分子生物學(xué)電子教案第十章

1、第十章 原核生物基因表達(dá)調(diào)控1課程教學(xué)內(nèi)容 (1) 原核生物基因表達(dá)調(diào)控的概述 (2) 乳糖操縱子 (3) 色氨酸操縱子的負(fù)調(diào)控 (4) 阿拉伯糖的操縱子 (5) 正調(diào)控系統(tǒng)和負(fù)調(diào)控系統(tǒng) 2課程重點(diǎn)、難點(diǎn) 原核生物基因表達(dá)調(diào)控的一般機(jī)制、乳糖操縱子、色氨酸操縱子的負(fù)調(diào)控。 3課程教學(xué)要求 （1）掌握原核生物表達(dá)調(diào)控的特點(diǎn)、方式和意義及相關(guān)概念； （2）掌握和理解乳糖操縱子和色氨酸操縱子的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理； （3）了解其它調(diào)控方式。   原核生物細(xì)胞的基因和蛋白質(zhì)種類較少。如大腸桿菌基因組約為4.6×106bp，假如每個基因長1000bp，一個細(xì)菌就有4000個左右的

2、基因能合成4000種左右的蛋白質(zhì)，據(jù)估計(jì)一個細(xì)胞中總共含有107個蛋白質(zhì)分子，如果每個基因等同翻譯的話，任何一個多肽應(yīng)有2500個拷貝，但是這些蛋白質(zhì)并不是以相同拷貝存在于每個細(xì)胞中，有些蛋白質(zhì)數(shù)目相當(dāng)固定，另一些變化很大。例如，每個大腸桿菌細(xì)胞可以有約15000個核糖體，與其結(jié)合的約50種核糖體蛋白數(shù)量是十分恒定的，糖酵解體系的酶含量很大，其數(shù)目也極恒定，此外，如DNA聚合酶、RNA聚合酶等都是代謝過程中十分必需的酶或蛋白質(zhì)，其合成速率不受環(huán)境變化或代謝狀態(tài)的影響，這一類蛋白質(zhì)的合成稱為永久型，另一類型則稱為適應(yīng)型或調(diào)節(jié)型 ，這類蛋白質(zhì)的合成速率明顯地受環(huán)境的影響而改變。例如，一般情況下，一

3、個大腸桿菌細(xì)胞中只有1-5個分子的-半乳糖苷酶，但若將細(xì)胞培養(yǎng)在只含有乳糖的培養(yǎng)基中，每細(xì)胞中這個酶的量可高達(dá)幾萬分子，其他糖代謝的酶、氨基酸、核苷酸合成系統(tǒng)的酶類，其合成速度和總量都隨培養(yǎng)條件的變化而改變。細(xì)菌中所利用的大多數(shù)基本調(diào)控機(jī)制執(zhí)行下列規(guī)則，一個體系在需要時(shí)被打開，不需要時(shí)被關(guān)閉，這種“開-關(guān)”活性是通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄來建立的，也就是說mRNA的合成是可以被調(diào)節(jié)的。實(shí)際上，當(dāng)我們說一個系統(tǒng)處于“off”狀態(tài)時(shí)，也有本底水平的基因表達(dá)，常常是每世代每個細(xì)胞只合成1或2個mRNA分子，因而合成少量蛋白質(zhì)分子，為了方便，我們通常用“off”這一術(shù)語，但必須明白所謂“關(guān)”實(shí)際意思是基因表達(dá)是特別

4、低，很難甚至無法檢測。所有生物的遺傳信息，都是以基因的形式儲藏在細(xì)胞內(nèi)的DNA分子中。隨著個體的發(fā)育，DNA分子能有序地將其所承載的遺傳信息通過密碼子反密碼子實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍踪|(zhì)分子，執(zhí)行各種生理生化功能完成生命的全過程?？茖W(xué)家把這個DNA到蛋白質(zhì)的過程稱為基因表達(dá)，對這個過程的控制稱為基因表達(dá)調(diào)控時(shí)間和空間概念，掌握了基因表達(dá)調(diào)控的秘密，我們手中就有了一把揭示生物學(xué)奧妙的金鑰匙。基因表調(diào)控主要表現(xiàn)在以下幾個方面（1）轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控（2）mRNA加工成熟水平上的調(diào)控（3）翻譯水平上的調(diào)控基因調(diào)控的指揮系統(tǒng)也是多樣的，不同的生物使用不同的信號來指揮基因調(diào)控。原核生物中，營養(yǎng)狀況和環(huán)境因素對基因表

5、達(dá)起著舉足輕重的影響。在真核生物尤其是高等真核生物中激素水平和發(fā)育階段是基因表達(dá)調(diào)控的最得要手段，營養(yǎng)和環(huán)境因素的影響力大為下降。一、        原核基因調(diào)控總論 基因表達(dá)的第一步是遺傳信息從DNA分子轉(zhuǎn)移到RNA分子的轉(zhuǎn)錄過程，這種RNA分子中一條反義鏈為模板，在依賴于DNA的RNA聚合酶的催化作用下進(jìn)行的一種聚合反應(yīng)，轉(zhuǎn)錄的可靠性是一個十分復(fù)雜的問題，它包括以下幾個方面（1）       如何在復(fù)雜的核基因組內(nèi)確定正確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)？（2） 

6、60;     如何將核苷酸按照密碼子序列插入新生的RNA鏈中？（3）       如何使RNA聚合反應(yīng)進(jìn)行到底即如何保證合成完整的RNA？（4）       如何確定轉(zhuǎn)錄的終止？這種在轉(zhuǎn)錄水平上對基因表達(dá)的調(diào)控決定于DNA的結(jié)構(gòu)、RNA聚合酶的功能、蛋白因子及其他小分子配基的相互作用。在研究轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄調(diào)控以前，我們先來分析一下原核與真核生物轉(zhuǎn)錄與翻譯的特點(diǎn)：因?yàn)榧?xì)菌mRNA在形成過程中與核糖體混合在一起，所以細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄與翻譯過程幾乎發(fā)

7、生在同一個時(shí)間間隔內(nèi)，轉(zhuǎn)錄與翻譯相偶聯(lián)；真核生物中，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物只有從核內(nèi)運(yùn)到核外，才能被核糖體翻譯成蛋白質(zhì)。（圖解） （一）轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的類型 根據(jù)某一體系代謝活性調(diào)節(jié)的類型，轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)可分為如下幾種方式：（1）代謝產(chǎn)物對基因活性的調(diào)節(jié)；（2）弱化因子對基因活性的影響；（3）降解物對基因活性的調(diào)節(jié)；（4）細(xì)菌的應(yīng)急反應(yīng)。1、 代謝產(chǎn)物對基因活性的調(diào)節(jié) 在降解代謝途徑中，起始端的酶（一般指催化第一步反應(yīng)的酶）的底物濃度往往決定是否合成這一途徑中的其他各種酶。相反，在合成代謝中，最終產(chǎn)物則往往是調(diào)節(jié)物質(zhì)。在單順反子mRNA翻譯出蛋白質(zhì)的體系中，該蛋白質(zhì)可以充當(dāng)自我調(diào)節(jié)的角色，其濃度決定了

