細胞工程—動物細胞培養(yǎng)細節(jié)復(fù)習(xí)題1

1、動物細胞原代培養(yǎng)-技術(shù)細節(jié)1、原代培養(yǎng)：從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞為原代細胞。借助這種方法可以觀察細胞的分裂繁殖、細胞的接觸抑制、以及細胞的衰老，死亡等生命現(xiàn)象。2、傳代培養(yǎng)：將原代細胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。3、無菌操作基本技術(shù): 3.1實驗進行前，無菌室及無菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 %ethanol 擦拭無菌操作臺面，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開始實驗操作。3.2每次操作只處理一株細胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細胞間污染。3.3實驗完

2、畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺運轉(zhuǎn)10 分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。3.4無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。3.5實驗用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實驗操作應(yīng)在臺面中央無菌區(qū)域，勿在邊緣非無菌區(qū)域操作。 3.6小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口

3、朝上放置桌面。 3.7工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃壷疅o菌操作臺(至少Class II)。操作過程中，應(yīng)避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。3.8定期檢測下列項目： CO2 鋼瓶的CO2 壓力CO2 培養(yǎng)箱的CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。 無菌操作臺內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300小時/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時/HEPA)。 4、培養(yǎng)基4.1 液體培養(yǎng)基貯存于4

4、冰箱，避免光照，實驗進行前放在37 水槽中溫?zé)帷?4.2 液體培養(yǎng)基(加血清) 存放期為六個月，期間谷氨酰胺可能會分解，若細胞生長不佳，可以再添加適量谷氨酰胺。 4.3粉末培養(yǎng)基配制(注意)： 細胞培養(yǎng)基通常須添加10 % 血清、pH 為7.2 - 7.4。粉末培養(yǎng)基及NaHCO3 粉末應(yīng)分別溶解后才混合，然后用CO2 氣體調(diào)整pH，而非用強酸(HCl)或強堿(NaOH)，因為氯離子對細胞生長可能有影響，且貯存時培養(yǎng)基的pH 易發(fā)生改變。純水配制。以0.1 或0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌。標(biāo)示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號等，貯存于4。須作生長試驗與污染測試。 5、抗生素 5.1. 細胞庫之細胞培

5、養(yǎng)基不加抗生素 5.1.1. 培養(yǎng)自ATCC 引進之細胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素。 5.1.2. 培養(yǎng)自其它實驗室引進之細胞株，須添加抗生素，待token freeze 通過污染測試后，大量培養(yǎng)時則不加抗生素。 5.2. 寄送活細胞時，須將培養(yǎng)液充滿整個培養(yǎng)瓶時，則須添加抗生素(青霉素100 units/ml + 鏈霉素100 ug/ml)。 5.3. 若要檢測支原體，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加慶大霉素，因慶大霉素會抑制支原體生長。6、血清：-20或70至4冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般以50 ml 無菌離心管可分裝4045 ml。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一

6、，減少沈淀的發(fā)生。勿直接由20直接至37解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沈淀。7. 血清之沈淀物 7.1. 凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin) 造成，這些凝絮沈淀物不會影響血清本身之品質(zhì)。7.2顯微鏡下觀察之“小黑點”：通常經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點”，一般而言，此小黑點應(yīng)不會影響細胞的生長。8、細胞冷凍保存注意事項：8.1. 欲冷凍保存之細胞應(yīng)在生長良好且存活率高之狀態(tài)，約為80 90 致密度。 8.2. 冷凍前檢測細胞是否仍

7、保有其特有性質(zhì)，例如hybridoma 應(yīng)在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。 8.3. 注意冷凍保護劑之品質(zhì)。DMSO 應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色以510 ml 小體積分裝，4避光保存，勿作多次解凍。甘油亦應(yīng)為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。 9、冷凍細胞活化：1.快速解凍（輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化），以避免冰晶重新結(jié)晶而對細胞造成傷害，導(dǎo)致細胞之死亡。2. 細胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復(fù)正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。解凍后是否立即去除冷凍保護劑(例如DMSO 或glycero

8、l)，依細胞種類而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護劑。在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基大格*細胞總數(shù)x 2 x 104 / 4= 細胞數(shù)/ml1 冷凍管應(yīng)如何解凍？ 取出冷凍管后， 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿， 否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時， 必須注意安全， 預(yù)防冷凍管之爆裂。2 細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時， 是否應(yīng)馬上去除DMSO？ 除少數(shù)特別注明對DMSO 敏感之細胞外， 絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞）， 在解凍之后， 應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中， 待隔天再置

