EMSA試驗(yàn)成功的關(guān)鍵講義7完美版

1、EMSA 試驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素 :1.1. 試驗(yàn)設(shè)計(jì) ,主要是你用藥品刺激細(xì)胞時(shí) ,設(shè)計(jì)的藥品濃度和時(shí)間剃度的問(wèn) 題,這個(gè)很關(guān)鍵 , 很多同學(xué)不注意這一點(diǎn) ,最后試驗(yàn)確實(shí)是拿不到陽(yáng)性結(jié)果 比如我一前一個(gè)朋友用藥物處理 SGC7901 細(xì)胞 ,就是因?yàn)闀r(shí)間點(diǎn)設(shè)計(jì)的不 好 EMSA 試驗(yàn)結(jié)果是陰性的 , 后來(lái)根據(jù)自己藥品刺激的特性重新設(shè)計(jì)了刺 激時(shí)間剃度 , 最終得到陽(yáng)性結(jié)果 ! 所以這個(gè)設(shè)計(jì)很關(guān)鍵 ! 給一個(gè)個(gè)人的實(shí)驗(yàn)總結(jié)希望能幫助大家 : 一是受體結(jié)合類(lèi)的直接刺激激活 信號(hào)通路的方法，一般達(dá)到 EMSA 核轉(zhuǎn)運(yùn)高峰的時(shí)間比較短，大概控制在 30min-2h 之間， 很多時(shí)候都是在 45min 和

2、 1h 達(dá)到高峰， 當(dāng)然還有合適的 濃度！二是是你用的是藥物刺激產(chǎn)生受體可能時(shí)間會(huì)長(zhǎng)一些, 因?yàn)樗幬镞€有一個(gè)滲透和刺激產(chǎn)生細(xì)胞因子的過(guò)程 .時(shí)間可以長(zhǎng)一些 , 主要根據(jù)自己的 藥物刺激特性確定時(shí)間點(diǎn) .2. 核蛋白樣品的制備 ;制備蛋白樣品的關(guān)鍵是 :1. 注意用專(zhuān)用的和核蛋白抽提試劑來(lái)做 ,才能使制 備的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和構(gòu)像.2. 掌握好核蛋白的濃度和純度,尤其是濃度 . 能入核的蛋白本來(lái)就不是很多 , 所以核蛋白的濃度往往不 會(huì)很高 , 但是 EMSA 試驗(yàn)對(duì)核蛋白的濃度要求還是聽(tīng)高的! 一般要求在1ug/ul 以上 ! 有時(shí)候稍微低于這個(gè)數(shù)量級(jí)也可以 ,但是不能太低 ,否則

3、影響結(jié) 合反應(yīng)拿不到結(jié)果 . 這就要求核蛋白抽提盡量避免核蛋白的損失 . 同時(shí) ,一般制備核蛋白的材料為細(xì)胞和組織 , 細(xì)胞要比組織好做的多 ,最重 要的是用細(xì)胞得到核蛋白的純度比組織要高很多 . 而組織抽提后雜蛋白相對(duì)較多!雜蛋白多會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果不容易得到EMSA陽(yáng)性結(jié)果!3. 探針的制備 :又很多站友都在問(wèn)我生物素標(biāo)記到3'端還是 5'端 ,其實(shí)我覺(jué)得最好還是兩端都標(biāo)記 ,這樣才能更好的提高靈敏度 , 國(guó)內(nèi)的標(biāo)記技術(shù)我還不是很了解 , 我們這邊的探真都是國(guó)外定做的 ,還算可以 ,其制作程序如下 : 合成寡核苷 酸-標(biāo)記生物素 - 純化 -退火合成雙鏈 .也是一個(gè)比較復(fù)雜的過(guò)

