質(zhì)粒DNA提取純化及驗(yàn)證

1、【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、掌握堿變性提取質(zhì)粒DNAy勺原理、過程及各種試劑的作用。2、掌握凝膠電泳對DN吩離純化的原理和方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】1、提取、純化質(zhì)粒DNA（堿變性提取法）提取和純化質(zhì)粒DNA勺方法很多，目前常用的有：堿變性提取法、煮沸法、 羥基磷灰石柱層析法、EB一氯化葩密度梯度離心法和 Wizard法等。其中，堿變 性提取法最為經(jīng)典和常用，適于不同量質(zhì)粒DNA勺提取。該方法操作簡單，易于 操作，一般實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行。提取的質(zhì)粒 DNA屯度高，可直接用于酶切、序列測 定及分析。堿變性提取質(zhì)粒DNA-般包括三個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞以擴(kuò)增質(zhì) 粒；收集和裂解細(xì)胞；分離和純化質(zhì)粒DNA。在細(xì)菌細(xì)胞中，染

2、色體DNAiZ雙螺旋結(jié)構(gòu)存在，質(zhì)粒DNAO共價(jià)閉合環(huán)狀形 式存在。細(xì)胞破碎后，染色體DNAffi質(zhì)粒DNA勻被釋放出來，但是兩者變性與復(fù) 性所依賴的溶液pH值不同。在pH值高達(dá)12. 0的堿性溶液中，染色體DNA勺氫 鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性；共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA勺大部分氫鍵斷裂，但 兩條互補(bǔ)鏈不完全分離。當(dāng)用pH值4. 6的KAc（或NaAc）高鹽溶液調(diào)節(jié)堿性溶液 至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNAM恢復(fù)原來的共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)而溶解于溶液 中；但染色體DNA能復(fù)性，而是與不穩(wěn)定的大分子 RNA蛋白質(zhì)一 SDSM合物 等一起形成纏連的、可見的白色絮狀沉淀。這種沉淀通過離心，與復(fù)性的溶于溶液

3、的質(zhì)粒DN的離。溶于上清液的質(zhì)粒 DNA可用無水乙醇和鹽溶液，使之凝聚 而形成沉淀。由于DNA與RNA性質(zhì)類似，乙醇沉淀 DNA的同時(shí)，也伴隨著 RNA沉淀，可利用RNaseA將RNA竄解。質(zhì)粒DNA容液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通過酚氯仿抽提除去，最后獲得純度較高的質(zhì)粒DNA。2、瓊脂糖凝膠電泳電泳 （ electrophoresis） 是帶電物質(zhì)在電場中向著與其電荷相反的電極方向移動(dòng)的現(xiàn)象。各種生物大分子在一定條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場中會(huì)向相反的電極移動(dòng)。凝膠是支持電泳介質(zhì)，它具有分子篩效應(yīng)。含有電解液的凝膠在電場中，其中的電離子會(huì)發(fā)生移動(dòng)，移動(dòng)的速度可因電離子的

4、大小、形態(tài)及電荷量的不同而有差異。利用移動(dòng)速度差異，就可以區(qū)別各種大小不同的分子。因而，凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化 DN*段，是分子生物學(xué)的核心技術(shù)之一。凝膠電泳技術(shù)操作簡單而迅速，分辨率高，分辨圍極廣。此外，凝膠中DNA的位置可以用低濃度熒光插入染料如澳化乙錠 （EB）或SYBR Gold染色直接觀察 到，甚至含量少至20 Pg的雙鏈DNAft紫外激發(fā)下也能直接檢測到。需要的話， 這些分離的DN標(biāo)帶可以從凝膠中回收，用于各種各樣目的的實(shí)驗(yàn)。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，常用的兩種凝膠為瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠。這兩種凝膠能灌制成各種形狀、大小和孔徑，也能以許多不同的構(gòu)型和方位進(jìn)行電泳。瓊脂糖凝膠電泳易

