大連理工大學(xué)生化實(shí)驗(yàn)B

1、2014年生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)B實(shí)驗(yàn)報告 姓 名： 姓名 學(xué) 號： 201247044 實(shí)驗(yàn)時間： 2014.11.15 實(shí)驗(yàn)分組： 第七組 組內(nèi)成員： 組員 201247002 組員 201247020 組員 201247060 任課教師： 李曉暉 小牛腸堿性磷酸酶的提取及酶活測定考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量組員1，組員2，組員3，組員4化工與環(huán)境生命學(xué)部 化工學(xué)院 化學(xué)工程與工藝（國際）1201班摘要 本文以從小牛腸中提取堿性磷酸酶為例，介紹了生物體中分離、提取酶的方法，以及如何使用考馬斯亮藍(lán)法測定所提取酶的蛋白含量并以此得出酶活。同時通過SDS-聚丙

2、烯酰胺凝膠電泳來測定給定蛋白質(zhì)樣品的相對分子質(zhì)量。關(guān)鍵詞 小牛腸堿性磷酸酶 酶活 對硝基苯酚 吸光值 考馬斯亮藍(lán)R-250 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量堿性磷酸酶（AKP,EC 3.1.3.1）是一種非特異性水解酶，廣泛存在于動物各臟器、微生物和植物中。它在體外能催化多種磷酸單脂類化合物的水解，得到相應(yīng)的醇。不同來源的AKP，其分子量和亞基結(jié)構(gòu)各不相同。小牛腸堿性磷酸酶相對分子質(zhì)量為145000，等電點(diǎn)為7.5。在體外可催化底物對硝基苯磷酸二鈉生成對硝基苯酚，后者在405nm光波長下有最大吸收，通過測定吸光值的變化率，即可測定堿性磷酸酶的活力。酶活定義：在最適條件下，以每分鐘

3、催化水解1µmol底物的酶量為一個酶活力單位。本實(shí)驗(yàn)溫度取37。酶活力的計(jì)算： 酶活力（u/mg）=式中，A/min為405nm波長下的吸光值的變化率；VR為反應(yīng)液的體積，D為稀釋倍數(shù)；E405為405nm波長下對硝基苯酚的摩爾消光系數(shù)，18.3；VE為所加酶液體積；C為蛋白濃度；L為比色皿光程?？捡R斯亮藍(lán)R-250測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍(lán)R-250在酸性溶液中的游離狀態(tài)呈紅褐色，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，前者最大吸收波長為465nm，后者為595nm。在一定蛋白濃度范圍內(nèi)（0.01-1.0mg/L），蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長下的光吸收與蛋白質(zhì)含量成

4、正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量分析。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離、分析蛋白質(zhì)的常用方法，在科研工作中，經(jīng)常需要從凝膠中回收蛋白質(zhì)，用于蛋白質(zhì)的測序和制備抗體1。在聚丙烯酰胺凝膠電泳中，凝膠的孔徑，蛋白質(zhì)的電荷、大小、性質(zhì)等因素共同決定了蛋白質(zhì)的電泳遷移率。但如果加入足夠量十二烷基硫酸鈉（SDS）和巰基乙醇，SDS就可以使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物帶上相同密度的負(fù)電荷，并可引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，使蛋白質(zhì)在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原的電荷和形狀的影響，而取決于相對分子量的大小，因此聚丙烯酰胺凝膠電泳可以用于測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳大多在不連續(xù)系統(tǒng)中進(jìn)

5、行，其電泳槽緩沖液的pH與離子強(qiáng)度不同于配膠緩沖液。該凝膠包括濃縮膠和分離膠兩部分。當(dāng)兩電極間接通電流后，凝膠中形成移動界面，并帶動加入凝膠的樣品的SDS多肽復(fù)合物向前推進(jìn)。樣品通過高度多孔性的濃縮膠后，復(fù)合物在分離膠表面聚集成一條很薄的區(qū)帶（或稱積層）。由于不連續(xù)緩沖系統(tǒng)具有把樣品中的復(fù)合物全部濃縮于極小體積的能力，從而大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝膠的分辨率，使蛋白依各自的大小得到分離。由于SDS和巰基乙醇的作用，蛋白質(zhì)完全變形和解聚，解離成亞甲基或單個肽鏈，因此測定的結(jié)果只是亞基或單條肽鏈的分子質(zhì)量。1 實(shí)驗(yàn)部分1.1 試劑與儀器（1）試劑 正丁醇、丙酮（置-20冰箱保存）。 1mol/L

6、乙酸（CH3COOH）,1mol/L NaOH，硫酸銨，對硝基苯磷酸二鈉，二乙醇胺，鹽酸。 平衡緩沖液：0.01mol/L Tris-HCl，pH8.0，含1.0×10-3mol/L MgCl2和1.0×10-5mol/L ZnCl2。 底物緩沖液：1mol/L二乙醇胺-鹽酸緩沖液(pH9.8)，含1.0×10-3mol/L MgCl2。 酶的底物溶液：用底物緩沖液配制15×10-3mol/L對硝基苯磷酸二鈉溶液。 考馬斯亮藍(lán)G-250溶液。 30%丙烯酰胺。 分離膠緩沖液（1.5mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.8)，已加入10% SDS）、