8、啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，每一調(diào)節(jié)類型的分子機(jī)理相差甚遠(yuǎn)。但一般可以分為負(fù)調(diào)節(jié)與正調(diào)節(jié)兩種情況。在負(fù)調(diào)節(jié)體系中，細(xì)胞中存在著抑制物，它使轉(zhuǎn)錄處于關(guān)閉狀態(tài)，抗抑制物通常稱為誘導(dǎo)物，在轉(zhuǎn)錄的開啟中發(fā)揮重要作用。在正調(diào)節(jié)體系中，一個效應(yīng)物分子激活啟動子，而抑制物也在正調(diào)節(jié)中起作用，正負(fù)調(diào)節(jié)之間并不相互排斥，有些系統(tǒng)中既有正調(diào)節(jié)，也有負(fù)調(diào)節(jié)，因而需要兩種調(diào)節(jié)物。調(diào)節(jié)類型及其特點(diǎn)調(diào)節(jié)物結(jié)合到DNA上正調(diào)節(jié)負(fù)調(diào)節(jié)是開啟關(guān)閉否關(guān)閉開啟通過特殊代謝物調(diào)節(jié)的基因活性主要有可誘導(dǎo)和可阻遇兩大類：（1）可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)：是指一些基因在特殊的代謝物或化合物的作用下，由原來關(guān)閉的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣ぷ鳡顟B(tài)，即在某些物質(zhì)的誘導(dǎo)下使基因活化。這

9、類基因中最突出的例子是大腸桿菌的乳核操縱子。大腸桿菌在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中可以長得很好，在只含乳糖的培養(yǎng)基中，開始時(shí)生長不好，直到合成了利用乳糖的一系列酶，具備了利用乳糖作為碳源的能力，才能在這一培養(yǎng)基中生存下來，細(xì)菌獲得這一能力的原因就是因?yàn)樵谡T導(dǎo)物乳糖的誘導(dǎo)作用下，開動了乳糖操縱子，表達(dá)它編碼的3個酶：半乳糖苷酶（使乳糖水解為半乳糖和葡萄糖）；半乳糖苷透過酶（使乳糖進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)）；半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶（使半乳糖第6位碳原子乙?；?。這個操縱子開動的效果是十分明顯的，以半乳糖苷酶為例在葡萄糖培養(yǎng)基中生長時(shí)，每個細(xì)胞只有幾個酶分子，但若轉(zhuǎn)移到乳糖培養(yǎng)基中，幾分鐘后，每個細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)可產(chǎn)生300

10、0個酶分子，這一類基因稱為可誘導(dǎo)基因，這類酶稱為誘導(dǎo)酶，這種生化過程稱為酶的誘導(dǎo)過程。（2）可阻遏調(diào)節(jié)：這類基因平時(shí)都是開啟的，處在產(chǎn)生蛋白質(zhì)或酶的工作過程中，但由于一些特殊代謝物或化合物的積累將其關(guān)閉，阻遏了基因的表達(dá)，所以稱為可阻遏基因。如大腸桿菌色氨酸的合成，色氨酸為生活中必需的氨基酸，所以它的操縱子是一直開啟著的。當(dāng)細(xì)菌的培養(yǎng)基中加入色氨酸，于是細(xì)菌完全可以利用培養(yǎng)基中現(xiàn)成的色氨酸來維持，無需化力氣來合成。這種基因稱為阻遏基因，這些酶稱為可阻遏酶，這個現(xiàn)象稱為可阻遏現(xiàn)象，這些起阻遏作用的小分子稱為抑制物。一般規(guī)律：（1）可誘導(dǎo)的操縱子是一些編碼糖和氨基酸水解代謝蛋白的基因，這些糖和氨基

11、酸平時(shí)含量很少，因此，細(xì)菌總是利用更一般的能源物質(zhì)葡萄糖的水解來提供能量，所以這些操縱子常常是關(guān)閉的，但當(dāng)生存條件發(fā)生變化，如葡萄糖缺乏而必須利用乳糖作為能源時(shí)，就要打開這些基因；（2）可阻遏基因情況恰好相反，它們是一些合成各種細(xì)胞代謝過程中所必需的小分子物質(zhì)的基因，由于這些小分子物質(zhì)在生命過程中的重要地位，這些基因總是打開著的，當(dāng)這些小分子在細(xì)菌生活環(huán)境中含量較高時(shí)，就關(guān)閉這些基因，停止其合成。2、 弱化因子對基因活性的影響 屬這種調(diào)節(jié)方式的有大腸桿菌中的色氨酸操縱子、苯丙氨酸操縱子、蘇氨酸操縱子、異亮氨酸操縱子和纈氨酸操縱子，以及沙門氏菌的組氨酸操縱子和亮氨酸操縱子、嘧啶合成操縱

12、子等。在這種調(diào)節(jié)方式中，起信號作用的是有特殊負(fù)載的氨基酰tRNA的濃度，如色氨酸操縱子中是色氨酰tRNA濃度，當(dāng)操縱子被阻遏，RNA合成被終止時(shí)，起終止轉(zhuǎn)錄信號作用的那一段核苷酸稱為弱化子，這種因?yàn)楹颂求w在基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的不同位置，決定了RNA可以形成哪一種形式的二級結(jié)構(gòu)，并由此決定基因能否繼續(xù)轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)方式確定是異常巧妙的，起調(diào)節(jié)作用的信號分子是細(xì)胞中某一氨基酸或嘧啶濃度只要稍加變動就可影響整個體系的功能。3、 降解物對基因活性的調(diào)節(jié) 操縱子學(xué)說的核心是使基因從表達(dá)抑制狀態(tài)中解脫出來進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，是從負(fù)調(diào)節(jié)的角度來考慮基因表達(dá)調(diào)控的，那么有沒有從相反的角度進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而提高基因的轉(zhuǎn)錄水平

13、，使它由原來的低水平表達(dá)變成高水平表達(dá)的呢？這就是降解物抑制作用的調(diào)節(jié)。有葡萄糖存在的情況下，即使在細(xì)菌培養(yǎng)基中加入乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或麥芽糖等誘導(dǎo)物，與其相對應(yīng)的操縱子也不會啟動，產(chǎn)生通過代謝這些糖的酶來，這種現(xiàn)象稱為葡萄糖效應(yīng)或稱為降解物抑制作用的調(diào)節(jié)。添加葡萄糖后，細(xì)菌所需要的能量便可從葡萄糖得到滿足，葡萄糖是最方便能源，細(xì)菌無需開動一些不常用的基因去利用這些稀有的糖類。由于葡萄糖的存在會抑制細(xì)菌的腺苷酸環(huán)化酶，減少環(huán)腺苷酸（cAMP）的合成，與它結(jié)合的蛋白質(zhì)（cAMP受體蛋白）因找不到配體而不能形成復(fù)合物，這個復(fù)合物是一個正調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以與操縱子上的啟動區(qū)結(jié)合，起動基因轉(zhuǎn)錄，所以有

14、葡萄糖存在時(shí)，不易形成復(fù)合物cAMPCRP形成復(fù)合物并與啟動子結(jié)合，促進(jìn)乳糖操縱子的表達(dá)，降解物抑制作用是通過促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄來正調(diào)節(jié)基因表達(dá)的，這是一種積極的調(diào)節(jié)方式。4、 細(xì)菌的應(yīng)急反應(yīng) 上面講述的是細(xì)菌處于正常生活條件下的基因表達(dá)調(diào)節(jié)方式，所謂“正?！币舶ㄉ瞽h(huán)境中缺少某一種或兩種能源，但能找到其他代用物。可是細(xì)菌有時(shí)會碰到萬分緊急的狀況，比如氨基酸饑餓時(shí)，就不是缺少一、二個氨基酸，而是氨基酸的全面匱乏，為了緊縮開支，渡過難關(guān)，細(xì)菌將會產(chǎn)生一個應(yīng)急反應(yīng)，包括生產(chǎn)各種RNA，糖脂肪和蛋白質(zhì)在內(nèi)的幾乎全部生物化學(xué)反應(yīng)過程均被停止，實(shí)施這一應(yīng)急反應(yīng)的信號是鳥苷四磷酸（pppGpp）和鳥