9、換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。 3 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？ 不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細胞培養(yǎng)基， 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基， 細胞大都無法立即適應(yīng)， 造成細胞無法存活。 4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？ 不能。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源， 所以血清的種類和品質(zhì)對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清， 在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。5 何謂FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine se

10、rum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼， 請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。 6 培養(yǎng)細胞時應(yīng)使用5 % 或10% CO2？或根本沒有影響？ 一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng)， 而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的CO2 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時，細胞培養(yǎng)時應(yīng)使用10 % CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時， 則應(yīng)使用5 % CO2

11、培養(yǎng)細胞。7 何時須更換培養(yǎng)基？ 視細胞生長密度而定， 或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可。 8 培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？ 除于特殊篩選系統(tǒng)中外， 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下， 培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。 9 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度？應(yīng)如何處理？ 一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA。第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于20 °C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少污染之機會。 10 懸浮性細胞應(yīng)如何繼代處理？ 一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中

12、， 稀釋細胞濃度即可， 若培養(yǎng)液太多時， 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高， 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶， 加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度， 重復(fù)前述步驟即可。 11 欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？ 欲回收動物細胞， 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 - 10 分鐘， 過高之轉(zhuǎn)速， 將造成細胞死亡。 12 細胞之接種密度為何？ 依照細胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。 13 細胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？ 動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 -

13、10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細胞液中， 必須使用前先行配制完成。14 DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何？ 冷凍保存使用之DMSO 等級， 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即為無菌狀況， 第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中， 保存于4°C， 避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì)， 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之

14、Nylon 材質(zhì)濾膜。15 冷凍保存細胞之方法？ 冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 3060 分鐘 (-20 °C30 分鐘*) -80 °C 1618 小時(或隔夜) 液氮槽vaporphase 長期儲存。 冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C 至80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。適用于懸浮型細胞之保存。16 細胞欲冷凍

15、保存時， 細胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細胞濃度？ 冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為每瓶1x106 cells/ml， 融合瘤細胞則以每瓶5x106 cells/ml 為宜。 17 應(yīng)如何避免細胞污染？ 細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。 18 如果細胞發(fā)生微生物污染時，應(yīng)如何處理？ 加入相應(yīng)抗生素。直接滅菌后丟棄之。 19 支原體(mycoplasma) 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？ 不能。除極有經(jīng)驗之專家外，大多數(shù)遭受支

16、原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨之。 20 支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響？ 支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數(shù)， 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。 21 偵測出細胞株有支原體污染時， 該如何處理？ 直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株。 22 CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？ 定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。 23 為何培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中， 顏色會偏暗紅色， 且pH值會越來越偏堿性？ 培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中， 培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基

17、越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果， 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時， 可以通入無菌過濾之CO2， 以調(diào)整pH 值。 24 各種細胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同？ 不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對大部分細胞沒有太大之影響， 惟少數(shù)細胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。25 購買之細胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會發(fā)生細胞數(shù)目太少之情形？ 研究人員在冷凍細胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞數(shù)目太少， 大都是因為離心過

18、程操作上的失誤， 造成細胞的物理性損傷， 以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心， 應(yīng)待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。 26 購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？ 研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳， 常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后， 加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細胞置于80 °C 太久。 27 收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？ 冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松

19、動或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊 28 如何選用特殊細胞系培養(yǎng)基？ 培養(yǎng)某一類型細胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長?？傊?，首選MEM做粘附細胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細胞培養(yǎng)，無血清培養(yǎng)最好首選AIM V（12005）培養(yǎng)基（SFM）。 29 L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？ L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解

20、，但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。 30 GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩(wěn)定？ GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。 31 什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？ 酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為

21、紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基32 培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？ 丙酮酸鈉可以作為細胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。34二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？ 二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有

22、的二價離子。 33目錄上說，Hanks 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么？Hanks 平衡鹽溶液(HBS)和Earles平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別？HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液，。如果僅僅是清洗將要在細胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。35當(dāng)在無血清培

23、養(yǎng)基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結(jié)合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對于細胞達到毒性水平。 36 一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。 37 大部分添加物和試劑最多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。 38 在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩(wěn)定。 1. 保存血清最好的方法?建議血清應(yīng)保存在-5至-2O。然