7、濃縮膠緩沖液（0.5mol/L Tris-HCl緩沖液(pH6.8)，已加入10% SDS） 10%過硫酸銨（AP）、TEMED（四甲基乙二胺） 上樣緩沖液（稱100mg SDS，2mg溴酚藍(lán)，2g甘油，加0.1mL巰基乙醇，2ml 0.05mol/L pH8.0 Tris-HCl，加超純水定容至10mL）、染色液(配制含0.1%考馬斯亮藍(lán)R250，體積分?jǐn)?shù)40%甲醇，體積分?jǐn)?shù)10%冰醋酸的染色液500mL，過濾后備用)、脫色液（500mL體積分?jǐn)?shù)10%甲醇和體積分?jǐn)?shù)10%冰醋酸的脫色液1000mL）、電泳緩沖液（含0.1% SDS，0.05mol/L Tris，0.384mol/L甘氨酸pH

8、8.3）。（2）儀器及耗材 離心管，剪刀，載玻片，冰凍離心機(jī)，濾布，量筒，燒杯，移液槍，試管，制膠板，染色缸，所需儀器見下表。使用儀器生產(chǎn)廠家DYY-2C型電泳儀北京市六一儀器廠JYL-350A料理機(jī)九陽股份有限公司W(wǎng)D-9405A型脫色搖床沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司電熱恒溫水浴鍋HWS-12上海一恒科技有限公司UV762紫外可見分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司電子天平北京醫(yī)用天平廠 1.2 實(shí)驗(yàn)過程（一）小牛腸堿性磷酸酶的提取與酶活測定 (1) 酶的分離 取新鮮小牛腸，用剪刀縱向剖開，用載玻片將腸黏膜刮下，加入勻漿機(jī)中高速勻漿15s，重復(fù)二十次。 用量筒量體積后放入燒杯中，加入1.5體積的蒸餾水

9、，搖勻。 緩緩加入1倍體積的冰冷正丁醇，搖勻，將勻漿倒入離心管中，配平，4、10000r/min離心15min。 取下層水相，用濾布過濾除雜質(zhì)，把清液倒入分液漏斗靜置取下層清液，然后用1mol/L HAc調(diào)pH到4.9，4下10000r/min離心10min。 取上清（12.9mL），用1mol/L NaOH調(diào)pH至6.5，加入5%的硫酸銨0.6455g，搖勻至溶解后，再加入0.47倍體積（6.1mL）的冰冷丙酮，混勻，4放置41min。 4、10000r/min離心10min，除去沉淀，向上清液（18.5mL）中加入1.07倍體積（19.8mL）的冰冷丙酮，4放置31min。 4、10000

10、r/min離心10min，保留沉淀，逐漸加入平衡緩沖液，使沉淀剛好完全溶。（2）酶活力的測定 取150µL酶的底物溶液，置于37水浴中10min； 用平衡緩沖溶液將酶液稀釋10倍（10µL酶溶液稀釋至100µL）； 取兩個2mL（0.5光程）比色皿，各加入1.5mL底物緩沖液，放入分光光度計(jì)中校對歸零； 取出其中一個加入20µL稀釋后的酶液，迅速搖勻，放回分光光度計(jì)中，測定酶動力學(xué)曲線，讀出吸光值的變化率。（二）考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量 玻璃試管中加入5ml考馬斯亮藍(lán)。 在1.5ml離心管中，取實(shí)驗(yàn)一（1）中的酶液10µL分別稀釋25、50、

11、100倍。 各取100µl加入到5ml考馬斯亮藍(lán)試管中，混勻，反應(yīng)5min以上（觀察溶液至淺藍(lán)色）。 紫外分光光度計(jì)檢測條件：595nm波長； 取2個比色皿（1cm光程），加入考馬斯亮藍(lán)（比色皿的2/3），分光光度計(jì)中校對歸零。將樣品放入外側(cè)比色皿中，讀取吸光值（0.1-0.5之間）。根據(jù)蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。（三）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量 （1）裝板：將垂直板型電泳的玻璃片洗凈、晾干；放好膠條，用夾子夾好玻璃板，上面插上梳子，垂直放置在水平臺面上備用。（2）制備分離膠：在小燒杯中按下表配制所需濃度的分離膠。 分離膠配制試劑用量水4.1mL30%丙