5、于操作，適用于核酸電泳，測定DNA勺相對分子質(zhì)量，分離經(jīng)限制酶水解的DNA>t段，進(jìn)一步純化DNA0瓊脂糖凝膠電泳是一種常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)。DNAt瓊脂糖凝膠中的電泳遷移速率主要取決于下面6 個(gè)因素：1）樣品DNA子的大?。弘娪緯r(shí)，線性雙螺旋DN的子是以頭尾位向前遷移的， 其遷移速度與相對分子質(zhì)量（ 所含堿基） 的對數(shù)值成反比，這是因?yàn)榇蠓肿佑懈蟮哪Σ磷枇Α?）DNA分子的構(gòu)象：相對分子質(zhì)量相同而構(gòu)象不同的 DN吩子，其遷移速率 不同。在抽提質(zhì)粒DNA1程中，由于各種因素的影響，使超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀 結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒 DNA（covalen

6、tly closed circular DNA, cccDNA）B一條鏈斷裂，變成開環(huán)DNA（open circle DNA , oeDNA分子，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就轉(zhuǎn)變?yōu)榫€ 狀DNA（1iner DNA, L DNA份子。這三種構(gòu)型的分子有不同的遷移率。一般情況 下，超螺旋型遷移速度最快，其次為線狀分子，最慢的是開環(huán)狀分子。3）瓊脂糖濃度：瓊脂糖濃度直接影響凝膠的孔徑，一定大小的DNAt段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的泳動(dòng)速度不同。通常凝膠濃度越低，則凝膠孔徑越大，DNAt泳遷移速度越快，因此，相對分子質(zhì)量越大，選用的凝膠濃度應(yīng)越低。4）電泳所用電場：低電壓條件下，線性DN*段的遷移速率與所用

7、電壓成正比，電壓越高，帶電顆粒泳動(dòng)越快，但隨著電場強(qiáng)度的增加，不同長度 DN呼動(dòng) 的增加程度不同，因此凝膠電泳分離DNA 勺有效圍隨著電壓上升而減少。為了獲 得DNAt段的最佳分離效果，電場強(qiáng)度應(yīng)小于 5 V/cmr5） 緩沖液： 緩沖液的組成和離子強(qiáng)度直接影響遷移率。當(dāng)電泳液為去離子水（ 如不慎誤用去離子水配制凝膠） ，溶液的導(dǎo)電性很少，帶電顆粒泳動(dòng)很慢，DNA幾乎不移動(dòng)；而在高離子強(qiáng)度下（如錯(cuò)用10X電泳緩沖液），導(dǎo)電性極高，帶電顆 粒泳動(dòng)很快，產(chǎn)生大量的熱，有時(shí)甚至熔化凝膠或使DN尬性。電泳時(shí)常用的緩 沖液有乙酸鹽（TAE、硼酸鹽（TBE劑磷酸鹽（TPE幾種不同的緩沖液，通常配制成10X

8、或5X的濃度母液保存于室溫下，用時(shí)稀釋至工作濃度。TAE緩沖液緩沖能力弱，長時(shí)間電泳緩沖能力逐漸喪失（陽極變堿性，陰極變酸性），長時(shí)間電泳需要更換緩沖液。TAEg沖液可以分離數(shù)KB長度的DNA在精致DNAt段以 及染色體DNA8行雜交時(shí)經(jīng)常使用6）溫度：瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，不同大小 DNA片段的相對電泳遷移率在 430無變化，一般瓊脂糖凝膠電泳多在室溫下進(jìn)行，而當(dāng)瓊脂糖含量少于0 5時(shí)，凝膠很脆弱，最好在4下電泳以增加凝膠強(qiáng)度。【實(shí)驗(yàn)儀器、材料及試劑】1、儀器和材料接種環(huán)， 培養(yǎng)皿， 酒精燈， 恒溫振蕩培養(yǎng)箱，高速冷凍離心機(jī)，漩渦振蕩器，微量移液器及多型號(hào)槍頭，微波爐，電泳儀等菌體：E.coli

9、 DH5a受體菌,具有Amp標(biāo)記的質(zhì)粒pUC19Maker:X / Hind III DNA Maker DL2000 DNA Maker點(diǎn)樣對照組：pUC19/ Hind II雙鏈線性DNA PUC19 （商品）入DNA2、實(shí)驗(yàn)試劑LB培養(yǎng)基，抗生素（氨葦青霉素），溶液I ,溶液H,溶液田，3mol/L NaAc 溶液，預(yù)冷無水乙醇，70猿醇溶液，RNaseA母液，TE緩沖液，飽和酚，氯仿/ 異戊醇混合液，酚/氯仿/異戊醇（PCI）混合液，TAE電泳緩沖液（10X）澳化乙 錠（EB）,上樣緩沖液（6X）溶液 I: 50mMi 萄糖，25mM Tris-HCl（pH 8.0） , 10mM E

