質(zhì)粒構(gòu)建-protocol

1、一， 引物設計:1,選擇合適的載體。酶切位點及其順序（酶切位點的順序一定不能顛倒）。2，在NCBI上再次確認目的片段的堿基序列。首位20個堿基保護堿基4個上游酶切位點1， 使用word排除目的片段里含有的酶切位點，最后確定所使用的酶。2， 設計引物：primer-up： - -末尾20個堿基的反向互補堿基保護堿基4個下游酶切位點 Primer-down： - -3， 核對-送公司合成。4， 對公司合成的引物離心，10000rpm、5-10分鐘、at 4，在超凈臺按照管子上標注的體積加入高壓水（2dH2O），再把上游引物和下游引物混在一起，at 4保存。二， PCR（P出目的片段）：（一）、從韓

2、家淮實驗室贈送的菌液里P出目的片段：1，揺菌過夜： 2ul韓家淮實驗室的菌液，15ml離心管 Xul相應的抗生素 3ml LB 94 5min33cycles2,pcr: 菌液1ul 94 30secPcr溫度體系Pcr(50ul)反應體系2x PFU mix 25ul 58 30sec Primer 1ul 72 X min2d H2O 23ul 72 5min（X是根據(jù)片段的長度設定，500-1000bp/min，退火溫度根據(jù)Tm值來計算，一般低于Tm值2）3，跑膠、回收: （1），配膠：煮沸3次1%的瓊脂糖膠：大塊 稱0.6g的瓊脂糖 加入60ml的1X TAE 加入0.6ul的EB(待

3、溫度降到50-60左右時) 25分鐘后，即可點樣跑膠。（2），跑膠：130-150V、25-30分鐘左右。（3），紫外燈下觀察，切膠（要帶防護手套和口罩）4，做膠回收（天根TIANGEN公司的DNA純化回收試劑盒）:按照試劑盒的protocol來做，在膠回收的最后一步，Elution Buffer預先在55-65溫箱中水浴，并且在加過EB后，放在37溫箱中2min。對膠回收的產(chǎn)物跑膠驗證。可建立10ul的體系：回收產(chǎn)物2ul、10xloading buffer 2ul、2d H2O 6ul。三， 酶切、鏈接：1，目的片段酶切：（37酶切過夜或者4小時） insert ：上述膠回收產(chǎn)物 35ul

4、 10 x H buffer（1.5x） 7ul50ul的體系 dd H2O 6ul 酶1 1ul 酶2 1ul2，載體酶切：（37酶切過夜或者4小時） Vector （1ug/ul）：2 ul 10 x buffer（1.5x） 3ul20ul的體系 dd H2O 13ul 酶1 1ul 酶2 1ul為方便以后使用，載體可以一次性多切點。3， 酶切時，首先要核對一下酶的buffer，有時雙酶切時兩個酶不能共用一種buffer，那么就要先切一端，酶切回收后再用另一酶切另一端，然后再酶切產(chǎn)物回收。4，連接： 2x Rapid Ligation 6ul Vector 0.8ul12ul的體系 in

5、sert 4.5ul（目的是為了多加點insert） T4 DNA Lignase 1ul四， 轉(zhuǎn)化：質(zhì)粒 10ul感受態(tài)細菌10ul、冰上20分鐘-熱激：42、90秒-冰上2分鐘、加1ml SOC（或者1ml LB），37、180 rpm、45分鐘。、將上述轉(zhuǎn)化后的菌液加入到100ml的LB中。再按抗生素：LB=1:1000的比例加入抗生素，（100ml的LB加50ul的2Kx的氨芐）。、250rpm、過夜。五， 質(zhì)粒大抽：六， 收菌：取過夜菌至50毫升離心管，離心：6000g、3-5分鐘、4。再重復一次，每管共收集100毫升過夜菌沉淀。（倒置于草紙上使液體流盡)。七， 重懸：每管加入8ml

6、的RES-EF(RnaseA)，重懸細菌沉淀充分Vortex或用槍頭吹打沉淀。確保沉淀完全散開，無可見細菌團塊。3，裂解： 每管加入等量的LYS-EF bufffer，即8ml。輕輕上下顛倒離心管4-6次，（勿震?。┦覝胤胖?min，使細菌完全裂解，溶液透明，無團塊或絮狀物。注意：vortex或其它劇烈操作會導致基因組DNA斷裂，易導致最終所得質(zhì)粒被基因組DNA污染4，平衡：濾芯插入柱子，將柱子駕于50ml離心管上（或者直接架于50ml離心管架上）：取15ml EQU-EF buffer 沿濾芯四周加入充分平衡濾芯。注意：離心管內(nèi)的液體不要浸沒濾柱的頭，所以要勤于倒棄濾液，在過濾平衡液的同時，

7、進行5、6步，防止濾芯干掉。5，中和：在等待EQU-EF buffer濾完時，往裂解好的菌液中加入8ml NEU-EF buffer，顛倒混勻，冰上孵育5min。（不能vortex）6，離心、過濾：離心中和過的菌液：10000rpm、5-10min、at 4-質(zhì)粒存在于上清中。（離心使沉淀更加緊密，更集中于管底，對于進一步提高質(zhì)粒質(zhì)量會有所幫助）：將上清吸入到平衡好的濾芯中,重力自流盡。7，洗一：過濾完畢后，吸取5ml的FIL-EF buffer，沿濾芯四周加入（將粘在濾芯上的質(zhì)粒洗下來）-過濾完后，將濾芯棄掉。8，洗二：往濾柱中加入35ml的ENDO-EF buffer去內(nèi)毒素9，洗三：待濾

8、完后再加入15ml的wash-EF buffer過濾。10，洗脫：取一支干凈的15ml超速離心管，將濾完的柱子插入到離心管中，用高壓條將二者綁好，往濾柱中加入5ml Elu-EF buffer.(Elu-EF buffer預先放在50的恒溫箱中加熱，可提高洗脫效率)11，沉淀：待Elu-EF buffer濾完后，棄濾柱，往離心管中加入5ml的異丙醇（將質(zhì)粒沉淀下來），混勻（充分vortex），靜止10min-10000rpm、30min、4-棄上清。12，洗滌：加5ml的70酒精（ETOH）或用15ml三蒸水（高壓過）+35ml的無水乙醇配制（在超凈臺進行），混勻（上下顛倒即可），離心：10000rpm、10min、常