大腸菌群及大腸桿菌檢測(cè)方法

1、出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗(yàn)方法Method for examination of coliform ， fecal coliform and escherichia coli in food for exportSN 0169 92 代替 ZB X09 002 861 主題內(nèi)容與適用范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌的檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于出口食品的檢驗(yàn)。2 設(shè)備和材料2.1吸管：1mL，具O.ImL刻度；5mL和10mL，具1mL刻度。水浴箱： 44.5±O.5C。2.3培養(yǎng)箱： 36±1C， 44.5±0.5C。2.4

2、冰箱：05 C和-15-20Co2.5均質(zhì)器。2.6 乳缽和研棒。2.7 平皿：直徑 90mm。2.8 天平：感量 O.1g。2.9 顯微鏡。2.10 稀釋瓶： 100mL、200mL 和 500mL 三角燒瓶及廣口瓶。2.11 玻璃珠：直徑約 5mmo 2. 1 2菌落計(jì)數(shù)器。3 培養(yǎng)基及試劑3.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白(LST) 肉湯。3.2 煌綠乳糖膽鹽 (BGLB)肉湯。3.3 EC 肉湯。3.4 伊紅美藍(lán)瓊脂 (EMB) 。3.5 營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面。3.6 色氨酸肉湯。3.7 MR-VP 培養(yǎng)基。3.8 Korser 氏枸椽酸鹽肉湯。3.9 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)3.1O But

3、terfield 氏磷酸鹽緩沖稀釋液。3.11 生理鹽水。3.12 革蘭氏染色液。3.13 Kovacs 氏靛基質(zhì)試劑。3.14 甲基紅指示劑。3.15 Voges p ros kauer(V P)試劑。4.1 以無(wú)菌操作取有代表性的樣品。如有包裝則用4 樣品制備75乙醇在開(kāi)口處擦拭后取樣。若不能及時(shí)檢驗(yàn)，應(yīng)將冷凍樣品置于-15C保存；非冷凍而易腐的食品， 應(yīng)置于4C冰箱保存。檢驗(yàn)前冷凍樣品可于 2 5C 18h內(nèi)解凍，或在45C以下 15min 內(nèi)解凍。4.2 不同食品樣品勻液的制備4.2.1 液體食品 以滅菌吸管取樣 25mL 放入裝有 225mL 稀釋劑的滅菌玻璃瓶 (瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的

4、玻璃珠 ) ，以 30cm 幅度、于 7s內(nèi)振搖25次(或以機(jī)械振蕩器振搖)，制成1 : 10的樣品勻液。4.2.2 固體和半固體食品以無(wú)菌操作取 25g樣品，放入裝有 225mL稀釋劑的滅菌均質(zhì)杯內(nèi)，于8000r/ min均質(zhì)12min，制成1: 10樣品勻液 （也可用滅菌乳缽研磨的方法代替）4.3 稀釋樣品勻液根據(jù)對(duì)樣品污染情況的估計(jì)，用稀釋劑將樣品勻液制成一系列十倍遞增的樣品稀釋液，如 10-2 、10-3、 10-4.。從制備樣品勻液至稀釋完畢，全過(guò)程不得超過(guò)15min5 大腸菌群的測(cè)定5.1 大腸菌群 MPN 值的測(cè)定5.1.1肉湯，對(duì)每個(gè)樣品，選擇適宜的三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液。

5、每個(gè)稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白 每管接種 1mL 。(LST)5.1.2將接種管置于36±1C培養(yǎng)48±2h。觀察試管的產(chǎn)氣情況： 檢查倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生， 記錄在 24h 和 48h 內(nèi)產(chǎn)氣的 LST 肉湯管數(shù) 肉湯管均未產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性；如有產(chǎn)氣者，則進(jìn)一步作證實(shí)試驗(yàn)。5.1.3如所有 LST5.2 大腸菌群的證實(shí)試驗(yàn)5.2.1將所有產(chǎn)氣管用直徑為 3mm 的接種環(huán)移種到煌綠乳糖膽鹽 （BGLB） 肉湯管中。5.2.2置BGLB肉湯管于36 ±1 C培養(yǎng)48±2h。5.2.3記錄所有 BGLB 肉湯管的產(chǎn)氣管數(shù)。5.2.4結(jié)果報(bào)告