15、苷五磷酸（pppGpp）。產(chǎn)生這兩種物質(zhì)的誘導(dǎo)物是空載tRNA。當(dāng)氨基酸饑餓時(shí)，細(xì)胞中便存在大量的不帶氨基酸的tRNA，這種空載的tRNA會激活焦磷酸轉(zhuǎn)移酶，使pppGpp大量合成，其濃度可增加10倍以上。ppGpp的出現(xiàn)會出現(xiàn)關(guān)閉許多基因，當(dāng)然也會打開一些合成氨基酸的基因，以應(yīng)付這種緊急狀況，關(guān)于PPGpp的作用原理還不太清楚。據(jù)認(rèn)為RNA聚合酶有不同的構(gòu)型，這些構(gòu)象可以識別不同的啟動子區(qū)，ppGpp與RNA聚合酶結(jié)合會使它的某些構(gòu)象穩(wěn)定下來，從而改變了基因轉(zhuǎn)錄的效率，或關(guān)閉，或減弱，或增加；也有人認(rèn)為，基因的轉(zhuǎn)錄起始附近有一些保守序列，它們可能是ppGpp或有關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)這些信

16、點(diǎn)上的啟動子與ppGpp結(jié)合后，就使它們不再與RNA聚合酶結(jié)合，基因被關(guān)閉，與的作用范圍十分廣泛，它不是只影響一個或幾個操縱子，而是影響一大批，所以它們是超級調(diào)控因子。（二）環(huán)腺苷酸受體蛋白對轉(zhuǎn)錄的調(diào)控 環(huán)腺苷酸（CAMP）受體蛋白（CRP）并稱分解代謝激活蛋白（CAP），當(dāng)大腸桿菌生長在缺乏葡萄糖的培養(yǎng)基中，CAMP合成量增加，與CRP結(jié)合后所形成的復(fù)合物具有激活半乳糖（gal）、麥芽糖、乳糖（lac）等啟動子的功能，它是由兩個相同亞基組成的二聚體，每個亞基含有210個氨基酸殘基，分為兩個結(jié)構(gòu)域，氨基末端結(jié)構(gòu)域與CAMP結(jié)合，羧基末端結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合，cAMP的結(jié)合能提高CRP對雙鏈DNA

17、的親和力，CRP與啟動子結(jié)合是激活轉(zhuǎn)錄的必需條件。根據(jù)17個能與CRP結(jié)合只啟動子序列進(jìn)行分析的結(jié)果表明，存在以5TGTGANNTNNNCANAT 3為特征的共同序列，其中TGTGA保守性最強(qiáng)。 一些依賴于CRP的啟動子缺乏一般啟動子所具有的典型的-35區(qū)序列特征，因此，大腸桿菌RNA聚合酶難以與其結(jié)合，CRP的存在能顯著提高酶與啟動子的結(jié)合常數(shù)，有研究證明，CRP與 Lac啟動子的最強(qiáng)結(jié)合區(qū)域達(dá)到2830bp，結(jié)合后能使DNA做90180的彎曲，為酶分子提供結(jié)合部位，另一方面，酶的存在又提高了CAMPCRP與lac和gal啟動子的親和力，在cAMP存在的條件下，酶能與CRP共沉淀，這些事實(shí)說

18、明，酶與CRP可以發(fā)生相互作用，由此推想，CRP通過改變啟動子構(gòu)象以及與酶的相互作用幫助酶分子正確定向以便與-10區(qū)結(jié)合實(shí)際，起到了取代-35區(qū)功能的作用。 CRP還能抑制RNA聚合酶與DNA中其他位點(diǎn)的結(jié)合，從而提高與某一特定啟動子結(jié)合概率。 二、 乳糖操縱子 操縱子學(xué)說是，關(guān)于原核生物基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)調(diào)控的學(xué)說，它是由法國巴斯德研究所著名科學(xué)家Jacob和Monod在1961年首先提出，并在10年內(nèi)經(jīng)許多科學(xué)家的補(bǔ)充和修正得以逐步完善。大腸桿菌乳糖操縱子（lectose operon）包括3個結(jié)構(gòu)基因：Z、Y和A，以及啟動子、控制子和阻遏子等，轉(zhuǎn)錄時(shí)RNA聚合酶首先與啟動區(qū)（P）結(jié)合，通過

19、操縱區(qū)（O）向右轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄從O區(qū)的中間開始，按ZYA，每次轉(zhuǎn)錄出來的一條mRNA上都帶有這3個基因，轉(zhuǎn)錄的調(diào)控是在啟動區(qū)和操縱區(qū)進(jìn)行的。（圖解）3個結(jié)構(gòu)基因各決定一種酶：Z編碼-半乳糖苷酶；Y編碼-半乳糖苷透過酶； A編碼-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶。-半乳糖苷酶是一種-半乳糖苷鍵的專一性酶，除能將乳糖果水解成葡萄糖和半乳糖外，還能水解其他-半乳糖苷，-半乳糖苷透過酶的作用是使外界的-半乳糖苷（如乳糖）能透過大腸桿菌細(xì)胞壁和原生質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，所以大腸桿菌如半乳糖為碳源和能源的話，以上兩酶是必需的。-半乳糖苷乙酰基轉(zhuǎn)移酶的作用是把乙酰輔酶A上的乙?；D(zhuǎn)移到半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖，它在乳糖的利用中

20、并非必須。（一）酶的誘導(dǎo)Lac體系受調(diào)控的證據(jù) 1、 Lac基因的誘導(dǎo)表達(dá) 乳糖代謝體系的開啟和關(guān)閉的過程如下：（1）在不含乳糖及-乳糖的培養(yǎng)基中，Lac+基因型大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)-半乳糖苷酶和透過酶的濃度很低，每個細(xì)胞內(nèi)大約只有1-2個酶分子，但是，如果在培養(yǎng)基中加入乳糖，酶的濃度很快達(dá)到細(xì)胞總蛋白量的6%或7%，每個細(xì)胞中可有超過105個酶分子。（2）有乳糖供應(yīng)時(shí)，在無葡萄糖培養(yǎng)基中生長的Lac+細(xì)菌，-半乳糖苷酶和透過酶將同時(shí)合成，進(jìn)一步用32P標(biāo)記的mRNA與模板DNA進(jìn)行定量分子雜交，表明培養(yǎng)基中加入乳糖12min后，編碼-半乳糖苷酶和透過酶的LacmRNA量就明顯迅速增加，去

