲酹蹄初施悵戴除帕撥船2H附了酷g內(nèi)相的柳刎油內(nèi)胸前IJ孔融蛻曲M內(nèi)用他昴知相新木艇L jf

2、iiK52 .米氏常數(shù)的意義： 反映酶的種類：Km是一種酶的特征常數(shù)，只與酶的種類有關(guān)，與酶濃度、 底物濃度無關(guān)。 米氏常數(shù)是酶促反應(yīng)達(dá)到最大反應(yīng)速度 Vmax 一半時(shí)的底物濃度。其數(shù)值大 小反映了酶與底物之間的親和力：Km值越大，親和力越弱，反之 Km值越 小，親和能力越強(qiáng)。Km可用來判斷酶(多功能酶)的最適底物：Km值最小的酶促反應(yīng)對(duì)應(yīng)底物 就是該酶的最適底物。3 .米氏常數(shù)的求法:I.直觀作圖法:一同該方法的缺點(diǎn)是難以確定最大 反應(yīng)速度Vmax。2.雙倒數(shù)作圖法：1八7Km 11W T V IS1 V mm I - Judi兩Linewtavcr-Burk 雙倒數(shù)ft 用法該作圖法應(yīng)用最

3、廣。但在低濃度是 v值誤差較大，在S等差值實(shí)驗(yàn)時(shí)作圖點(diǎn)較集中于縱軸。因此在設(shè)計(jì)底物濃度時(shí)，最好將1/S配成等差數(shù)列，這樣可使點(diǎn)距較為平均，再配以最小二乘回歸法，就可以得到較為準(zhǔn)確的結(jié)果。3. HHiies-Woolf作圖法Sl_ 人S -r、 V V空固nt mis斜率二(IHwwWTf作用法此法優(yōu)點(diǎn)是橫軸上點(diǎn)分布均勻，缺點(diǎn)是 1/v會(huì)放大誤差，同時(shí)對(duì)底物濃度的選擇 有要求。SKm時(shí)直線將在原點(diǎn)附近與軸相交。4 .氧化酶：生物體內(nèi)重要的三種氧化酶類，其作用均是消除體內(nèi)自由基:POD:過氧化物酶SOD:超氧化物歧化酶CAT:;過氧化氫酶5 .過氧化氫酶的作用：植物體內(nèi)活性氧代謝加強(qiáng)而使過氧化氫發(fā)

4、生積累。過氧化氫可進(jìn)行一步生成 氫氧自由基。氫氧自由基是化學(xué)性質(zhì)最活潑的活性氧，可以直接或間接地氧化細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，并且有非常高的速度常數(shù)，破壞性極強(qiáng)，可使 細(xì)胞膜遭受損害，加速細(xì)胞的衰老和解體。過氧化氫酶(catalase CAT)可以清 除過氧化氫、分解氫氧自由基，保護(hù)機(jī)體細(xì)胞穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境及細(xì)胞的正常生活， 因此CAT是植物體內(nèi)重要的酶促防御系統(tǒng)之一，其活性高低與植物的抗逆性密 切相關(guān)。6 .過氧化氫酶活力的測(cè)定方法：紫外吸收法：過氧化氫在240nm波長(zhǎng)下有強(qiáng)烈吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度（A240nm）隨反應(yīng)時(shí)間而降低。根據(jù)測(cè)量吸光度的變化速度即可測(cè)出

5、 過氧化氫酶的活性。（以一分鐘內(nèi)A240nm下降0.1為一個(gè)單位）滴定法（高鈕酸鉀法、碘量法）在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量（反應(yīng)過量）的過氧化氫溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn) 高鈕酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的過氧化氫。根據(jù)單位時(shí)間內(nèi)消耗的過 氧化氫的量即可測(cè)出過氧化氫酶活力大小。7 .實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng)：H2O2被過氧化氫酶分解出 H2O和O2 ,未分解的H2O2用KMnO4在酸性環(huán)境中滴定，根據(jù)反應(yīng)前后的濃度差可以算出反應(yīng)速度：酶2H2O2 - 2H2O + O22KMnO4+5H2O2+3H2SO4 f 2MnO4+K2SO4+8H2O+5O2（本實(shí)驗(yàn)以馬鈴薯提供過氧化氫酶） 三、實(shí)驗(yàn)試劑1. 0.

6、02mol/L磷酸緩沖溶液（pH=7.0）:實(shí)驗(yàn)室提供.2. 酶液：稱取馬鈴薯5g,加緩沖液10mL,勻漿過濾.3. 0.01mol/L 高鈕酸鉀.4. 0.098mol/L H2O2.5. 25%H2SO4.四、實(shí)驗(yàn)操作取6只錐形瓶，按下表的順序加入試劑瓶號(hào) 試劑01234(K098M HQJml,if01.0仆1,25L672.55AM)蒸儲(chǔ)水/ini9.5X.5U8.257.837E4,50酶液加油IK 50.50.5滴定用去KMnO/mlV 1 0工v2、3v.樣品實(shí)際消耗的KMnOj/mlvrv0vrv0J。v4-v0先加好過氧化氫和蒸儲(chǔ)水，加酶液后立即混合，依次記

7、錄各瓶的起始反應(yīng)時(shí)間. 反映到達(dá)5min立即加入2ml 25%硫酸終止反應(yīng)，充分混勻.。用0.01mol/L的 KMnO4溶液滴定瓶中剩余的過氧化氫至微紅色，記錄消耗的高鈕酸鉀體積.o五、注意事項(xiàng):1 .反應(yīng)時(shí)間必須準(zhǔn)確。2 .酶濃度須均一，若酶活力過大，應(yīng)適當(dāng)稀釋3 .滴定終點(diǎn)的判定。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1籽4匚如必訊”地目-法事F而* /斤 一 -二 一- - _ _ _/ 1*。|工7匕史格 成#F勺麗4一 憲羋日1日.O %Q.得9，O 1 -號(hào) 1 tr1a h g 1 =當(dāng)1 人占了 為& 9.0。 7,牛g 3 定為、73a 1 7、4g、L _4國(guó)強(qiáng)力,卜95 r6 2 /外1。4貼

8、C 4,3上 注、5。/過氧化氫濃度：0.098mol/L稱取馬鈴薯的質(zhì)量：5.00g高鈕酸鉀：0.01mol/L廳P1345V (KMnO4/ml212.4S/(mol/L)0.00980.0163680.02450.049v/(mmol/min)0.00610.0107320.01740.0361/S102.040861.0948 40.816320.40821/v163.934493.179357.471327.7778米氏常數(shù)Km= -0.1913七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：1 .曲線上少一個(gè)點(diǎn)的原因：用移液管移取序號(hào)為2的過氧化氫溶液(應(yīng)為1.25ml)錯(cuò)誤的移取了 1.75ml, 故在制圖時(shí)將其舍去。2 .曲線線性較好(R2=0.9988)的原因：本實(shí)驗(yàn)采取了兩人分工的方法完成實(shí)驗(yàn)，控制反應(yīng)結(jié)束及滴定分別由一人完成，所以標(biāo)準(zhǔn)都相同，從而在一定程度上提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。3 . Km計(jì)算結(jié)果呈負(fù)