6、：按BGLB肉湯產(chǎn)氣管數(shù)，查 MPN表（見(jiàn)附錄B（補(bǔ)充件）報(bào)告每克（毫升）樣品中大腸菌群的 MPN值。6 糞大腸菌群測(cè)定6.1用直徑為3mm的接種環(huán)將所有 48±2h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管培養(yǎng)物移種于 EC肉湯管中。6.2將所有接種的 EC肉湯管在30min內(nèi)放入帶蓋44.5 ±5C水浴箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2h。水浴箱的水平面應(yīng)高于肉湯 培養(yǎng)基液面。應(yīng)以已知為44.5 C產(chǎn)氣陽(yáng)性的大腸桿菌和44.5 C不產(chǎn)氣的產(chǎn)氣腸桿菌或其他大腸菌群細(xì)菌作陽(yáng)性和陰性對(duì)照。6.3記錄EC肉湯管的產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣管為糞大腸菌群試驗(yàn)陽(yáng)性；不產(chǎn)氣管為糞大腸菌群試驗(yàn)陰性。6.4 結(jié)果報(bào)告：按產(chǎn)氣管

7、數(shù)，查 MPN 表報(bào)告每克 （毫升）樣品中糞大腸菌群的 MPN 值。7 大腸桿菌測(cè)定7.1將6.3條中的EC肉湯管繼續(xù)培養(yǎng) 24h，取其產(chǎn)氣管的培養(yǎng)物劃線接種于伊紅美藍(lán)（EMB）平板，36±1 C培養(yǎng) 24±2h。7.2 檢查平板上有無(wú)具黑色中心有光澤或無(wú)光澤的典型菌落。7.3 如有典型菌落，則從每個(gè)平板上至少挑取2 個(gè)典型菌落；如無(wú)典型菌落，則從每個(gè)平板上至少挑取2 個(gè)可疑36±1C 培養(yǎng) 1824h。菌落。用接種針接觸菌落中心部位，移種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，7.4 將斜面培養(yǎng)物移種到下列培養(yǎng)基中進(jìn)行生化試驗(yàn)。7.4.1色氨酸肉湯：在 36±1C培養(yǎng)24&

8、#177;2h后，力n Kovacs氏試劑0.20.3mL，上層出現(xiàn)紅色為靛基質(zhì)陽(yáng)性反應(yīng)。7.4.2 MR VP培養(yǎng)基；在 36±1C培養(yǎng)48±2h。以無(wú)菌操作移取培養(yǎng)物1mL至13mm< lOOmm試管中，力n 5%a萘酚乙醇溶液0.6mL，40%氫氧化鉀溶液 0.2mL和少許肌酸結(jié)晶，振搖試管后靜置2h，如出現(xiàn)伊紅色，為 VP試驗(yàn)陽(yáng)性。將MR VP培養(yǎng)物的剩余部分再培養(yǎng) 48h滴加5滴甲基紅溶液。如培養(yǎng)物變紅色， 為甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性， 若變黃色 則為陰性反應(yīng)。7.4.3 Koser氏枸椽酸鹽肉湯：于 36±1C培養(yǎng)96h記錄有無(wú)生長(zhǎng)。7.4.4 LST肉湯

9、：于30 ±1 C培養(yǎng)48±2h，觀察試管中是否產(chǎn)氣。7.4.5革蘭氏染色：取18h營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭氏染色。大腸桿菌為革蘭氏陰性。7.4.6 大腸桿菌與非大腸桿菌生化鑒別如下：靛基質(zhì)MRVP枸椽酸鹽鑒定（型別）典型大腸桿菌-+-非典型大腸桿菌+-+典型中間型-+-+非典型中間型-+典型產(chǎn)氣腸桿菌+-+非典型產(chǎn)氣腸桿菌如出現(xiàn)上表以外的生化反應(yīng)類型，表明培養(yǎng)物可能不純，應(yīng)重新劃線分離，必要時(shí)做重復(fù)試驗(yàn)。7.5 結(jié)果報(bào)告：大腸桿菌為革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，IMViC 試驗(yàn)為 +-或-+- ，再根據(jù) LST肉湯陽(yáng)性管數(shù)查 MPN 表，報(bào)告每克 （毫升 ）樣品