21、掉乳糖后，LacmRNA量立即下降到幾乎無法檢測，表明乳糖確定能激發(fā)LacmRNA的合成，科學(xué)家對于這個操縱子誘導(dǎo)作用的機(jī)理奠定了我們對代謝調(diào)節(jié)認(rèn)識的基石。實(shí)驗(yàn)室里通常使用含硫的乳糖類似物異丙基巰基半乳糖苷（IPTG）和巰甲基半乳糖苷（TMG），另外，在酶活性分析中通常用生色底物O-硝基半乳糖苷（ONPG）。研究發(fā)現(xiàn)，它們都是高效誘導(dǎo)物，因?yàn)檫@些都不是半乳糖苷酶的底物，所以又稱為安慰性誘導(dǎo)物。（3）為了證實(shí)誘導(dǎo)物的作用是誘導(dǎo)新酶合成，而不是將已存在于細(xì)胞中的酶前體轉(zhuǎn)化為有活性的酶，設(shè)計(jì)了同位素示誘實(shí)驗(yàn)，把大腸桿菌細(xì)胞放在加有放射性35S標(biāo)記的氨基酸但沒有任何半乳糖苷誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中，隨著培養(yǎng)基

22、中誘導(dǎo)物的加入，-半乳糖苷酶便開始合成，分離純化-半乳糖苷酶，發(fā)現(xiàn)這種酶無35S標(biāo)記，說明酶的合成不是由前體轉(zhuǎn)化而來的，而是加入誘導(dǎo)物后新合成的。2、 I型和O型的發(fā)現(xiàn)及其意義 已經(jīng)分離到一種在有誘導(dǎo)物或沒有誘導(dǎo)物的情況下都能產(chǎn)生LacmRNA的突變體，這種失去調(diào)節(jié)能力的突變體稱為永久型突變體，Jacob和Monod用這兩種突變體構(gòu)建了各種局部二倍體細(xì)胞，并將這些突變株歸納為兩類：I型和O型，為了和野生型相區(qū)別，兩類突變型分別以下列符號標(biāo)記：I型：野生型為I+，突變型為I；O型：野生型為O+，突變型為Oc。這樣的突變往往是多效性突變，因?yàn)镮+ I 或O+Oc后，Z、Y、A結(jié)構(gòu)基因均表

23、現(xiàn)為永久表達(dá)，所以I基因被稱為調(diào)節(jié)基因（regnlatory gene）。I 突變株的行為像大多數(shù)基因的隱性突變那樣，當(dāng)I+ 細(xì)胞停止LacmRNA的合成時(shí)，I突變體中仍然有LacmRNA合成，很顯然，I基因是一個產(chǎn)生抑制物的調(diào)節(jié)基因，其產(chǎn)物使體系關(guān)閉，I 突變體由于不能產(chǎn)生這種抑制物，細(xì)胞因此成為Lac永久型，在I+/ I 的局部二位體中有一個正常的I基因，Lac操縱子的表達(dá)仍然可能被抑制。Jocob和Monod稱I基因產(chǎn)物為Lac阻遏物，最初人們還不清楚Lac阻遏物究竟是一種蛋白質(zhì)還是一種由I基因轉(zhuǎn)錄形成的RNA分子，后來發(fā)現(xiàn)此基因有琥珀突變體，初步證明了是一種蛋白質(zhì)，1967年，人們首次

24、分離到了阻遏物，并使之純化。OC突變體的一個顯著特征是某些情況下表現(xiàn)出顯性，這些OC 突變體顯性特征的重要意義在某些二倍體中更加清楚，這兩種組合由于有功能正常Z基因而表現(xiàn)為Lac+。但OCZ/O+Z+，盡管有OC突變存在，-半乳糖苷酶的合成仍然是可誘導(dǎo)型的兩個組合的差異在于OC突變存與Z突變處于同一個DNA分子中，而7種OC與Z+在同一個DNA分子上，所以只有當(dāng)OC與Z+在同一個DNA分子上時(shí)，OC才能引起半乳糖苷酶的永久型合成。有一個重要的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了一個結(jié)論，檢測-半乳糖苷酶突變型的免疫系結(jié)果表明，在OCZ/O+Z+的局部二倍體中，有突變酶永久型合成，而只有加入誘導(dǎo)物之后，才能會合成野生型的

25、酶，關(guān)于OC突變位于I與Z之間 ，所以Lac體系的4個基因序列為IOZY，通過這些觀察，Jocob和Monod推斷OC突變代表DNA鏈上的一個位點(diǎn)或一個非編碼區(qū)域，而不是一個基因，因?yàn)榭删幋a的基因具有互補(bǔ)性，而OC沒有這一特性，O決定相鄰Z基因產(chǎn)物是誘導(dǎo)型合成還是永久型合成，O區(qū)域稱為操縱基因。（二）操縱子模型 Jacob和Monod認(rèn)為誘導(dǎo)酶現(xiàn)象是個基因調(diào)控問題，而且可以用實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行研究，通過大量的實(shí)驗(yàn)，終于建立了操縱子的控制模型（圖解）。其要點(diǎn)為： （1）Z、Y、A基因的產(chǎn)物由同一條多順反子的mRNA分子所編碼； （2）這個mRNA分子的啟動子緊接著O區(qū)，而位于I與O之間的啟動子區(qū)（P）

26、，不能單獨(dú)起動合成-半乳糖苷酶和透性酶的生理過程。 （3）操縱基因是DNA上的一小段序列（僅為26bp），是阻遏物的結(jié)合位點(diǎn)； （4）當(dāng)阻遏物與操縱基因結(jié)合時(shí)，LacmRNA的轉(zhuǎn)錄起始受到抑制； （5）誘導(dǎo)物通過與阻遏物結(jié)合，改變它的三維構(gòu)象，使之不能與操縱基因結(jié)合，從而激發(fā)LacmRNA的合成，即有誘導(dǎo)物存在時(shí)，操縱基因區(qū)沒有被阻遏物占據(jù)，所以啟動子能移順利起始mRNA的合成。 這一簡單模型解釋了Lac體系及其他負(fù)調(diào)控系統(tǒng)的許多現(xiàn)象，但是在乳糖操縱子中同樣也存在著正調(diào)控。 1、 Lac操縱子的本底水平表達(dá) 有兩個矛盾是操縱子理論所不能解釋的，首先，誘導(dǎo)物需要穿過細(xì)胞膜才能與阻遏物結(jié)

27、合，而轉(zhuǎn)運(yùn)誘導(dǎo)物需要透過物，后者的合成又需要誘導(dǎo)，這樣必須解釋第一個誘導(dǎo)物是如何達(dá)到細(xì)胞內(nèi)的，只有兩種可能，或者一些誘導(dǎo)物可以在透過酶不存在時(shí)進(jìn)入細(xì)胞，或者一些透過酶可以在沒有誘導(dǎo)物的情下合成，后者的解釋是正確的。 其次，研究還發(fā)現(xiàn)乳糖，并不和阻遏物結(jié)合，真正的誘導(dǎo)物是乳糖的異構(gòu)體異構(gòu)乳糖，但是，異構(gòu)乳糖是在-半乳糖苷酶的催化下由乳糖形成的。因此，乳糖誘導(dǎo)-半乳糖苷酶的合成需要有-半乳糖苷酶的預(yù)先存在。這一現(xiàn)象的解釋是：在非誘導(dǎo)狀態(tài)下有少量的LacmRNA合成（大約每代有15個mRNA分子），這種合成稱之為本底水平的永久型合成。 2、 Lac+大腸桿菌對乳糖的反應(yīng) 假設(shè)細(xì)菌生長以甘油

