DC細(xì)胞制備標(biāo)準(zhǔn)操作程序

1、C 細(xì) 胞 制 備 標(biāo) 準(zhǔn) 操 作 程 序目的和范圍：1.1 目的：規(guī)范DC細(xì)胞培養(yǎng)操作流程，保證細(xì)胞產(chǎn)品制備的穩(wěn)1.2定性、均一性。范圍：適用于實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)人員DC細(xì)胞培養(yǎng)的全過(guò)程。原理：2.1外周血PBMC經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)可分化為 DC細(xì)胞。相關(guān)文件：3.1CIK 細(xì)胞制備標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程記錄4.1DC-CIK細(xì)胞制備記錄。物料：5.1試劑：75%酒精，碘伏，生理鹽水，淋巴細(xì)胞分離液 （ Ficoll ），GT-T551培養(yǎng)基，自體血清，DC因子-1 , DC因子-2，腫瘤蛋白等。5.2儀器設(shè)備：生物安全柜，離心機(jī)，水浴鍋，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱， 電動(dòng)移液槍， 10ul 移液槍， 醫(yī)用剪刀，

2、 醫(yī)用止血鉗，試管架。5.3耗材：T25 培養(yǎng)瓶(25cmFlask ) , T75 培養(yǎng)瓶(75cFlask )15ml 離心管， 50ml 離心管， 5ml 移液管， 10ml 移液管， 200ul槍頭。6 職責(zé)：6.1細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)人員應(yīng)嚴(yán)格按照本規(guī)程的規(guī)定進(jìn)行DC細(xì)胞培養(yǎng)操作。6.2QA負(fù)責(zé)監(jiān)督細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)人員的操作全過(guò)程，確保DC細(xì)胞培養(yǎng)操作的規(guī)范性。6.3審核人負(fù)責(zé)保證本規(guī)程的審核和全過(guò)程準(zhǔn)確有效。7 工作程序：7.1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：7.1.1 潔凈區(qū)需經(jīng)過(guò)紫外線照射，連續(xù)照射時(shí)間不得低于30min. ，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中風(fēng)機(jī)始終保持開(kāi)啟狀態(tài)。7.1.2生物安全柜需經(jīng)過(guò)開(kāi)機(jī)紫外線照射， 連續(xù)照

3、射時(shí)間不得低于30min。并且開(kāi)啟生物安全柜玻璃防護(hù)窗，待生 物安全柜內(nèi)部氣流穩(wěn)定后，才可使用。7.1.3 將實(shí)驗(yàn)所需器械放于物料傳遞窗進(jìn)行紫外照射，械必須是經(jīng)過(guò)高壓滅菌鍋消毒滅菌，并且在合格期以 內(nèi)）照射完畢后將器械盒用酒精進(jìn)行擦拭消毒后，放入 生物安全柜中備用。7.1.4 單核細(xì)胞分離液（ Ficoll ），培養(yǎng)基，應(yīng)提前準(zhǔn)備好放入生物安全柜中，以便其回復(fù)常溫，否則將會(huì)影響實(shí) 驗(yàn)效果。7.1.5 DC因子-1及DC因子-2在使用時(shí)置于冰塊上方，即用即取，禁止在常溫下長(zhǎng)期放置。7.2 分離培養(yǎng)7.2.1 按照 CIK 田胞制備標(biāo)準(zhǔn)操作程序所述的方式分離提取 PBMC。7.2.2 接種：7.2

4、.2.1 用 GT-T551 培養(yǎng)基（加 10%自體血清）調(diào)整田胞濃度為 56 106/ml ，鋪入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，標(biāo)記， 水平放入37 C, 5%Ca田胞培養(yǎng)箱內(nèi)，若非透氣孔培養(yǎng)瓶，應(yīng)擰松瓶蓋一圈。7.2.2.2 -3 小時(shí)后 （擰緊瓶蓋），取出，（注意輕拿輕放）經(jīng)消毒后放入生物安全柜中。7.2.2.3 沿培養(yǎng)瓶反面將細(xì)胞懸液全部倒入離心管中。7.2.2.4 用 5mlGT-T551 培養(yǎng)基（加 10%自體血清）刷洗培養(yǎng)瓶，涮洗液也倒入離心管中。7.2.2.5 離心管中細(xì)胞懸液做 CIK 培養(yǎng)（詳細(xì)步驟參照CIK 田胞制備標(biāo)準(zhǔn)操作程序 ）。7.2.2.6 沿原培養(yǎng)瓶反面加入 10mlGT-T5

