醫(yī)藥PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期PROTOCOL共3

1、【醫(yī)藥】PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期 PROTOCOL共3頁(yè)）PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期protocol1、離心收集細(xì)胞，棄上清，用預(yù)冷 PBS洗細(xì)胞兩次。2、加入預(yù)冷70聽醇，于4?固定過(guò)夜，或-20?長(zhǎng)期固定（4?過(guò)夜一般隔天就進(jìn) 行檢測(cè)，如果想推遲幾天測(cè)，那就保存在-20?，有資料說(shuō)-20?可以保存一個(gè)月，個(gè) 人建議盡量在最短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)，有些實(shí)驗(yàn)是在不同時(shí)間點(diǎn)上收細(xì)胞，這時(shí)我就等最后一次固定完了一塊測(cè)，基本上也多在一周內(nèi)檢測(cè)完畢，沒(méi)有特地去比較保存時(shí)間 對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響）。3、細(xì)胞染色離心收集細(xì)胞，以1mL的PBS洗細(xì)胞一次，加入 500uLPBS含50ug/mL溴化乙 錠（PI），100ug/mL

2、RNase A, 0.2% Triton X-100）4? 避光孵育 30 分鐘（PI 我是直 接用PBS配成工作濃度，然后加入細(xì)胞沉淀混勻， RNA酶現(xiàn)加，但有時(shí)不加發(fā)現(xiàn)對(duì) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果也沒(méi)太大的影響）。4、流式分析以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，一般計(jì)數(shù) 2-3萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析。分析時(shí)，使用FL2-W和FL2-A顯示，去除聯(lián)體細(xì)胞，具體如下圖。- - 9 - - - - k - - kLZ-'RV細(xì)胞周期流式后一般分為 G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在 G0/G1期 前面有個(gè)凋亡峰（也稱sub-G0期）,而如果分析時(shí)細(xì)胞窗口沒(méi)設(shè)置好，可能在最

3、前面t t it T 廠丁 - 11t nr社和*畀申L甘-占LSOftFlf P2 « 02T還有細(xì)胞碎片峰fwrs ”T：i畀 a?4 EFJfi財(cái) J IS 皿了 TVi，1 rv,- f “嚇OiDl>d 1 0£ CK? TDIG M Z9X*r JS 7C DI 諒：13.0? *41 9! 4S 釧.豈：5 5i&t*L.ls >PIWH：芒.殆戈 伽 |i*D 0 I? W吋 fl. 413 S "t J”-3 1心 % lF"T“rnW If, a i ev>*er- i m耳i 嚴(yán) |c T "&#

4、39; h Ki C F± nN I £ - 3 KS l.*O>結(jié)果解讀G0/G1期細(xì)胞占總的61.2%,峰位于橫座標(biāo)的45.76G2/M期占13.07，峰位于橫座標(biāo)的91.43S期占25.73G2/G1為2.0（即G2期為4倍體細(xì)胞，而G1期為2倍體細(xì)胞，比值為2）峰的變異系數(shù)為4.54%（好）細(xì)胞碎片為0.48%,細(xì)胞聚集體有0.06%?？偟募?xì)胞數(shù)（儀器檢測(cè)到的）為17525個(gè)，在細(xì)胞周期中分析的細(xì)胞數(shù)為17431個(gè)（即排除了碎片及聚集體后）CV是變異系數(shù)。一般CVK小，峰形越好，越尖銳。能控制在5流右是比較好的結(jié)果，一般小于10%t可以認(rèn)可了。Flow Cyt

5、ometric Analysis of Cell Cycle Fixation61) Collect 2 x 10 cells.2) Pellet cells by spinning at 1,000 rpm, 4?C for 5 minutes.3) Resuspend cell pellet in 1 ml of cold PBS. 4) Fix cells by adding4 ml of -20?C absolute ethanol. 5) Store cells at -20?C in this fixationbuffer until ready for analysis. (No

6、more than 2 weeks)Staining6) Centrifuge (as above) fixed cells and resuspend pellet in 1 ml ofPBS.7) Add 100 卩 l of 200 卩 g/ml DNas-eree, RNaseA and incubate at 37?C for 30 minutes.8) Add 100 卩 l of 1 mg/ml propidium iodide (light sensitive) and incubateat room temperature for 5-10 minutes.9) Place