28、為碳源的培養(yǎng)基中，按照Lac操縱子本底水平的表達(dá)，每個細(xì)胞可有幾個分子的-半乳糖苷酶和乳糖透過酶，加入乳糖在單個透過酶分子作用下，少量乳糖分子進(jìn)入細(xì)胞，又在單個-半乳糖苷酶分子的作用下轉(zhuǎn)變成異構(gòu)乳糖，某個異構(gòu)乳糖與操縱基因上的阻遏物結(jié)合，并使后者失活而離開基因，這樣mRNA的合成就開始了，這些mRNA分子編碼大量的-半乳糖苷酶及乳糖透過酶，其結(jié)果是乳糖涌入細(xì)胞，又在單個-半乳糖苷酶分子的作用下轉(zhuǎn)變成異構(gòu)乳糖，然后與細(xì)胞內(nèi)的阻遏物結(jié)合，阻遏物的失活促進(jìn)mRNA的高速合成，進(jìn)一步提高了透過酶和-半乳糖苷酶的濃度降解產(chǎn)生的葡萄糖被細(xì)胞用作碳源和能源，降解產(chǎn)生的半乳糖則被另一套酶體系轉(zhuǎn)變成葡萄糖，這些

29、酶的合成也是可誘導(dǎo)的，這個可誘導(dǎo)的體系就是半乳糖操縱子，半乳糖是它的誘導(dǎo)物。 3、 Lac阻遏物I基因產(chǎn)物及功能 一般通過與放射性標(biāo)記的IPTG相結(jié)合的方法分離和純化阻遏物，Lac阻遏蛋白有4個相同的亞基，每個亞基均含有347個氨基酸殘基，并能與1分子IPTG結(jié)合，未經(jīng)分級分離的細(xì)胞提取物的結(jié)合能力大約為每細(xì)胞結(jié)合2040個IPTG分子，因此推斷每個細(xì)胞中有510個阻遏物分子，進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)在某I突變體的細(xì)胞提取物中缺少阻遏物，從而證明了它與IPTG結(jié)合的分子確定是蛋白質(zhì)。 由于阻遏物含量極低，一般認(rèn)為每個細(xì)胞中這些蛋白質(zhì)分子是由12個被轉(zhuǎn)錄的阻遏物mRNA模板翻譯而來的。mRNA的

30、數(shù)量如此之少，因此很可能阻遏物的合成也受到調(diào)節(jié)，或者這種mRNA是從一個弱啟動子轉(zhuǎn)錄而來的?，F(xiàn)已表明，Lac操縱子阻遏物mRNA是一個弱啟動子控制下永久型合成的。 4、 葡萄糖對Lac操縱子的影響 -半乳糖苷酶在乳糖代謝中的作用是降解乳糖，形成葡萄糖及半乳糖，如果將葡萄糖及乳糖同時(shí)加入培養(yǎng)基中，大腸桿菌在耗盡外源葡萄糖之前，不會誘發(fā)Lac操縱子，當(dāng)有葡萄糖存在時(shí)，因?yàn)闆]有LacmRNA合成，所以也沒有-半乳糖苷酶產(chǎn)生。 葡糖對LacmRNA轉(zhuǎn)錄的抑制可能來自兩個方面：（1）葡萄糖阻止了誘導(dǎo)物引起的阻遏物失活效應(yīng)；（2）僅僅去掉阻遏物并不能啟動Lac基因表達(dá)，還有其他因素參與調(diào)控這一基

31、因表達(dá)。 葡萄糖對Lac操縱子表達(dá)的抑制是間接的，如：有一個E. coli突變體，它在糖酵解途徑中不能將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)變成下一步代謝中間物，這些細(xì)菌的Lac基因能在葡萄糖存在時(shí)被誘導(dǎo)合成，所以不是葡萄糖而是它的某些降解產(chǎn)物抑制了LacmRNA的合成，我們把葡萄糖的這種效應(yīng)稱之為代謝阻遏效應(yīng)。 5、 cAMP與代謝物激活蛋白 廣泛存在于動、植物組織中的cAMP是在腺苷酸環(huán)化酶的作用下轉(zhuǎn)變而來的，在許多真核生物激素調(diào)節(jié)過程中起著重要作用，它也存在于大腸桿菌中，其濃度受葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)，如果將細(xì)菌放入缺乏碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度非常高。如果在含葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，cAM

32、P的濃度就很低，如果培養(yǎng)基中只有甘油或乳糖等不進(jìn)行糖酵解途徑的碳源，cAMP的濃度也會很高，因此，推測糖酵解途徑中位于葡萄糖-6-磷酸與甘油之間的某些代謝產(chǎn)物是腺苷酸環(huán)化酶活性的抑制劑。 大腸桿菌中的分解代謝物激活蛋白，由crp基因編碼，能與cAMP形成復(fù)合物，凡crp及腺苷酸環(huán)化酶基因突變的細(xì)菌都不能合成LacmRNA，CAP和cAMP都是合成LacmRNA所必需的，事實(shí)上，cAMP-CAP復(fù)合物是Lac體系中一個有活性的復(fù)合物，細(xì)菌對此復(fù)合物的重要是獨(dú)立的，與阻遏體無關(guān)，因?yàn)閏rp基因和環(huán)化酶基因的突變細(xì)菌即使同時(shí)也是L或OC突變，仍然不能合成出LacmRNA，轉(zhuǎn)錄必須有cAMP-CAP復(fù)

33、合物結(jié)合在DNA的啟動子區(qū)域上，所以認(rèn)為cAMP-CAP是一個不同于阻遏物的正調(diào)控因子，而Lac操縱子的功能是正負(fù)兩個相互獨(dú)立的調(diào)控體系作用下實(shí)現(xiàn)的。 （三） Lac操縱子DNA的調(diào)控區(qū)域P、O區(qū) 現(xiàn)在利用分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)分離得到含有Lac操縱子DNA片段，其P-O區(qū)核苷酸序列已全部分析清楚，P區(qū)是從I基因結(jié)束到mRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，共長82bp，O區(qū)就是阻遏物結(jié)合區(qū)，位于P區(qū)后半部和轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。把mRNA起始到結(jié)構(gòu)基因起始密碼子之間的序列稱為前導(dǎo)區(qū)（Leader），P區(qū)是從-82 +1，阻遏物結(jié)合區(qū)大約從-7 + 28。該區(qū)（-7 + 28）的堿基序列有對稱性，其對稱軸在+11位堿基對，P

34、區(qū)的cAMP-CAP復(fù)合物結(jié)合區(qū)（-67 -52）也有一個對稱區(qū)，其對稱軸在-60 -59之間，對稱區(qū)在蛋白質(zhì)與DNA的識別和結(jié)合中有重要意義。在反應(yīng)體系中先加入阻遏物，后加入RNA聚合酶，體系無轉(zhuǎn)錄活性，反之若先加RNA聚合酶，后加阻遏物，體系有轉(zhuǎn)錄活性。已知PO區(qū)有7bp重迭，很可能阻遏物與O區(qū)的結(jié)合影響了RNA聚合酶與Pribnow區(qū)緊密結(jié)合形成穩(wěn)定的起始復(fù)合物，gal操縱子的PO區(qū)也是緊密相連并有重疊現(xiàn)象，面而trp操縱子的O區(qū)則完全在P區(qū)內(nèi)。Lac操縱子的調(diào)控區(qū)有幾個值得注意的特點(diǎn)： （1）       mRNA合成的起始位

35、點(diǎn)在操縱基因中，當(dāng)阻遏物蛋白存在時(shí)，該位點(diǎn)被阻遏物占據(jù)。 （2）       若RNA聚合酶預(yù)先結(jié)合在啟動子區(qū)域，阻遏物無法與操縱基因結(jié)合。（3）       cAMPCAP的結(jié)合位點(diǎn)非常接近于RNA聚合酶的作用位點(diǎn)，但不與之重合。（4）       整個調(diào)節(jié)區(qū)域的長度為115bp，約為DNA螺旋的12圈。（5）       這一區(qū)域的序列為IPOZ，這個序

