谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在體外培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)械性損傷中的表達(dá)變化

1、論著【收稿日期】2007-11-11;【修回日期】2008-03-05【作者簡(jiǎn)介】趙志勇(1976-,男,籍貫吉林雙遼,主治醫(yī)師,主要從事外科及醫(yī)院管理工作。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在體外培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)械性損傷中的表達(dá)變化趙志勇,劉芳,彭鳳翔(武警四川總隊(duì)醫(yī)院,四川樂(lè)山,614000【文章編號(hào)】1008-5041(200804-0283-04【中圖分類(lèi)號(hào)】R745.7【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A Glutamate transporters expression in cultured rat cortex astrocyte in vitro following me -chanical brain i

2、njuryZHA O Zhi -yong ,LIU Fang ,PENG Feng -xiang (Sichuan Provincial Corps Hospital of Chinese People s Armed Po -lice Force ,Leshan 614000,China 谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性突觸傳遞的主要神經(jīng)遞質(zhì),其清除方式主要是通過(guò)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取谷氨酸。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體分為GLAST (或簡(jiǎn)稱(chēng)EAAT1、G LT1(EAAT2、EAAC1(EAAT3、EAAT4和EAAT5等5個(gè)類(lèi)型,主要位于神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜上,能逆濃度梯度從胞外向胞內(nèi)攝取谷氨酸,中止谷氨酸能

3、傳遞,使胞外谷氨酸濃度保持在較低水平,以保護(hù)神經(jīng)元不受谷氨酸的毒性影響。近年來(lái),研究發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血損傷后,腦內(nèi)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞胞膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)明顯增加1,2,提示不同程度的腦損傷可引起腦內(nèi)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)變化。以上是建立在化學(xué)性損傷的基礎(chǔ)上,而對(duì)于與臨床上腦損傷較為相似的機(jī)械性損傷后谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)情況迄今未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立體外培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)械性損傷模型,研究單一細(xì)胞受到機(jī)械力損傷后谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(EAAT1表達(dá)變化,并初步探討其可能的機(jī)制,為臨床顱腦損傷的防治提供理論依據(jù)。1材料與方法1材料1.2方法2.1星形膠質(zhì)細(xì)胞鑒定GFAP 為星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物

4、,存在于胞漿內(nèi),免疫組化染色呈棕黃色。對(duì)傳代成熟的細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色分析,置于鏡下觀察記數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),99%以上的細(xì)胞呈現(xiàn)棕黃色(DAB 顯色,結(jié)果表明培養(yǎng)的細(xì)胞絕大多數(shù)屬于星形膠質(zhì)細(xì)胞(圖1。 圖1體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞GF AP 免疫組織化學(xué)染色(X 2002.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EAAT1蛋白的表達(dá)流式細(xì)胞術(shù)定量分析結(jié)果表明:機(jī)械性劃傷12h 和24h 后,EAAT1蛋白表達(dá)均較對(duì)照組顯著增加(P 0.05。見(jiàn)表1。表1損傷不同時(shí)間后EAAT 1蛋白的表達(dá)情況( x s 組別EAAT1對(duì)照組0.420.09損傷12h 組0.830.13損傷24h 組0.890.11:與對(duì)照組比較,P 0.0

5、52.3Western blo tting 定量EAAT1蛋白的表達(dá)1:對(duì)照組;2:損傷后12h 組;3:損傷后24h 組圖2對(duì)照組、損傷后12h 和24h 組谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白表達(dá)Western Blottin g 結(jié)果3討論目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者為了進(jìn)一步闡明神經(jīng)系統(tǒng)損傷的相關(guān)病理生理機(jī)制,研究臨床顱腦損傷的防治方法,建立了多種以體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞為基礎(chǔ)的損傷模型,根據(jù)其致傷機(jī)理的不同大致可以分為兩大類(lèi),即化學(xué)損傷和機(jī)械損傷模型。由于機(jī)械性損傷模型與臨床上創(chuàng)傷性腦損傷發(fā)病機(jī)制最相似,故為我們所采用。機(jī)械性損傷模型可進(jìn)一步分為牽拉損傷、液壓沖擊損傷、氣壓損傷及機(jī)械劃傷模型等,各種類(lèi)型的機(jī)械性損傷模

6、型具有各自?xún)?yōu)缺點(diǎn),機(jī)械劃傷無(wú)需特殊設(shè)備,操作簡(jiǎn)單,作用力單一,對(duì)細(xì)胞損傷較為明顯,是一種簡(jiǎn)單有效的體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)械性損傷模型。星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)是基礎(chǔ)與臨床神經(jīng)科學(xué)研究的基礎(chǔ),顱腦創(chuàng)傷的發(fā)生與發(fā)展,與腦內(nèi)細(xì)胞的分子水平的變化是密不可分的。因此,研究星形膠質(zhì)細(xì)胞受到機(jī)械力損傷后其細(xì)胞內(nèi)分子表達(dá)的改變,對(duì)于探討其致傷機(jī)理、指導(dǎo)臨床診斷治療具有一定的意義。國(guó)內(nèi)外學(xué)者目前對(duì)于體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定方法,多采用免疫組織化學(xué)的方法,根據(jù)細(xì)胞內(nèi)特定的表達(dá)產(chǎn)物,應(yīng)用最多的是神經(jīng)纖維酸性蛋白(GFAP ,對(duì)細(xì)胞的種類(lèi)進(jìn)行區(qū)分。GFAP 是星形膠質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)特異性表達(dá)的一類(lèi)蛋白質(zhì),在神經(jīng)元胞漿內(nèi)不表