7、samples in 12 X 75 Falcon tubes and read on BectonDickinsonFACStarPLUS.PI 染液配制(100ml):PI 5mg、RNase 2mg 1.0%Triton X-100 0.25ml 、生理鹽 水 65ml、枸櫞酸納100mg加蒸餾水至100ml，調(diào)pH值7.2-7.6，用棕色瓶子分裝，4? 避光保存。注意事項(xiàng) :1 在細(xì)胞固定時(shí)一定要將細(xì)胞吹開，吹成單細(xì)胞 ;2 固定液 :70%酒精 要在-20 預(yù)冷 ;3 細(xì)胞要選用活力高的。流式細(xì)胞 PI 單染中為什么用 RNAse,在測(cè)細(xì)胞周期時(shí)，因?yàn)橐呀?jīng)在細(xì)胞膜打孔了，PI很容易透

8、過(guò)細(xì)胞膜和DNA吉合，但 RNA也是核酸，也會(huì)被染色，為避免干擾染色前需用RNAse筆解RNA。這樣PI只染 DNA，能精確以熒光強(qiáng)度反映DNA勺含量。做流式細(xì)胞時(shí)， PI 染色， PI 的濃度應(yīng)該是多少 ?還有就是 400 目的篩網(wǎng)是什么 100ug/ml ，一般用 400目勺篩網(wǎng)是用來(lái)將粘在一起勺細(xì)胞團(tuán)濾掉勺，否則會(huì)出 現(xiàn)人為勺多倍體干擾，分析勺時(shí)候需要勺是單個(gè)勺細(xì)胞，不過(guò)如果經(jīng)驗(yàn)豐富也 可以 gate 掉勺。如果你沒(méi)有條件，建議在染色之前將細(xì)胞彈勺很散，再進(jìn)行染色PI 勺配置deardeer:PI 怎樣配制, 怎樣保存 , 有勺文獻(xiàn)說(shuō)要用檸檬酸鈉溶解，這對(duì)實(shí)驗(yàn)有 影響嗎, 如果不這樣，那

9、直接加入而不用檸檬酸鈉溶解可以嗎 ,an dywa ng:我用來(lái)做流式的 PI配制方法是：5mg PI +0.1ml Trit on X-100 +3.7mg EDTA +10ml PBS,4度避光保存。為儲(chǔ)存液，用時(shí)稀釋 10倍。任脈 任脈二四會(huì)陰曲，中極關(guān)元石門居，氣海陰交入神闋，水分下脘連建里，中脘 上脘巨闋平，鳩尾中庭膻中行，玉堂紫宮連華蓋，璇璣天突廉泉承。督脈督脈二八起長(zhǎng)強(qiáng)，腰俞陽(yáng)關(guān)命門當(dāng)，懸(L1)脊中(T11)連中樞(T10)，筋縮(T9) 至陽(yáng)靈臺(tái) (T6)上，神道（T5）身柱（T3）陶道（T1）行，大椎啞門風(fēng)府中，腦戶強(qiáng)間上后頂，百會(huì) 前頂囟會(huì)從，上星神庭素髎過(guò)，水溝兌端齦交

10、中。肺經(jīng)肺經(jīng)十一中府云，天府 （下3）俠白（下4）尺澤深，孔最 （上7）列缺經(jīng)渠涉，太淵 魚際少商尋。 心經(jīng)心經(jīng)穴位九穴真，極泉青靈 （上3）少海深，靈道通里陰郄至，神門少府少?zèng)_尋。 心包經(jīng)心包經(jīng)計(jì)九穴整，天池天泉 （ 下 2） 曲澤行，郄門間使內(nèi)關(guān)入，大陵勞宮及中沖。 大腸經(jīng)大腸二十起商陽(yáng)，二間三間合谷旁，陽(yáng)溪偏歷 （上3）溫溜（上 5）過(guò)，下廉上廉 三里上，曲池肘髎手五里，臂臑肩髃巨骨當(dāng)，天鼎扶突禾髎香。小腸經(jīng)小腸經(jīng)計(jì)十九整，少澤前谷后溪行，腕骨陽(yáng)谷可養(yǎng)老，支正（上5）小海過(guò)肩貞，臑俞天宗及秉風(fēng)，曲垣肩外俞（T1旁3）肩中（C7旁2）,天窗天容上顴醪,最后一 穴是聽宮。 三焦經(jīng)三焦穴位二十