10、DTA（pH 8.0。（1M Tris-HCl , 12.5ml pH 8.0; 0.5M EDTA10ml pH 8.0 ,葡萄糖 4.730g,力口 ddH2O 至500ml。在121c高壓滅菌15min ,貯存于4 C）0溶液H: 0.2M NaOH 1% SDS （使用前用10M的NaOHffi 10%勺SDS母液配 置，防止NaOHR收空氣中的H25口 CO2m減弱了堿性）。溶液田：5M醋酸鉀（KA。緩沖液60ml,冰醋酸11.5ml ,重蒸水28.5ml ,溶液中濃度K+3M,Ac-5M?！緦?shí)驗(yàn)步驟】1、擴(kuò)增質(zhì)粒（菌體培養(yǎng)）1 ）在LB平板上劃線培養(yǎng)具有 Amp標(biāo)記的E.coli

11、DH5x菌，37c恒溫倒置 培養(yǎng)16-18hr ;之后，挑取單菌落，接種于20ml LB液體培養(yǎng)基（含Amp80ug/ml） 中，37C, 220rpm振蕩培養(yǎng)過夜12-14hr ;再轉(zhuǎn)接一次，進(jìn)行50或100倍稀釋， 同樣37 C, 220rpm振蕩培養(yǎng)4-6hr。2）對50mL的離心管稱重（記為m）,取菌液30ml配平，6000rpm離心5min, 棄去上清液；加入5ml溶液I混勻，6000rpm離心5min,棄去上清液。取離心管 稱重（記為m2） ，可測得菌體重量W=m2-m1。2、提取質(zhì)粒1）向離心管中加入溶液I （ 1.0ml/100mg菌體），漩渦混勻后，冰浴5min；向離心管中加

12、入溶液H （2.0ml/100mg菌體）,輕柔顛倒混勻后，冰浴5min； 向離心管中加入溶液田（1.5ml/100mg菌體）,輕柔顛倒混勻后，冰浴5min； 離心管配平，12000rpm離心15min,取上清至新50ml離心管（記體積為v1） 2 ）加入2vi冰乙醇，顛倒混勻，-20C保存30min, 12000rpm離心15min,棄上 清液，將離心管倒置于紙巾上，以使所有液體流出。向沉淀中加入5mL70嶗醇進(jìn)行洗滌，12000rpm離心2min,棄去上清液，重復(fù)洗滌一次；37 C下保存5min,至離心管干燥，加入1mlTE緩沖液溶解，得粗提物，將粗 提物轉(zhuǎn)移至新EP管，加入100ugRNa

13、seA （10ug/ul）,將EP管放置于37c下，保 溫 1-2 小時(shí)。3、純化質(zhì)粒1 ）將提取物等分為500ul置于EP管中，加等體積酚液，混勻后，12000r離 心5min,將上清液轉(zhuǎn)移至新EP管；加入等體積酚/氯仿/異戊醇（PCI）混合液，混 勻后，12000rpm離心5min,轉(zhuǎn)上清至新EP管；加入等體積氯仿/異戊醇混合液， 混勻后，12000rpm離心5min,將上清液轉(zhuǎn)移至新EP管；2 ） 加入 1/10 體積的 3mol/L NaAc， 混勻后，加入 2倍體積 （包括上清液和1/10體積的NaAc）的冰乙醇，顛倒混勻，-20C保存30min, 12000rpm離心15min,棄

14、 去上清液；加入 5mL70喔醇進(jìn)行洗滌，12000rpm離心2min,棄去上清液，重復(fù) 洗滌一次；37 下保存5min, 至沉淀干燥, 每管加入25ul TE 溶液 , 溫和振蕩幾秒鐘，至沉淀溶解。將2管整合到一管，得到50ul質(zhì)粒DNAA,放置-20 C下保存。4、凝膠電泳分離質(zhì)粒1 ）制膠：1%瓊脂糖凝膠：稱取0.4g瓊脂糖于300ml三角燒瓶中，加40ml 1 >TAE微波爐加熱至完全溶化，冷卻至 60c左右，三角瓶放在手面可堅(jiān)持 1min 即可，緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min 以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液1>TAE,即可上樣。