10、中大腸桿菌 MPN 值。8 大腸菌群固體培養(yǎng)基測(cè)定法8.1 樣品制備同第 4章。8.2 計(jì)數(shù)8.2.1 選取適宜的三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品液，每個(gè)稀釋度接種兩個(gè)滅菌平皿，每皿1mL 。另取 lmL 稀釋劑加入一個(gè)滅菌平皿中，作空白對(duì)照。8.2.2將冷至45±0.5C的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）1015mL傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻。8.2.3 待瓊脂凝固后，再加 3 4mLVRBA 覆蓋平板表層。824翻轉(zhuǎn)平板，置于 36±IC培養(yǎng)1824h。8.2.5 選用有 30150 個(gè)菌落的平板，計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型大腸菌群菌落。 色的膽鹽沉淀環(huán)。菌落

11、直徑為 0.5mm 或更大。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅8.2.6 證實(shí)8.2.6.1 從 VRBA 平板上挑取 10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落， 移種于 觀察產(chǎn)氣情況。BGLB肉湯管內(nèi)，36±1 C培養(yǎng)24h和48h ,8.2.6.2 將出現(xiàn)產(chǎn)氣的肉湯管判為大腸菌群陽(yáng)性。對(duì)形成菌膜的陽(yáng)性管，應(yīng)進(jìn)行革蘭氏染色， 以便排除革蘭氏陽(yáng)性桿菌。8.2.7 結(jié)果報(bào)告 經(jīng)最后證實(shí)為陽(yáng)性 （產(chǎn)氣，革蘭氏陰性桿菌 ）的試管百分比乘以于 8.2.5 條中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)， 即為每克 （毫升）樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液ImL，在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取

12、其中10個(gè)接種BGLB肉湯管，證實(shí)有 6 個(gè)陽(yáng)性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：1006/ 10X104/ g(mL) = 6.0 X05 /g(mL)附錄A 培養(yǎng)基和試劑（補(bǔ)充件）A1月桂基硫酸鹽胰蛋白（LST）肉湯胰蛋白或胰酪胨 (Trypticase)20g氯化鈉5.0g乳糖5.0g磷酸氫二鉀(K2HPO4)2.75g磷酸二氫鉀(KH2P04)2.75g月桂基硫酸鈉0.1g蒸餾水1000.0mL將各成分溶解于蒸餾水中。分裝到有倒立發(fā)酵管的20mX 150mm試管中，每管 10mL。121 C高壓滅菌 15min。最終 pH6.8±0.2。A2 煌綠乳糖膽鹽 （BGAB） 肉湯 蛋白

13、胨10.0g乳糖牛膽粉 (oxgall 或 oxbile) 溶液200.0mL0.1煌綠水溶液 蒸餾水13.3mL將蛋白胨乳糖溶于約500mL蒸餾水中，加入牛膽粉溶液200mL（將20.0g脫水牛膽粉溶于200mL蒸餾水中，pH7.07.5），用蒸餾水稀釋到濾后，分裝到20mr«975mL，調(diào)PH7.4。再加入0.1 %煌綠水溶液13.3mL，用蒸餾水補(bǔ)足到 1000mL，用棉花過(guò)150mm試管（管內(nèi)有倒立的小發(fā)酵管 ）中，每管10mL。121 C高壓滅菌15min。最終pH7.2±0.1。A3 EC 肉湯胰蛋白 或胰酪20.0g3 號(hào)膽鹽或混合膽鹽1.5g乳糖5.0g磷酸

14、氫二鉀(KH2P04)4.0g磷酸二氫鉀(KH2P04)1.5g氯化鈉5.0g蒸餾水1000.0mL將以上成分溶解于蒸餾水中，分裝16mr« 150mm試管（管內(nèi)有倒立的小發(fā)酵管），每管8mL。121 C高壓滅菌 15min，最終pH6.9也。1A4 伊紅美藍(lán)瓊脂 （EMB）蛋白胨10.0g乳糖10.0g磷酸氫二鉀(KH2P04)2.0g瓊脂15.0g伊紅Y水溶性）0.4g 或 2水溶液 20mL美藍(lán) 0.065g 或 0.5水溶液13mL蒸餾水1000.0mL10.0g3.0g5.0g瓊脂15.0g蒸餾水1000.0mL將各成分加于蒸餾水中，煮沸溶解。分裝合適的試管。121 C高壓