36、列與遺傳分析的結(jié)果相吻合。三、TrP操縱子 色氨酸操縱子（tryptophane operon）負(fù)責(zé)色氨酸的生物合成，它的激活與否完全根據(jù)培養(yǎng)基中有無色氨酸而定，當(dāng)培養(yǎng)基中有足夠的色氨酸時(shí)，這個操縱子自動關(guān)閉，缺乏色氨酸時(shí)操縱子被打開，trp基因表達(dá)，在這里色氨酸與其代謝有關(guān)的某種物質(zhì)在阻遏過程中起作用，由于trp參與生物合成而不是降解，它不受葡萄糖或cAMP-CAP的調(diào)控。色氨酸的合成分5步完成，每個環(huán)節(jié)需要一個酶編碼，這5種酶的基因是緊密連鎖在一起的，所以5個基因被轉(zhuǎn)錄在一條多順反子mRNA分子上，分別以trpE、trpO、trpC、trpB、trpA代表，編碼了鄰氨基苯甲酸合成酶，鄰氨基

37、苯甲酸焦磷酸合成酶，trpE基因是第一個被翻譯的基因和trpE緊鄰酸是啟動子區(qū)和操縱區(qū)。另外前導(dǎo)區(qū)和弱化子區(qū)分別定名為trpL和trpa（不是trpA），trp操縱子中產(chǎn)生阻遏物的基因是trpR，該基因距trp基因簇很遠(yuǎn)，后者在大腸桿菌染色體圖上25min處，而前者則位于90min處，在位于65min處還有一個trpS（色aatRNA合成酶），它和攜帶有trp的tRNATrp也參與trp操縱子的調(diào)控作用（圖解）。trp操縱子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控除了阻遏系統(tǒng)以外，還有弱化系統(tǒng)（圖解）。L區(qū)編碼了前導(dǎo)肽，當(dāng)有高濃度Trp存在時(shí)，由于弱化子a的作用，轉(zhuǎn)錄迅速減弱停止，生成140核苷酸的前導(dǎo)RNA，當(dāng)Trp濃度

38、較低時(shí)，弱化子不起作用，轉(zhuǎn)錄得以正常進(jìn)行，生成約7kb的mRNA，操縱子中第一個結(jié)構(gòu)基因的起始密碼子AUG在+162處。（一）trp操縱子的阻遏系統(tǒng) trp基因突變常引起trpmRNA的永久型合成，該基因產(chǎn)物因此被稱為輔阻遏蛋白（aporepressor）除非培養(yǎng)基中有色氨酸，否則這個輔阻遏物不會與操縱區(qū)結(jié)合。輔阻遏蛋白與色氨酸相結(jié)合形成有活性的阻遏物，與操縱區(qū)結(jié)合并使之關(guān)閉轉(zhuǎn)錄trpmRNA。輔阻遏蛋白 + 操縱區(qū) 有活性的操縱區(qū)（能發(fā)生轉(zhuǎn)錄）輔阻遏蛋白 + 色氨酸 有活性阻遏物 + 操縱區(qū) （操縱區(qū)無活性，不發(fā)生轉(zhuǎn)錄） 如果停止或大幅度減少外源色氨酸的供應(yīng)，以上反應(yīng)的平衡向左移動，操縱區(qū)的

39、位置空出來，又開始轉(zhuǎn)錄，這就是基本的開關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)理。 啟動子與操縱區(qū)的區(qū)域有很大程度的重疊，有活性阻遏物的結(jié)合與RNA聚合酶的結(jié)合同樣發(fā)生競爭。在體外，如果先加入阻遏物，則RNA聚合酶不能結(jié)合，反過來則阻遏物不能結(jié)合。 Trp操縱子調(diào)節(jié)基因堿基序列，操縱區(qū)20bp的18bp形成了反面重復(fù)的對稱結(jié)構(gòu)。 Trp操縱子調(diào)節(jié)基因堿基序列（圖解） 阻遏操縱機(jī)制對trp來說是一個一級的開關(guān)，主管轉(zhuǎn)錄是否啟動，相當(dāng)于Trp操縱子的粗調(diào)開關(guān)，Trp操縱子中對應(yīng)于色氨酸生物合成的還有另一個系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)調(diào)控，這種細(xì)調(diào)控主管已經(jīng)啟動的轉(zhuǎn)錄是否繼續(xù)下去，在這個系統(tǒng)中，酶的濃度根據(jù)氨基酸的變化而變化，這個細(xì)調(diào)控是通過轉(zhuǎn)錄達(dá)

40、到每個結(jié)構(gòu)基因之前的過早終止來實(shí)現(xiàn)的，由Trp的濃度來調(diào)節(jié)這種過早終止的頻率。 （二）弱化子（衰減子）與前導(dǎo)肽 1、弱化子 trpmRNA5TrpE基因的起始密碼前有一個長162bp的mRNA片段被稱為前導(dǎo)區(qū)，其中堿基序列123-150位如果缺失，trp基因表達(dá)可提高6倍，而且無論是在阻遏細(xì)胞內(nèi)還是永久性突變的細(xì)胞內(nèi)都是這樣（即無論trpR 或trpR ）。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)mRNA合成起始以后，除非培養(yǎng)基中完全沒有色氨酸轉(zhuǎn)錄總是在這個區(qū)域終止，產(chǎn)生一個僅有140個核苷酸的RNA分子，終止trp基因轉(zhuǎn)錄，這就是123150序列缺失會提高trp基因表達(dá)的原因，因?yàn)檗D(zhuǎn)錄終止發(fā)生在這一區(qū)域，并且這種終止是被

41、調(diào)節(jié)的，這個區(qū)域就被稱為弱化子。 研究引起終止的mRNA 基序列，發(fā)現(xiàn)此區(qū)mRNA通過自我配對，可以形成莖一環(huán)結(jié)構(gòu)，有典型的終止子特點(diǎn)。 2、前導(dǎo)肽 各種實(shí)驗(yàn)表明衰減作用需要有負(fù)載tRNATrp參與，這意味著前導(dǎo)序列的某些部分被翻譯了， 分析前導(dǎo)序列，發(fā)現(xiàn)它包括起始密碼子AUG和終止密碼子UGA，如果翻譯起始于AUG，應(yīng)該產(chǎn)生一個含有14個氨基酸的多肽，這個假說的多肽（還未實(shí)際觀察到）被稱為前導(dǎo)肽，在mRNA上AUG位點(diǎn)5端有一個核糖體結(jié)合位點(diǎn)，此外，前導(dǎo)肽編碼區(qū)與trpE基因5端融合可產(chǎn)生一種融合蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有與前導(dǎo)肽同樣的N未端序列。 前導(dǎo)序列具有一個非常有意義的特點(diǎn)，在其第10和第