7、達(dá)或很少表達(dá),因此,通過(guò)免疫學(xué)方法,可對(duì)培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的種類(lèi)和純度進(jìn)行鑒別,以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要,該種鑒定方法特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單,故為我們實(shí)驗(yàn)所采用。細(xì)胞發(fā)生損傷,其結(jié)果會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)(包括胞膜的結(jié)構(gòu)和分子構(gòu)成發(fā)生變化。研究發(fā)現(xiàn)以谷氨酸為主的興奮性氨基酸在腦缺血損傷后的繼發(fā)性損傷中起關(guān)鍵作用,大量興奮性氨基酸聚積在細(xì)胞外間隙,最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞壞死或凋亡。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體作為清除興奮性氨基酸的最主要物質(zhì),當(dāng)腦組織發(fā)生損傷后,隨著大量氨基酸的形成,海馬和皮質(zhì)內(nèi)的EAAT-1的表達(dá)在不同時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)一種下降的趨勢(shì),結(jié)果表明谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體與缺血后神經(jīng)功能缺損在時(shí)間上存在密切關(guān)聯(lián),神經(jīng)細(xì)胞損傷以壞死為主,EA

8、AT-1的表達(dá)減少6。本實(shí)驗(yàn)以離體培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞為基礎(chǔ),采用機(jī)械力的方法導(dǎo)致腦細(xì)胞發(fā)生一定程度的損傷,結(jié)果顯示在損傷后12h和24h,谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)相比對(duì)照組明顯升高,提示EAAT-1可能參與了細(xì)胞的抗損傷過(guò)程,在抵御谷氨酸對(duì)細(xì)胞毒性方面發(fā)揮了一定的作用。我們實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與缺血性腦損傷存在一定的差異,原因可能與所采取的損傷模型不同,致傷程度不一致有關(guān),其具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究7,8?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1梁輝,陳虎,蔡定芳.急性腦缺血損傷大鼠海馬神經(jīng)元谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)J.中國(guó)病理生理雜志,2005,21(6:1061 -1065.2張光運(yùn),段麗,饒志仁,等.局灶性腦梗死引起谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在星形膠

9、質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)J.解剖學(xué)報(bào),2004,35(6:574-577.3周洪語(yǔ),路麗明,沈建康,等.SD大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)J.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志,2003,2(5:346-348. 4闕海萍,賈宇峰,劉少君.神經(jīng)元損傷修復(fù)機(jī)制研究的離體模型體外培養(yǎng)原代神經(jīng)元損傷模型的建立及損傷后c-Fos蛋白表達(dá)J.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊,2003,27(4:277-279.5Kruger NJ.The Bradford method for p rotein quantitationJ.M ethods M ol Biol,1994,32:9-15.6邱永明,陸兆豐,田鑫,等.大鼠全腦缺血后谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)J.

10、中國(guó)腦血管病雜志,2006,3(2:74-78.7Katsura M,Lino T,Kuriyama K.C hanges incontent of neu roac-tive amino acids and acetylcholine in the rat hippocampus foll ow ing trans iet forebrain ischemiaJ.Neurochem Int,1992,21:243-249.8Feustel PJ,Jin Y,Kimelberg HK.Volume-regulated anion chan-nels are the predominant co

11、ntributors to release of excitatory amino acids in the ischemic cortical penumb raJ.Stroke,2004,35: 1164-1168.(責(zé)任編輯:段姚堯(上接第282頁(yè)等植物雌激素由于與雌二醇(es-tradiol的空間結(jié)構(gòu)具有相似性,可以與雌激素受體(ER結(jié)合發(fā)揮微弱雌激素效應(yīng),也可與雌二醇競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ER,表現(xiàn)出雌激素拮抗作用。本研究表明,蛇床子素在10-8mol L時(shí)表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)M CF-7細(xì)胞的增殖作用,提示在該濃度時(shí)蛇床子素對(duì)M CF-7細(xì)胞顯示出雌激素樣的刺激增殖活性。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,蛇床子素具有

12、抗誘變3、抑制腫瘤增殖活性4,對(duì)人肺鱗癌和肺腺癌具有抑制作用5。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在10-810-6mol L的濃度范圍內(nèi),蛇床子素促M(fèi)CF-7細(xì)胞增殖的活性隨著濃度的增加而逐漸降低,推測(cè)可能與其本身具有的抗腫瘤作用有關(guān)。蛇床子素可能在低濃度時(shí)對(duì)M CF-7細(xì)胞顯示出雌激素樣的刺激增殖活性,隨濃度的升高,其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性逐漸顯現(xiàn)出來(lái)。關(guān)于其在不同濃度時(shí)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖作用的影響以及作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1Zhang Y,Xie M L,Zhu LJ,et a l.Therapeu tic effect of ostholeon hyperlipidemic fatty liver in ratsJ.Acta Pharmacol Sin, 2007,28(3:398-403.2Robbl e Y K,Chen WF,Aling Dong,et a l.Estrogen-Like ac-tivity of gins enoside Rg1derived from Panax notoginsengJ.J Clin Endo&M eta,2002,87(8,3691-3695.3殷學(xué)軍,向仁德,劉德祥,等.中藥蛇床子水溶性提取物中化學(xué)成分的抗誘變性研究J.癌變畸變突變,1998,10(3: 133-140.4Kaw ai S,Tom ohiro N,Ogaw