12、烯酰胺3.4mL1.5mol/L Tris-HCl緩沖液pH8.82.4mL10%過硫酸銨100µLTEMED10µL 最后加入TEMED,應(yīng)快速搖勻分離膠，向玻璃板間隙，沿著長玻璃板的內(nèi)側(cè)緩緩注膠，然后再用移液槍貼壁慢慢移動注入乙醇200µL，以防止氧氣進(jìn)入膠內(nèi)。15min后，分離膠和乙醇之間出現(xiàn)分界線，表明分離膠凝固，倒出乙醇。 （3）制備濃縮膠：在小燒杯中按下表配制所需濃度的濃縮膠。 濃縮膠配制試劑用量水3.4mL30%丙烯酰胺1.0mL0.5mol/L Tris-HCl緩沖液pH6.81.5mL10%過硫酸銨60µLTEMED8µL 一

13、旦加入TEMED，應(yīng)快速搖勻濃縮膠，在已凝固的分離膠層上加濃縮膠，立即將梳子插入膠液頂部，避免進(jìn)入氣泡，放置待濃縮膠凝固。 （4）蛋白樣品處理：在1.5mL離心管中按1:1體積比加入樣品和上樣緩沖液，100加熱3min使蛋白質(zhì)變性。 （5）27min后，濃縮膠聚合完全，去掉夾子和膠條，拔去梳子，把凝膠玻璃板固定于電泳裝置內(nèi)槽上，加入電泳緩沖液，緩沖液高過玻璃板凹面。 （6）用移液槍在泳道加樣（1-4道為SW混合樣品，7-10道為SB混合樣品，5道為標(biāo)準(zhǔn)樣）。 （7）電泳：連接正負(fù)極，打開電源，開始時，電流控制在40A，樣品進(jìn)入分離膠后，緩慢升高電壓至140V。保持電流強(qiáng)度不變，2.35h后溴酚

14、藍(lán)指示劑遷移至下沿處，停止電泳。 （8）剝膠染色：電泳結(jié)束后，取出凝膠玻璃板，用金屬片從玻璃兩側(cè)輕輕撬開，使板內(nèi)進(jìn)入空氣，同時用水沖洗，取出凝膠板。將剝離下來的凝膠用水漂洗，轉(zhuǎn)入染色缸中，加染色液，置搖床染色15min。 （9）脫色：染色完畢，回收染色液，用水漂洗，加入脫色液，置搖床脫色，30min換一次脫色液，脫色至背景清晰。 （10）觀察測定蛋白質(zhì)遷移率以及條帶，對比標(biāo)準(zhǔn)樣品，分析蛋白質(zhì)的純度和分子量。2 結(jié)果與討論2.1 考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量 根據(jù)考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,如下圖可得吸光度與蛋白質(zhì)溶液濃度的關(guān)系函數(shù)為 y=0.697x-0.007，實(shí)驗(yàn)所測的蛋白質(zhì)溶液稀釋2

15、5倍，50倍，100倍時，其吸光度分別為0.5330，0.3199，0.1526，代入方程計(jì)算并乘于稀釋倍數(shù)得到各蛋白質(zhì)濃度分為50倍：21.50mg/mL，100倍：21.00mg/mL。求平均值可得原蛋白溶液的濃度為21.25mg/mL。2.2 小牛腸堿性磷酸酶酶活計(jì)算 公式：酶活力（u/mg）=根據(jù)酶動力學(xué)曲線，如下圖估算得曲線的斜率A/min為1.1062。VR =1.5mL，D=10，E405=18.3L/（mol×cm），VE=0.020mL，C=21.25mg/mL，L=0.5cm。帶入上述公式求得：酶比活力（u/mg）=4.267u/mg。圖 Error! Main

16、Document Only.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量圖 Error! Main Document Only.圖 Error! Main Document Only.從圖1中可以看出，mark中出現(xiàn)四條蛋白質(zhì)標(biāo)記線，對照標(biāo)準(zhǔn)樣品在該系統(tǒng)電泳中所作出的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）及各低分子量蛋白的組成（圖2），根據(jù)其間距及參考給出的mark泳道各蛋白質(zhì)標(biāo)記線間距，可判定mark泳道中四條線從上到下分別是兔磷酸化酶B，牛血清白蛋白，兔肌動蛋白和牛碳酸酐酶。其中樣品蛋白質(zhì)標(biāo)記線與牛血清蛋白遷移率基本相同，所以待測蛋白相對分子質(zhì)量大致為為66200g/mol。參考文獻(xiàn)1 Ausube

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18、學(xué)工業(yè)出版社，2010-08-016包永明，生物工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊M.化學(xué)工業(yè)出版社.2005 7 孫士青,王少杰,李秋順,李雪梅,史建國. 考馬斯亮藍(lán)法快速測定乳品中蛋白質(zhì)含量J. 山東科學(xué),2011,06:53-55. 8修志龍主編. 生物化學(xué). 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008.5.Extraction of the Calf Intestinal Alkaline Phosphatase and Determination of its ActivityDetermination of the Protein Content by Using Coomassie Brilliant Blue MethodDetermination of the Protein Molecular Weight by Using SDS-PAGE Eletrophoresis MethodCong Yang, Wu Ye, Wang Hedun, Lv BaiyaoFaculty of Chemical, Environmental and Biological Science and Technology,