分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)-第四次

1、實(shí)驗(yàn)四 質(zhì)粒DNA的限制性酶切一、背景知識(shí)酶切是基因操作的基本工具之一，在基因水平的改造過程中有重要的意義。正確選擇及恰當(dāng)使用內(nèi)切酶，將為基因改造提供便利的途徑。酶單位：一個(gè)單位限制性內(nèi)切酶是指在最合適條件下，在50 l體積1小時(shí)內(nèi)完全切開1 g 噬菌體DNA所需的酶量。一般來說，限制性內(nèi)切酶需在-20下保存。二、實(shí)驗(yàn)原理限制性內(nèi)切酶可特異地結(jié)合于一段被稱為限制酶識(shí)別序列的DNA序列位點(diǎn)上，并在此切割雙鏈DNA。絕大多數(shù)限制性內(nèi)切酶識(shí)別長(zhǎng)度為6個(gè)核苷酸，不同的酶具有不同的切割位點(diǎn)。一些酶切割DNA雙鏈產(chǎn)生平端的DNA片段，另一些酶則切割產(chǎn)生帶有單鏈突出末端（即粘性末端）的DNA片段。限制酶在一

2、些特定條件下使用時(shí)，對(duì)于底物DNA的特異性可能降低。即可以把與原來識(shí)別的特定的DNA序列不同的堿基序列切斷，這個(gè)現(xiàn)象叫Star活性。Star活性出現(xiàn)的頻率，根據(jù)酶、底物DNA、反應(yīng)條件的不同而不同，可以說幾乎所有的限制酶都具有Star活性。為防止Star活性的產(chǎn)生，請(qǐng)將反應(yīng)體系中的甘油含量，盡量控制在10%以下。不同酶切反應(yīng)都需要不同的酶切緩沖液。多數(shù)生物技術(shù)公司的產(chǎn)品目錄中均有關(guān)于何種限制性內(nèi)切酶適合何種緩沖液的資料可供查閱。絕大多數(shù)酶的反應(yīng)溫度是在37 。酶切反應(yīng)時(shí)間有30 分鐘、60 分鐘，以至2 小時(shí)以上甚至過夜。使用兩種酶同時(shí)進(jìn)行DNA切斷反應(yīng) (Double Digestion)，

3、是實(shí)驗(yàn)操作中常用的手段之一。為了節(jié)省反應(yīng)時(shí)間，通常希望在同一反應(yīng)體系內(nèi)進(jìn)行。此時(shí)，Buffer的選用就非常重要了。多數(shù)生物技術(shù)公司的產(chǎn)品目錄中均會(huì)提供雙酶切時(shí)通用緩沖液查詢表。 本次實(shí)驗(yàn)要進(jìn)行的是對(duì)重組質(zhì)粒分別進(jìn)行單酶切和雙酶切，從而驗(yàn)證質(zhì)粒的正確性。限制酶切反應(yīng)后進(jìn)行電泳時(shí)，有時(shí)會(huì)發(fā)生電泳帶無法確認(rèn)、電泳帶擴(kuò)散、電泳帶移動(dòng)距離異常等問題，這是由于酶蛋白自身或其它雜蛋白與DNA結(jié)合在一起，使DNA沒有進(jìn)入電泳凝膠中，或DNA難以被溴乙錠染色而造成的。發(fā)生這些現(xiàn)象時(shí)，在試樣中加入一些蛋白質(zhì)變性劑 (如SDS，終濃度0.1 %左右)，便可改善電泳效果。實(shí)驗(yàn)中使用的10 × lo

4、ading buffer就含有SDS成分。三、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆彰盖械脑砑跋嚓P(guān)概念，熟悉酶切的基本方法和流程。四、主要材料、試劑與儀器1、儀器：臺(tái)式離心機(jī)、恒溫水浴鍋、電泳儀及電泳槽、凝膠成像儀2、器皿及材料：質(zhì)粒DNA (實(shí)驗(yàn)三中獲得)移液器、1.5ml離心管、吸頭、量筒、三角瓶3、試劑：限制性內(nèi)切酶 (Bgl II、Hind III、XhoI)、ddH2O、10 × loading buffer、50 × TAE、蒸餾水五、操作步驟1、在1.5 ml 離心管管中依次加入以下相應(yīng)試劑(20l反應(yīng)體系)：?jiǎn)蚊盖衐dH2O13.7 l10×buffer 2 l質(zhì)粒DNA 4 l 酶 0.3 l 或雙酶切ddH2O13.7 l10×buffer 2 l質(zhì)粒DNA 4 l 酶1 0.3 l 酶2 0.3 l 其中限制性內(nèi)切酶最后加入，輕輕混勻，稍加離心。2、37 ，水浴1 h。3、電泳檢測(cè)：1.2 %的瓊脂糖凝膠電泳。取質(zhì)粒酶切產(chǎn)物15 l ，加適當(dāng)lodging buffer混勻上樣，以未經(jīng)酶切的質(zhì)粒做對(duì)照。每組有一個(gè)泳道點(diǎn)加5 l DNA ladder 。采用5 V/ cm的電壓，使DNA分子從負(fù)極向正極移動(dòng)，至合適位置取出并在E