15、滅菌15min。最終pH7.3±0.1。滅菌后擺成斜面在 1 000rL 蒸餾水中煮沸溶解蛋白胨、 磷酸鹽和瓊脂， 加水補(bǔ)足至原量。 分裝于三角燒瓶中。 每瓶 100rL 或 200rL ，高壓滅菌15min。最終pH7.1 ±0.2。使用前將瓊脂融化，于每100mL瓊脂中加5mL滅菌的20%乳糖水溶液、2mL的2%伊紅Y水溶液和1.3mL0.5 %的美藍(lán)水溶液，搖勻，冷至4550C傾注平皿。A5 營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面 牛肉膏 蛋白胨備用。A6 色氨酸肉湯 胰胨或胰酪胨 10.0g蒸餾水 1000.0rL加熱攪拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸餾水中。分裝試管，每管5mL。121 C高壓滅菌

16、15min。最終 pH6.9±0.2。A7 MR-VP 培養(yǎng)基7.0g葡萄糖5.0g磷酸氫二鉀(K2HPO4)5.0g蒸餾水1000.0mL將各成分溶于蒸餾水中，分裝試管，121 C高壓滅菌15min，最終 pH6.9±0.2。A8 Koser 氏枸椽酸鹽肉湯磷酸氫銨鈉 (NaNH4HPO4?4H2O)1.5g1.0g0.2g磷酸氫二鉀 (K2HPO4) 硫酸鎂 (MgSO4?7H2O)枸椽酸鈉 (含 2H2O)3.0g蒸餾水1000.0mL將各成分溶解于蒸餾水中，分裝試管，每管10mL ，121 C高壓滅菌 15min。最終 pH6.7±0.2。A9 結(jié)晶紫中性

17、紅膽鹽瓊脂 (VRBA)蛋白胨7.0g酵母膏3.0g乳糖10.0g氯化鈉5.0g膽鹽或3 號(hào)膽鹽1.5g中性0.03g結(jié)晶紫0.002g瓊脂15 18g蒸餾水1000.0mL將上述成分溶于蒸餾水中， 靜置幾分鐘，充分?jǐn)嚢?，調(diào)至PH7.4±0.1。煮沸2min ,將培養(yǎng)基冷 4550 C傾注平板。臨用時(shí)制備，不得超過(guò) 3hA1O Butterfield 氏磷酸鹽緩沖稀釋液貯存液磷酸二氫鉀 (K2HPO4)34.0g蒸餾水500mL將磷酸二氫鉀溶于蒸餾水中，用 lmol釋液取貯存液1.25mL，用蒸餾水稀釋至L氫氧化鈉約175mL調(diào)至PH7.2。用蒸餾水加至lOOOmL貯存于冰箱。稀10

18、00mL，分裝于合適容器后，121 C高壓滅菌15min。A11 生理鹽水氯化鈉8.5g蒸餾水1000.0mL95乙醇20.0mL1 草酸銨水溶液80.OmL將氯化鈉溶于蒸餾水中， 121 C高壓滅菌15min。A12 革蘭氏染色液 結(jié)晶紫染色液：1.0g結(jié)晶紫將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。革蘭氏碘液：1.0g2.0g碘化鉀蒸餾水300.0mL300mL 。將碘與碘化鉀先行混合，加入蒸餾水少許充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至沙黃沙黃復(fù)染液：0.25g95乙醇10.0mL蒸餾水90.0mL將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。染色法a. 將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染液，

19、染1min ，水洗。b. 滴加革蘭氏碘液，作用 lmin ，水洗。c.滴加95%乙醇脫色約1530s，直至染色液被洗掉，不要過(guò)分脫色，水洗。d 滴加復(fù)染液，復(fù)染 lmin ，水洗、待干、鏡檢。 結(jié)果：革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。A13 Kovacs 氏靛基質(zhì)試劑對(duì)二甲氨基苯甲醛5.0g戊醇75.0mL鹽酸 （濃 ）25.0mL95乙醇300mL將對(duì)二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中，然后慢慢加入濃鹽酸即可。A14 甲基紅指示劑0.1g甲基紅無(wú)水乙醇100.0mL將甲基紅溶解于 300mL 乙醇中，加水稀釋至 500mL 。A15 Voges P roskauer(V P)試劑甲液5.0ga-萘酚乙液氫氧化鉀40.0g用蒸餾水加100.OmL附錄B1g檢樣中最近似值（MPN）表 （補(bǔ)充件）使用三管法，接種量分別為0.1 ， 0.01