24、而，若存放于4時，請勿超過一個月。若您一次無法用完一瓶，建議您無菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。2. 如何解凍血清才不會使產(chǎn)品質(zhì)量受損?建議您將血清從冷凍箱取出后，先置于28冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規(guī)則地搖晃均勻。3. 血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理?血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi)，以400g稍微

25、離心,上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。我們不建議您以過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因為它可能會阻塞您的過濾膜。4. 為什么要熱滅活血清?加熱可以滅活補體系統(tǒng)。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在免疫學(xué)研究，培養(yǎng)ES細胞，昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。5. 有必要做熱滅活嗎?實驗顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對大多數(shù)的細胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進，或完全沒有任何作用，甚至通常因為高溫處理影響了血清的質(zhì)量，而造成細胞生長速率的降低。而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在

26、倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37環(huán)境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。 6. 為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現(xiàn)沉淀?GIBICO的胎牛血清 沒有預(yù)老化，儲存在28時，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應(yīng)該不會影響血清的質(zhì)量。推薦在20儲存胎牛血清，避免反復(fù)凍融。7. 如何避免血清中沉淀物的產(chǎn)生?解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法(-20至4至室溫)，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20至37)，實驗顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。解凍血清時，請隨

27、時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。請勿將血清置于37太久。若在37放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。若必須做血清的熱滅活，請遵守56，30分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。8細胞凍存復(fù)蘇原則：慢凍快融當(dāng)細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：1)細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。 2)如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶。大結(jié)晶會造成細胞膜、細胞器損傷和破裂。3)復(fù)蘇過程

28、應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。細胞的凍存 冷凍保護劑：冷凍保護劑是指可以保護細胞免受冷凍損傷的物質(zhì)。一般只有紅細胞、大多微生物和極少數(shù)有核的哺乳動物細胞凍存時可不加冷凍保護劑；但對大多數(shù)有核哺乳動物細胞來說，冷凍時必須加冷凍保護劑。滲透性冷凍保護劑：甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、甲醇等小分子， 其保護機制是在細胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細胞內(nèi)，在細胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護細胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷。非滲透性冷凍保護劑：主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚 乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羥乙基淀粉等大分子物質(zhì)。其保護機

29、制的假說很多，其中有一種是，減少冰晶的形成。冷凍保存溫度 :液氮溫度（-196）是目前最佳的冷凍保存溫度。在-196 時，細胞的生命活動幾乎完全停止，但復(fù)蘇后細胞的結(jié)構(gòu)和功能完好。如果冷凍過程得當(dāng)，一般生物樣品在-196 下均可保存十年以上。 -70-80 保存細胞，短期內(nèi)對細胞的活性無明顯影響，但隨著凍存時間延長，細胞存活率明顯降低。在冰點到-40 范圍內(nèi)保存細胞的效果不佳。note:甘油和DMSO并不防止細胞內(nèi)結(jié)冰，在使用該類冷凍保護劑時，需要一定的時間進行預(yù)冷，讓其滲透到細胞內(nèi)，細胞內(nèi)外達到平衡以起到充分的保護作用。DMSO在常溫下對細胞的毒性作用較大，而在4時，其毒性作用大大減弱，且仍

30、能以較快的速度滲透到細胞內(nèi)。所以，凍存時DMSO平衡多在4下進行，一般需要4060分鐘。9. 細胞株運輸：1 )貼身運輸：短途運輸，挑選的生長狀態(tài)良好的細胞裝滿培養(yǎng)基，將瓶口用酒精棉球擦拭遍，將瓶蓋擰緊，酒精消毒后用封口膜封閉，整個瓶子外表面噴上酒精，用塑料手套包裹后，豎力貼身放置（或者比較溫暖的地方），運輸途中盡量避免劇烈震蕩（避免培養(yǎng)基與瓶口接觸）細胞取回后，半量換液（保留吸出的大部分的培養(yǎng)基，以備以后半量換液用）2 )冰瓶運輸：短途運輸，從液氮中取出細胞，放入冰盒中轉(zhuǎn)運至新的實驗室。3 )液氮罐運輸：短途及長途運輸，從液氮中取出細胞，放入裝滿液氮的小型液氮罐中轉(zhuǎn)運至新的實驗室10.收到T25 培養(yǎng)瓶包裝細胞， 處理方式為： 1. 寄送過程中，為避免起泡造成細胞脫落死亡，T25 培養(yǎng)瓶均加滿培養(yǎng)基。收到后應(yīng)檢查培養(yǎng)瓶外觀，并于顯微鏡下觀察細胞生長狀況和有無污染現(xiàn)象，若