11、三，關(guān)沖液門中渚滿，陽(yáng)池外關(guān)支溝配，會(huì)宗三陽(yáng)（上4）四瀆（下5）連，天井續(xù)接清冷淵 （天井上 1），消濼臑會(huì) （肩髎下 3）肩髎懸，天髎 （肩井連曲垣 中點(diǎn)）天牖起翳風(fēng)，瘛脈顱息角孫同，耳門和髎絲竹空。胃經(jīng)胃經(jīng)穴位四五整，承泣四白巨髎經(jīng)，地倉(cāng)大迎下頰車，下關(guān)頭維過(guò)人迎，水突 氣舍下缺盆，氣戶庫(kù)房屋翳深，膺窗乳中連乳根，不容承滿及梁門，關(guān)門太乙滑肉 門，天樞外陵大巨輪，水道歸來(lái)連氣沖，髀關(guān)伏兔陰市中，梁丘犢鼻足三里，上巨 條口下巨豐，解溪沖陽(yáng)陷谷旁，內(nèi)庭厲兌經(jīng)穴終。膀胱經(jīng)膀胱六七起睛明，攢竹眉沖曲差 （上 0.5 旁 1.5） 行，五處（上 1）承光（上2.5） 上 通天（上4），絡(luò)卻（上5.5

12、）玉枕（后上2.5旁1.3）天柱（旁1.3）擎，大杼（T1旁1.5） 風(fēng)門肺俞連，厥陰心督膈肝膽，脾胃三焦腎氣海，大腸關(guān)元小腸懸，膀胱中膐白環(huán) 繞，上髎次髎中下髎，會(huì)陽(yáng)承扶殷門 （下 6）過(guò)，浮郄委陽(yáng)委中高。 附分魄戶膏肓 輸，神堂譩僖膈關(guān)入 , 魂門陽(yáng)綱過(guò)意舍，胃?jìng)}肓門志室住，胞肓秩邊連合陽(yáng)，承筋 （下 5）承山及飛揚(yáng)，跗陽(yáng) （上 3）昆侖仆參居，申脈金門京骨束，通骨至陰經(jīng)穴已。膽經(jīng) 膽經(jīng)四四瞳子髎，聽會(huì)上關(guān)頷厭好，懸顱懸厘連曲鬢，率谷天沖浮白繞，竅陰 完骨本神 （上 0.5 旁 3）妙，陽(yáng)白臨泣 （上 0.5 旁 2.25） 目窗（上 1.5） 高，正營(yíng)（上 2.5） 承靈（上 4）連腦空

13、（后上 2.5） ，風(fēng)池肩井淵液 （腋下 3 肋 4）中，輒筋 （淵液前 1）日月 （肋 7旁 4）京門當(dāng)，帶脈五樞維道行，居髎環(huán)跳過(guò)風(fēng)市，中瀆 （上 5）陽(yáng)關(guān)陽(yáng)陵交 （上 7），外丘（上 7）光明陽(yáng)輔高，懸鐘丘墟足臨泣，地五俠溪竅陰了。脾經(jīng)脾經(jīng)穴位二十一，隱白大都太白抵，公孫 （一跖骨基底節(jié)前下 ）商丘三陰交，漏 谷（踝尖連陰陵，上 6）地機(jī)（踝尖連陰陵，下 3）陰陵系，血?；T （血海上 6）沖門 （旁 3.5） 升，府舍（臍下 4旁 4）腹結(jié)（下 1.3） 大橫排，腹哀 （上 3）食竇（肋 5 間旁 6） 連天溪（肋 4 間旁 6），胸鄉(xiāng)（肋 3）周榮（肋2）大包（肋 6間腋中）來(lái)。腎經(jīng)腎經(jīng)穴位二十七，涌泉然谷 （ 舟骨粗隆下 ） 與太溪，大鐘水泉 （ 太溪下 1） 及照 海，復(fù)溜 （太溪上 2）交信（溜前 0.5） 筑賓（溪上 5）系，陰谷（半腱半膜間 ）橫骨（臍下 5旁 0.5） 連大赫（下 4），氣穴四滿中注起，肓俞 （