5、51 培養(yǎng)基（加10%自體血清）。7.227 加入DC因子-1，分裝量10ul/支，每10ml培養(yǎng)基可添加 1 支（培養(yǎng)基不足 10ml 時(shí)按比例添 加）。7.2.2.8 標(biāo)記，水平放入 37C, 5%CO細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。7.3 換液：7.3.1第一次直接加液5ml，換液方式如下:7.3.1.1 準(zhǔn)備耗材至生物安全柜： 15ml 離心管 1 個(gè)，GT-T551培養(yǎng)基（加10%自體血清），DC因子-1 ;7.3.1.2 7 步驟。7.3.1.3 從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，將離心管中培養(yǎng)基沿反面倒入培養(yǎng)瓶。7.3.2 第二次開(kāi)始半量換液，換液方式如下:7.3.2.17.3.2.2從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，

6、用移液管取半量培養(yǎng)基至15ml 離心管中7.3.2.31200rpm， 8min ，去上清，加入已配制的培養(yǎng)基，重懸，混勻。7.3.2.4 沿培養(yǎng)瓶反面倒入培養(yǎng)瓶中，轉(zhuǎn)移至CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱。7.424h后添加DC因子-2 :分裝10ul/支，每20ml培養(yǎng)基可添加 1 支（培養(yǎng)基不足 20ml 時(shí)，可按體積比例進(jìn)行添加）。7.5 DC成熟后（一般約24h），將DC細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至 CIK細(xì)胞懸液中共培養(yǎng)。7.5.1核對(duì)CIK細(xì)胞培養(yǎng)袋信息是否與 DC細(xì)胞信息相符。7.5.27.5.3輕拍DC細(xì)胞培養(yǎng)瓶，使DC細(xì)胞完全懸浮，懸液倒入注射器中或移液管轉(zhuǎn)移至 CIK 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。7.5.4 用 5

7、-10ml 培養(yǎng)基（含 10%血清）涮洗培養(yǎng)瓶，并沖洗細(xì)胞培養(yǎng)面，涮洗液也倒入注射器中或 CIK培養(yǎng)瓶中。7.5.5 移去注射器，擰緊蓋子，標(biāo)記，放入CO細(xì)胞培養(yǎng)箱。7.5.6 填寫(xiě)相關(guān)記錄，清場(chǎng)。7.6 DC細(xì)胞收集回輸：當(dāng) DC細(xì)胞直接用于回輸時(shí)按以下步驟。7.6.1復(fù)核DC細(xì)胞是否與回輸計(jì)劃信息相符。7.6.2取樣本，經(jīng)酒精擦拭后放入生物安全柜。7.6.3取 50ml 離心管，標(biāo)記，打開(kāi)離心管管蓋。7.6.4輕拍DC細(xì)胞培養(yǎng)瓶，使DC細(xì)胞完全懸浮，懸液倒入7.6.5離心管中。用 5-10ml 生理鹽水涮洗培養(yǎng)瓶， 并沖洗細(xì)胞培養(yǎng)面，涮洗液也倒入離心管中，1200rpm， 8min 。7.

8、6.6 去上清，加入 45ml生理鹽水重懸，取 0.5ml中間層細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)及活率。7.6.71200rpm, 8min，用15ml 離心管取 15ml 上清做內(nèi)毒素、革蘭氏檢測(cè)并留樣，其余上清廢棄。7.6.8 用生理鹽水和自體血清重懸細(xì)胞至20ml （如無(wú)自體血清，用 5ml 人血白蛋白和 15ml 生理鹽水重懸細(xì)胞至20ml）。7.6.9 轉(zhuǎn)袋。（參照 CIK 細(xì)胞制備標(biāo)準(zhǔn)操作程序）7.6.10 用 10ml 生理鹽水涮洗離心管，涮洗液也轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)移袋或生理鹽水瓶。7.6.11 填寫(xiě)相關(guān)記錄，清場(chǎng)。7.7 微生物檢測(cè)控制點(diǎn)與回輸質(zhì)量控制：7.7.1 細(xì)胞接種前取單核細(xì)胞最后一次清洗上清2ml 液做微生物檢測(cè) （ 細(xì)菌培養(yǎng)和真菌培養(yǎng) ）7.7.2 細(xì)胞回輸前3-4天取樣在培養(yǎng)的細(xì)胞懸液 2ml做微生物檢測(cè)（細(xì)菌培養(yǎng)和真菌