4、程 .4. EMSA 實(shí)驗(yàn)技術(shù) . 這一點(diǎn)主要是操作的細(xì)節(jié)問(wèn)題 ! 下面會(huì)更細(xì)的談到 . 技術(shù)要點(diǎn) :關(guān)于技術(shù)要點(diǎn) ,我在這里只提一下關(guān)鍵的幾點(diǎn)需要注意的細(xì)節(jié)操作,其他的照正常程序就可以了 !1. 制膠 必須是非變性PAGE凝膠,我們實(shí)驗(yàn)室一般用6.5%的非變性膠.制 膠很重要,直接影響電泳的效果 !一般控制在 5分鐘凝固的效果 .10X TBE 1.0ml40% Acrylamide （40% 聚丙烯酰胺） 3.3ml50% Glycerol （50% 甘油） 1.0mldH20 （蒸餾水）14.8mlTEMED （四甲基乙二氨）20 口 l脫氣 10min10% AP （過(guò)硫酸氨）120

5、口 l總量 20.0ml2. 一般試劑盒包括的試劑l 10X Binding Buffer ( 10X 結(jié)合反應(yīng)液) (-20 oC)l Poly (dI:dC) (dI:dC) (聚核苷酸競(jìng)爭(zhēng)物) (-20 oC)l 6X Loading Buffer (10X 上樣緩沖液) (4 oC)l Cold oligonucleotides (非標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性寡核苷酸) (-20 oC)l Biotin-Labeled Probe (生物素標(biāo)記探針) (-20 oC)l Streptavidin-HRP (鏈霉親核素 -HRP) (4oC)l 2BlockingBuffer(2 x圭寸閉液)(4 oC

6、)l 5WashingBuffer(5 x洗滌液)(4 oC)l Equilibration Solution (平衡液) (4 oC)l Binding-membrane (結(jié)合反應(yīng)膜) (RT)3. 結(jié)合反應(yīng)每次結(jié)合反應(yīng)需1-5 口1核蛋白(根據(jù)核蛋白濃度而定)，根據(jù)不同的核提取物濃度加入核提取物用量，用雙蒸蒸餾水將終體積調(diào)節(jié)到15 口 l( 1 ) 結(jié)合反應(yīng)體系：10X結(jié)合反應(yīng)液1.5 口 lPoly(dl:dC)(dl:dC) 1.0口 l細(xì)胞核提取物*?卩l(xiāng)雙蒸水* ?卩l(xiāng)混勻室溫靜置 20 分鐘生物素標(biāo)記的探針 0.5卩l(xiāng)總量15 口 l混勻室溫靜置 20 分鐘或以上。2 )特異性

7、反應(yīng)確認(rèn)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系：10X結(jié)合反應(yīng)液1.5 3 lPoly(dl:dC)(dl:dC) 1.03 l細(xì)胞核提取物 ?3 l未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)性寡核 2.03 l 雙蒸水 * ?3 l混勻室溫靜置 20 分鐘 生物素標(biāo)記的探針 0.53 l 總量 153 l 混勻室溫靜置 20 分鐘或以上。 其中: 探針用量 : 這相當(dāng)于 10-50fmoles 的 DNA 探針。我們通常是最少 50fmol. 蛋白樣品用量:一般用量在2-20ug(控制在1-5 3 l蛋白，總體系15ul.細(xì) 胞核抽屜物濃度都比較低 ,組織的一般都比較高 ,因?yàn)殡s蛋白較多 . poly(dl:dC)(dl:dC):它由肌苷和胞嘧啶

8、組成。 由于其特定的結(jié)構(gòu)， 可抑制蛋白對(duì)標(biāo)記探針的非特異結(jié)合，避免假?gòu)?fù)合物。 在凝膠遷移反應(yīng)中加 入 poly(dl:dC)(dl:dC) ，可抑制粗制核抽提液中其它 DNA 結(jié)合蛋白結(jié)合， 比如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的非特異結(jié)合。當(dāng)用純化的蛋白作凝膠遷移反應(yīng)時(shí)，不 必一定加入 poly(dl:dC)(dl:dC) ，如加入，則普通反應(yīng)中所用終濃度不超 過(guò) 50-100ng 。對(duì)核抽提液 :每 2-3ug 核抽提液用 1 ug poly(dl:dC)(dl:dC) 。 未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)性寡核 : 做為競(jìng)爭(zhēng)的探真來(lái)說(shuō) ,其實(shí)就是沒(méi)有標(biāo)記的轉(zhuǎn)爐銀子的寡核苷酸 ,用量一般是正常探真的 50-100 倍. 再這里我