42、11位上有抑制的兩個色氨酸密碼子，這一點(diǎn)很重要，因?yàn)榻M氨酸操縱子中，也具有弱化子也具有一個類似的能編碼前導(dǎo)肽的堿基序列，此序列中含有7個相鄰的組氨酸密碼子，苯丙氨酸操縱子中同樣存在弱化子結(jié)構(gòu)，其前導(dǎo)序列中也有7個苯丙氨酸密碼子。 3、 mRNA前導(dǎo)區(qū)的序列分析 trp前導(dǎo)區(qū)的堿基序列已經(jīng)全部測定，引人注目的是其中4個分別以1、2、3和4表示的片段能以兩種以上的不同方式進(jìn)行堿基配對，有時(shí)以12和34配對，有時(shí)只以23方式互補(bǔ)配對（圖解）。Rnase降解實(shí)驗(yàn)（此酶不能水解配對的RNA）表明純化的Trp前導(dǎo)序列中只有12和34的配對方式，由此定位的34配對區(qū)正好位于終止密碼子的識別區(qū)，當(dāng)這

43、個區(qū)域發(fā)生破壞自我配對，堿基突變時(shí)有利于轉(zhuǎn)錄的繼續(xù)進(jìn)行。 4、 轉(zhuǎn)錄衰減作用 這一理論認(rèn)為mRNA轉(zhuǎn)錄終止是通過前導(dǎo)肽基因的翻譯來調(diào)節(jié)的，因?yàn)榍皩?dǎo)肽基因中有兩個相 鄰的色氨酸密碼子，所以這個前導(dǎo)肽的翻譯必定對tRNATRP的濃度敏感，當(dāng)培養(yǎng)基中色氨酸濃度很低時(shí)，負(fù)載有色氨酸的tRNATRP也就少，這樣翻譯通過兩個相鄰的色氨酸密碼子的速度就會很慢。當(dāng)4區(qū)被轉(zhuǎn)錄完成時(shí)，核糖體才進(jìn)行到1區(qū)，這時(shí)的前導(dǎo)區(qū)結(jié)構(gòu)不形成34配對的終止結(jié)構(gòu)，所以轉(zhuǎn)錄可繼續(xù)進(jìn)行，直到將Trp操縱子中的結(jié)構(gòu)基因全部轉(zhuǎn)錄，當(dāng)培養(yǎng)基中色氨酸濃度高時(shí)，核糖體可順利通過兩個相鄰的色氨酸密碼子，在4區(qū)被轉(zhuǎn)錄之間，核糖體就達(dá)到2區(qū)

44、，這樣使23不能配對，34區(qū)可以自由配對形成第一環(huán)狀終止子結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停止。trp操縱子中的結(jié)構(gòu)基因被關(guān)閉而不再合成色氨酸，所以弱化子對RNA聚合酶的影響前導(dǎo)肽翻譯中核糖體所處的位置。 大腸桿菌和沙門氏桿菌中，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了不少操縱子中具有弱化作用，從前導(dǎo)區(qū)序列可以看到它們都具有前導(dǎo)肽。 （三）阻遏作用與衰減作用的協(xié)調(diào) 有實(shí)驗(yàn)證明，在不加Trp的培養(yǎng)基中，trpmRNA的合成仍然受到部分阻遏，因?yàn)橛幸粋€無阻遏物活性的突變細(xì)胞系中，trp合成酶濃度要高在野生型細(xì)胞中10倍以上。事實(shí)上，現(xiàn)在一般認(rèn)為，野生型細(xì)胞中同時(shí)存在著有活性和無活性的阻遏物，培養(yǎng)基中色氨酸濃度的變化，能夠使這兩種阻遏物間的平衡發(fā)生傾

45、斜，最終做在關(guān)閉或啟動trp操縱子的決定，從而維持一定的trp含量。細(xì)菌為什么需要有弱化子系統(tǒng)呢？一種可能是阻遏物從有活性向無活性的轉(zhuǎn)錄速度極低，需要有一個能更快地做在反應(yīng)的系統(tǒng)，以保持培養(yǎng)基中適當(dāng)?shù)纳玜a水平，也有可能弱化子系統(tǒng)主要是對外源色aa濃度做在反應(yīng)，但是這個信號還不足以很快引發(fā)內(nèi)源色aa的合成，于是在這種環(huán)境下，衰減子就通過抗終止的辦法來增加trp基因表達(dá)，從而提高內(nèi)源色氨酸濃度。阻遏物的作用目前認(rèn)為是當(dāng)有大量外源色氨酸存在時(shí)，阻止非必需的先導(dǎo)mRNA的合成，它使這個合成系統(tǒng)更加經(jīng)濟(jì)，它擁有功能上與Trp操縱子完全相同的弱化子，這個弱化子能夠形成一個有3個堿基配對的區(qū)域，組氨酸操縱

46、子沒有阻遏物，這就說明完全受弱化子調(diào)節(jié)。四、    其它操縱子 （一）半乳糖操縱子 大腸桿菌半乳糖操縱子（galactose operon）在大腸桿菌遺傳圖上位于17min處，包括3個結(jié)構(gòu)基因：（1）異構(gòu)酶（UDPgalactose，galE）；（2）半乳糖激酶（galactose Rinase，galK）；（3）半乳糖磷酸尿嘧啶核苷轉(zhuǎn)移酶（galactosetramferanse，galT），這3個酶的作用是使半乳糖變成葡萄糖-1-磷酸，半乳糖操縱子的調(diào)節(jié)基因是galR位于遺傳圖上35min處，gal操縱子與lac操縱子所不同的是galR與galE、T、K及操縱

47、區(qū)O等離得很遠(yuǎn)，而galR產(chǎn)物對galO的作用與lacIlacO的作用相同，因?yàn)樵趃alR和galOC突變體中E、T、K基因得到永久性表達(dá)。gal操縱子的誘導(dǎo)物主要是半乳糖。gal操縱子還有兩個特點(diǎn)：（1）具有兩個啟動子，其mRNA可以從兩個不同的起始點(diǎn)開始轉(zhuǎn)錄；（2）它有兩個O區(qū)，一個在P區(qū)上游-67-53，另一個在結(jié)構(gòu)基因galE內(nèi)部。1、 cAMP-CRP對gal啟動子的作用 因?yàn)榘肴樘堑睦眯时绕咸烟堑?，人們猜想葡萄糖存在時(shí)半乳糖操縱子不被誘導(dǎo)，但實(shí)際上有葡萄糖存在時(shí)，gal操縱子仍可被誘導(dǎo)，現(xiàn)已分離到一些突變株，其中一類突變株能在不含葡萄糖的培養(yǎng)基中高水平合成半乳糖代謝酶

48、類（gal結(jié)構(gòu)基因高效表達(dá)）；而另一類突變株中g(shù)al基因的表達(dá)不依賴半乳糖代謝酶類。據(jù)此科學(xué)家認(rèn)為gal操縱子存在著兩個啟動子，對這個操縱子的PO區(qū)進(jìn)行堿基序列分析，證實(shí)確有兩個相距僅為5bp的啟動子，gal操縱子可以從兩個啟動子分別起始基因轉(zhuǎn)錄，每個啟動子擁有各自的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)S1和S2，cAMP-CRP對S1和S2起始轉(zhuǎn)錄有不同的作用。 從S1起始的轉(zhuǎn)錄只有在培養(yǎng)基中無葡萄糖時(shí)才順利進(jìn)行，RNA聚合酶與S1的結(jié)合需要半乳糖、CRP和較高濃度的cAMP。當(dāng)腺苷環(huán)化酶突變（cya）或cAMP受體蛋白（crp）時(shí)，gal操縱子不能以S1起始轉(zhuǎn)錄，此時(shí)如在體外系統(tǒng)中加入cAMP-CRP就能