15、2 ）取3.0膜 純化DNA1口入1.0膜 上樣緩沖液，混合，進(jìn)行點(diǎn)樣。點(diǎn)樣完畢 后，100V, 200mAM牛下電泳30min。電泳完畢后，進(jìn)行EB染色，用凝膠成像儀 拍照，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。【注意事項(xiàng)】1、在接菌時(shí)，注意無菌操作，物品應(yīng)在酒精燈火焰上方無菌區(qū)域。將挑有菌體的接種環(huán)在三角瓶壁上輕輕接觸，然后輕輕搖動(dòng)三角瓶，讓液體的LB 培養(yǎng)基輕輕沖刷菌體，當(dāng)觀察到附近的LB 培養(yǎng)基有輕微渾濁現(xiàn)象時(shí)，接菌成功，再 輕輕震蕩三角瓶，使全部菌體進(jìn)入培養(yǎng)基中。2、注意離心機(jī)的使用，離心管要配平，以防錯(cuò)誤操作損壞離心機(jī)。離心結(jié)束后， 將離心管從離心機(jī)取出時(shí)應(yīng)保持其傾斜狀態(tài)，防止沉淀重新進(jìn)入上清液中。3、為

16、獲得高純度質(zhì)粒DNA必須徹底除去雜蛋白、染色體 DNA口 RNA在整 個(gè)提取過程中出去染色體 DNA勺關(guān)鍵步驟是加入溶液H、溶液田的變性和復(fù)性環(huán) 節(jié)，應(yīng)控制好變形和復(fù)興的時(shí)機(jī)。加入溶液I時(shí)，可劇烈震蕩，使菌體沉淀轉(zhuǎn)變 成均勻的菌懸液，此時(shí)細(xì)胞尚未破裂，染色體不會(huì)斷裂；加入溶液II時(shí)，菌液變 粘稠、透明，無菌塊殘留；加入溶液田時(shí)，會(huì)立即出現(xiàn)白色沉淀。加入溶液R和 溶液田后，應(yīng)緩慢上下顛倒離心管數(shù)次，切忌在漩渦振蕩器上劇烈震蕩，否則， 染色體DN哈斷裂成小片段，不會(huì)形成沉淀，而溶解在溶液中，與質(zhì)粒DNA昆合 在一起，不利于質(zhì)粒DNAS純。因此，操作時(shí)一定要緩慢柔和，采用上下顛倒的 方法，既要使試劑

17、與染色體 DNAS分作用，又不破壞染色體的結(jié)構(gòu)。4、酚具有腐蝕性，能損傷皮膚和衣物，使用時(shí)應(yīng)小心。皮膚如不小心沾到酚，應(yīng)立即用堿性溶液、肥皂或大量清水沖洗。5、沉淀DNAffi常使用預(yù)冷無水乙醇，在低溫條件下長時(shí)間放置可使DNAK淀完全。除用乙醇沉淀 DN做卜，還可使用0. 6倍體積的異丙醇，但異丙醇也能 將鹽等雜質(zhì)沉淀，所以沉淀需要在常溫下進(jìn)行，并且時(shí)間不宜太長( 限 20 min) 。沉淀離心后，需用70乙醇洗滌，以除去鹽類及揮發(fā)性較小的異丙醇。、6、在低溫下提取質(zhì)粒DNA收率較高。對于低拷貝治理，在收集細(xì)胞之前，用氯霉素適當(dāng)處理，可以提高質(zhì)粒的拷貝數(shù)。7 、制備凝膠時(shí)，應(yīng)避免瓊脂糖溶液在