9、引申的解釋一其他的對(duì)照的含義.常規(guī)反應(yīng)（含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白+標(biāo)記探針）；陰性對(duì)照反應(yīng)（核蛋白+標(biāo)記探針）; 陽(yáng)性對(duì)照 （ 核蛋白標(biāo)記探針 ） 探針冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng) （含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白標(biāo)記探針標(biāo)記探針 100 倍量的未標(biāo)記探針 ）； 突變探針的冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng) （含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白標(biāo)記探針標(biāo)記探針 100 倍量的未標(biāo)記突變探針 ）； Super-shift 反應(yīng)（含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白標(biāo)記探針目的轉(zhuǎn) 錄因子的特異抗體 ）.4. 預(yù)電泳和電泳： 0.25X TBE 在冰上 120V 預(yù)電泳 1小時(shí); 務(wù)必?fù)Q掉預(yù)電泳的緩沖液，用新的0.25X TB低溫下150V，電泳約60

10、分鐘。 注意橫壓 電泳的時(shí)候注意電流的數(shù)字變化 ,記錄開(kāi)始電泳和電泳結(jié)束的電流數(shù)據(jù)的 變化!5. 電轉(zhuǎn)運(yùn)在0.5X TBE中390mA電轉(zhuǎn)移40分鐘，注意轉(zhuǎn)運(yùn)膜的選擇，有一種離子加 強(qiáng)型的轉(zhuǎn)運(yùn)效果比較好 ! 我當(dāng)初選擇過(guò)一般的和離子加強(qiáng)型的 ,還是離子 加強(qiáng)型結(jié)合效果好 !6. 紫外交聯(lián) : 正規(guī)的應(yīng)該是紫外交聯(lián)儀的使用,但是很多單位沒(méi)有交聯(lián)儀那就用無(wú)菌操作臺(tái)上的紫外等下 10cm 處交聯(lián) 10 分鐘就可以了 !這個(gè)數(shù)據(jù) 是我做了好多次試驗(yàn)才摸索出來(lái)的 !條件比較成熟 ! 可以借鑒 !7. 化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 包括 Blocking Buffer 30 分鐘封閉 , Streptavidin-HRP

11、 標(biāo)記 , Washing Buffer 洗滌; Equilibration Solution 平衡, 這些按照規(guī)定操作即可 ! 沒(méi)有太多的細(xì) 節(jié),只是注意兩點(diǎn),一是期間結(jié)合膜的表面一定不能干燥! 二是 Streptavidin-HRP 不能加在膜上 ,而是加在液體中混韻后在將膜放在液體中 孵浴.8. 化學(xué)發(fā)光圖像顯示兩種方法 : 化學(xué)發(fā)光數(shù)字成像與檢測(cè)和感光膠片沖印成像操作基本和 Western 試驗(yàn)操作相當(dāng) , 只是這個(gè)膜是一次性的 ,不能重復(fù)使 用 , 一定保存好圖片 ! 由于跑得是非變性凝膠 ,蛋白保持天然構(gòu)想和活性 , 所以代條很可能是一塊一塊的而不像 WB 那樣很規(guī)整的一條細(xì)線(xiàn) ,這個(gè)很 正常!希望大家交流討論 ! 雖然在學(xué)習(xí)的過(guò)程中會(huì)遇到許多不順心的事，但古人說(shuō)得好吃一塹，長(zhǎng)一智。多了一次失敗，就多了一次教訓(xùn)；多了一次挫折，就多了一次經(jīng)驗(yàn)。沒(méi)有失敗和挫折的人，是永遠(yuǎn)不會(huì)成功 的。 快樂(lè)學(xué)習(xí)并不是說(shuō)一味的笑，而是采用學(xué)生容易接受的快樂(lè)方式把知識(shí)灌輸?shù)綄W(xué)生的大腦里。因?yàn)榭鞓?lè)學(xué)習(xí)是沒(méi)有什么大的壓力的，人在沒(méi)有壓力的情況下會(huì)表現(xiàn)得更好。青春的執(zhí)迷和 堅(jiān)持會(huì)撐起你的整個(gè)世界，愿你做自己生命中的船長(zhǎng)，在屬于你的海洋中一帆風(fēng)順，珍惜生命并感受