49、夠促進(jìn)從S1起始的轉(zhuǎn)錄。 從S2起始的轉(zhuǎn)錄則完全依賴于葡萄糖，高水平的cAMP-CRP能抑制由這個啟動子起始的轉(zhuǎn)錄。CAMP-CRP在gal操縱子中所起的調(diào)節(jié)作用比在lac操縱子中更為復(fù)雜，大腸桿菌的cya或crp突變型不能利用乳糖，但可以利用半乳糖作唯一碳源。CAMP-CRP能夠刺激gal操縱子轉(zhuǎn)錄，用含有g(shù)al操縱子調(diào)節(jié)區(qū)的DNA片段作模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄時(shí)，發(fā)現(xiàn)cAMP-CRP抑制從S2的轉(zhuǎn)錄而刺激從S1的轉(zhuǎn)錄，當(dāng)有cAMP-CRP時(shí)，轉(zhuǎn)錄從S1開始，當(dāng)cAMP-CRP時(shí)轉(zhuǎn)錄從S2開始。有一個gal啟動子突變株，不能利用培養(yǎng)基中的半乳糖，若將此突變株再行突變?yōu)閏ya 或crp，細(xì)胞恢復(fù)了利用

50、半乳糖的能力，這很可能是由于第一次突變失去了從S1起始轉(zhuǎn)錄的能力，但并不影響從S2起始轉(zhuǎn)錄能力，該株不能利用半乳糖是因?yàn)閏AMPCRP的存在抑制了從S2開始的基因轉(zhuǎn)錄，使gal操縱子既不能從S1起始，又無法從S2開始基因轉(zhuǎn)錄。雙重突變后，無論是cya突變，還是crp突變都能夠去cAMPCRP對S2的阻遏作用，導(dǎo)致gal基因表達(dá)恢復(fù)利用半乳糖作為能源的能力。對這一突變體啟動區(qū)核苷酸序列分析的結(jié)果支持了上述觀點(diǎn)，已知突變發(fā)生在-11位核苷酸，使原來的A突變?yōu)門，這個位點(diǎn)是Pribnow區(qū)S1區(qū)的第二位核苷酸，已知許多啟動子中這一核苷酸的保守性很強(qiáng)，AT毫無疑問帶來了功能上的改變，導(dǎo)致不能從S1處開

51、始轉(zhuǎn)錄。雖然這一核苷酸也是Pribnow區(qū)，S2區(qū)的第七位核苷酸，從其他啟動子核苷酸的變化情況看，這個位點(diǎn)A T變化并不影響S2區(qū)RNA聚合酶的結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始活性。2、 雙啟動子的生理功能 gal的雙啟動子很可能與半乳糖在細(xì)胞代謝中的雙重作用有關(guān)，半乳糖不僅可以作為唯一碳源供細(xì)胞生長，而且與之相關(guān)的物質(zhì)尿苷二磷酸半乳糖（UDPgal）是大腸桿菌細(xì)胞壁合成的前體。在沒有外源半乳糖的情況下，UDP-gal是通過半乳糖向異構(gòu)酶的作用，由UDP-葡萄糖合成的，該酶是galE基因的產(chǎn)物，因此生長過程中的所有時(shí)間里細(xì)胞必須能夠合成差向異構(gòu)酶。另一方面，因?yàn)楹铣杉?xì)胞壁過程中對異構(gòu)酶的需要量很小，本

52、底水平的永久型合成就能夠滿足生理需要，實(shí)際上，galmRNA的永久合成水平已高于lac操縱子所合成lacmRNA的水平，顯然這個mRNA是在沒有半乳糖的情況下合成的。（二）阿拉伯糖操縱子 阿拉伯糖（arabinose）是另一個可為代謝提供碳源的五碳糖，在大腸桿菌中阿拉伯糖的降解需要3個基因：araB、araA、araD，它們形成一個基因簇，簡寫為araBAD，它們分別編碼3個酶：araB基因編碼核酮糖激酶，araA編碼L阿拉伯糖異構(gòu)酶，araD編碼L-核酮糖-5-磷酸-4-差 異構(gòu)酶。在gal操縱子中，基因的排列序列就是代謝途徑中酶的作用序列，而這個操縱子卻不同。阿拉伯糖代謝是以araA、ar

53、aB、araD的序列進(jìn)行的，另外還有負(fù)責(zé)將阿拉伯糖透入細(xì)胞的基因即araE和araF，它們位于遠(yuǎn)離這個基因簇的地方，araE和araF分別編碼一個膜蛋白和一個位于細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間的阿拉伯糖結(jié)合蛋白。 與araBAD相鄰的是一個復(fù)合的啟動子區(qū)域和一個調(diào)節(jié)基因araC這個調(diào)節(jié)基因的性質(zhì)與前面的Lac及gal操縱子中的調(diào)節(jié)基因的性質(zhì)全然不同，AraC蛋白同時(shí)顯示正、負(fù)調(diào)節(jié)因子的功能，與之相反在Lac和gal操縱子中，阻遏蛋白只能作為負(fù)調(diào)節(jié)因子，而cAMPCRP蛋白只能是正調(diào)節(jié)因子，araBAD和araC基因的轉(zhuǎn)錄是分別在兩條鏈上以相反的方向進(jìn)行的。 Ara操縱子也是可誘導(dǎo)的，阿拉伯糖本身就是誘導(dǎo)物

54、，在野生型操縱子中，只有阿拉伯糖存在時(shí)才轉(zhuǎn)錄在araBADmRNA，而有葡萄糖存在時(shí)則不轉(zhuǎn)錄，在腺苷酸環(huán)化酶的缺陷型和Crp突變株也不形成araBADmRNA，說明以PBAD起始的轉(zhuǎn)錄過程也重要cAMP-CRP。 AraC蛋白說明ara操縱子的正負(fù)調(diào)節(jié)蛋白，又是它們負(fù)調(diào)節(jié)蛋白。（圖解） 五、    轉(zhuǎn)錄后調(diào)控 原核生物的基因表達(dá)調(diào)控雖然主要表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平上，但也有一些轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控機(jī)制。 （一）稀有密碼子對翻譯的影響 翻譯水平上的調(diào)控大致可分為兩類：即固定式和非固定式調(diào)控。固定式調(diào)控機(jī)制包括在DNA序列之內(nèi)，如稀有密碼子和重疊基因的使用等調(diào)控不受環(huán)境影響，非固定式調(diào)

55、控是受環(huán)境影響的調(diào)控，與DNA序列無關(guān)。 大腸桿菌DNA復(fù)制時(shí)岡崎片段之前的RNA引物是由dnaG基因編碼并由引物酶催化合成的，細(xì)胞對這種酶的需求是不大，若引物酶過多還將導(dǎo)致細(xì)胞死亡，已知dnaG和rpoD及rpsU屬于大腸桿菌基因組的同一個操縱子，而這3個基因產(chǎn)物在數(shù)量上都大不相同，每個細(xì)胞dnaG產(chǎn)物50拷貝，而rpoD為2800拷貝，rpsU則高達(dá)40000拷貝之多，細(xì)胞通過翻譯調(diào)控，解決了這個問題。 研究dnaG序列發(fā)現(xiàn)其中含有不少稀有密碼子，也就是說這些密碼子在其他基因中利用頻率很低，而在dnaG中卻很高。分別計(jì)算大腸桿菌中25種非調(diào)節(jié)蛋白和dnaG和rpoD序列中64種密碼子的利用頻率，可以看出dnaG與其他兩類有明顯不同。 許多調(diào)控蛋白如LacI、AraC、TrpR等在細(xì)胞內(nèi)含量也很低，編碼