18、微波爐里加熱時(shí)間過長，否則溶液將會(huì)爆沸蒸發(fā)，影響瓊脂糖濃度，可在微波爐中間歇性加熱，約沸騰三次后，至凝膠溶解即可。同時(shí)， 制膠時(shí)要將凝膠槽中的水擦拭干凈，避免對膠的均一性產(chǎn)生影響。8、電泳時(shí)最好使用新的電泳緩沖液，以免影響電泳效果。如下一步實(shí)驗(yàn)要求較高，則應(yīng)盡量使用TAE電泳緩沖液，并且，配制瓊脂糖凝膠的電泳緩沖液應(yīng)與電泳時(shí)使用的緩沖液為同一批配制的。9、凝膠冷卻過程中，要自然冷卻，不要用冷水沖，否則會(huì)導(dǎo)致凝膠各部分不均勻，對電泳結(jié)果產(chǎn)生影響10、 注意上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞康哪z刺穿。也不要快速擠出吸頭的樣品，避免擠出的空氣將樣品沖出樣品孔。11、 紫外線對眼睛和皮膚均

19、有危害性，對眼睛尤甚。為了最大限度避免受到輻射， 要確保紫外光源得到適當(dāng)遮蔽，并應(yīng)戴好目鏡（ 眼罩） 或能夠有效阻擋紫外線的全副完全罩，避免皮膚直接暴露在紫外線下。12、澳化乙錠是一種具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA£ RN吩子的堿基之間，并在300 nm波長的紫外光照射下放射出熒光，所以可用來顯現(xiàn)瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠中的核酸分子。溴化乙錠是一種強(qiáng)烈的誘變劑，有毒性，使用含有這種染料的溶液時(shí)，應(yīng)戴手套進(jìn)行操作。勿將溶液滴灑在臺(tái)面或地面上，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用水徹底沖洗干凈?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】（一）實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象及數(shù)據(jù)記錄1、滅菌干燥離心管質(zhì)量：m 1=15.711g；菌液離心后離心管質(zhì)量：m

20、 2=15.807g；菌體質(zhì)量：W=0.0960g；2、加入溶液I時(shí)，劇烈震蕩后，菌體沉淀轉(zhuǎn)變成均勻渾濁的菌懸液，此時(shí)細(xì)胞尚未破裂，染色體不會(huì)斷裂；加入溶液R時(shí)，菌液變粘稠、透明，無菌塊殘留，打開EP管時(shí)，可以看到粘稠的絲狀物。加入溶液田時(shí)，立即出現(xiàn)白色絮狀沉淀, 經(jīng)輕柔混勻后，沉淀漂浮在 EP管上部。3、電泳時(shí)可以明顯觀察到藍(lán)色條帶在電泳槽里由負(fù)極向正極移動(dòng)，這是因?yàn)镈NA螺旋分子骨架兩側(cè)帶有含負(fù)電荷的磷酸根。所以，電泳時(shí)必須注意凝膠擺放的位置，應(yīng)將點(diǎn)樣孔靠近負(fù)極方向擺放。（二）凝膠電泳結(jié)果凝膠電泳觀察結(jié)果圖從左至右各泳道的樣品及上樣量泳道12345121314151617樣品入/ Hind

21、iIIpUC19/HindlllpUC19（商品）JD-1JD-2JD-9JD-10入DNAJD-5(-)JD-7(-)DL2000樣量（記）10.0100ng100ng3.03.03.03.06.03.03.05.0（三）結(jié)果分析1、凝膠電泳時(shí)，使用了 2種DNAMaker,分別為位于第一泳道的人/Hind III 和位于最后一泳道的DL200。其中，入/ Hind III DNA Maker可由HndI II酶 切Lambda/t得到的，本應(yīng)有8條帶，最后一條帶大小約為125bp,實(shí)驗(yàn)中一般很 難觀察到；DL2000DNAMarker是由單獨(dú)的PCRT增產(chǎn)物混合而成，包括6條DNA 條帶，

22、其DNAt段相比人/Hind III DNA Maker要小，適用于比對較小的 DNAt 段。（2種Maker所含DNAft帶大小已在上圖標(biāo)記）。2、質(zhì)粒DNAE取過程中，染色體DNA蛋白質(zhì)、RNA?物質(zhì)仍有部分殘留， 質(zhì)粒DNAt超螺旋、開環(huán)、線性三種不同的狀態(tài)，這些因素導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)組中每種樣 品都可以觀察到多條帶。下面以我們組（JD-4）為例，通過橫向?qū)Ρ?，由上至?對每一條帶進(jìn)行分析：1）蛋白質(zhì)條帶：點(diǎn)樣孔附近可以觀察到其周圍有微弱熒光，表明純化后的質(zhì)粒DNAW含有少量蛋白質(zhì)。電泳時(shí)，由于蛋白質(zhì)分子較大，很難通過瓊脂糖分 子篩，所以殘留在點(diǎn)樣孔處。殘留的蛋白質(zhì)經(jīng)EB染色后，在紫外下可看到熒光

23、， 由于含量比較少，所以熒光比較弱。2）染色體DNA帶：在點(diǎn)樣孔至23130bp的條帶間可以觀察到微弱的條帶， 其條帶位置同樣與14泳道的入DNA®近，該條帶代表的是殘留的染色體 DNA具 分子量比質(zhì)粒DNA*很多，所以在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度較慢，條帶靠近點(diǎn)樣孔。3）三種構(gòu)型質(zhì)粒DNAfrt：在4361bp至2000bp條帶間可以看到兩條帶：上面一條顏色很淺，條帶大小在 4300bp左右，為開環(huán)DNA子；下面一條 顏色很亮，條帶大小接近1900bp,與第三泳道的PUC19B與同一水平，為超螺 旋DN吩子。與第二泳道的pUC19/ HindIII對比，可以推測在兩條帶間應(yīng)還有線性DNA

24、分子條帶，大小接近2500bp。正常情況下，由于沒有專門的限制酶 切割DNA子，所以線性DN吩子比較難形成。在細(xì)菌體，質(zhì)粒DNA1以負(fù)超螺旋構(gòu)型存在的。在瓊脂糖凝膠電泳中不同構(gòu) 型的同一種質(zhì)粒 DNA盡管分子量相同，但具有不同的電泳遷移率。其中跑在最 前沿的是共價(jià)閉合DNA其后依次是線性DNA和開環(huán)DNA其原因是共價(jià)閉合的 DNAM空間位阻最小，所以跑得最快。而開環(huán)DNA®間位阻最大，所以跑得最慢。4）RNA條帶：圖示中第15和16泳道為未加RNAB的樣品，可見在500-100bp 圍有寬而亮的條帶，該條帶為 RNAft帶。本組中，均加過RNA酶，RN的解比較 徹底，僅在100bp

25、左右有一條很模糊的帶。（四）實(shí)驗(yàn)小結(jié)綜合以上分析，可以看出我們組（JD-4）的實(shí)驗(yàn)結(jié)果所得的質(zhì)粒 DNA屯度還算理 想。染色體DNAF口雙鏈開環(huán)DN*量少，蛋白質(zhì)含量相對多一些。質(zhì)粒DNAfrt 比較亮，其亮度大約為商品PUC19勺3-4倍，故可以推測，提取的質(zhì)粒DNAt度 為PUC1寐度的3-4倍。【思考】1、質(zhì)粒提取過程中，實(shí)驗(yàn)重要試劑及操作步驟的意義和作用。溶液I的作用：葡萄糖使溶液密度增加，懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部；維持滲透壓，防止細(xì)胞提前破裂，防止 DNAS機(jī)械剪切力作用而降解。EDTA是CeT和M0+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，可抑制 DNase的活性，抑制微生物的生長

26、。 Tris-Cl 溶液提供適當(dāng)?shù)膒H。溶液II的作用：NaOHt細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer （雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle （微 囊）結(jié)構(gòu)的相變化導(dǎo)致細(xì)胞溶解。同時(shí)，強(qiáng)堿性使染色體 DNA質(zhì)粒DNAffi蛋白 質(zhì)變性；SDS»下一步沉淀做鋪墊。溶液田的作用：十二烷基硫酸鈉(SDSsodium dodecylsulfate )遇到KAc后變成了十二烷基硫酸鉀(potassium dodecylsulfate, PDS ),而 PDSll水不溶的， 因此發(fā)生了沉淀。又 SDS專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè) SD的子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，此 外大腸桿菌的基因組DNAfe一起被共沉淀了。 HAc中和NaOH因?yàn)殚L時(shí)間的堿 性條件下會(huì)打斷基因組 DNA只要是50-100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被 PDStt沉淀了。同時(shí)變性的質(zhì)粒DNAM性。該步反應(yīng)形成的高鹽環(huán)境進(jìn)一步加速 了這一沉淀。冰浴使反應(yīng)更充分。冰乙醇作用：用無水乙醇沉淀DNA這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNA勺方法。乙醇 的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對DNA艮