頭孢替安無菌方法學(xué)驗證

1、注射用鹽酸甲砜霉素甘氨酸酯無菌檢查方法學(xué)驗證為了保證本品無菌檢查方法的檢驗質(zhì)量，確保檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，根據(jù)中國藥典（2010年版）要求，我們對注射用鹽酸甲砜霉素甘氨酸酯的無菌檢查進行了方法 學(xué)驗證考察。驗證結(jié)果如下：1、菌種：大腸埃希菌CMCC（B）44 102金黃色葡萄球菌CMCC（ B）26 003銅綠假單胞菌CMCC（ B）10 104枯草芽抱桿菌CMCC（ B）63 501生抱梭菌CMCC （B） 64 941白色念珠菌CMCC （F） 98 001黑曲霉CMCC （ F） 98 003以上菌種均由中國藥品生物制品檢定所提供，所用菌株傳代次數(shù)均未超過5代，符合驗證試驗要求。2、

2、材料和儀器2.1供試品：注射用鹽酸甲砜霉素甘氨酸酯（批號：20110301）廠家：吉林省輝南長龍生化藥業(yè)股份有限公司2.2培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號081113中國藥品生物制品檢定所）營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號090225中國藥品生物制品檢定所）玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號080616中國藥品生物制品檢定所）改良馬丁培 養(yǎng)基 （批號090203中國藥品生物制品檢定所）改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（批號081127中國藥品生物制品檢定所）硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（批號0903112中國藥品生物制品檢定所）蛋白胨水培養(yǎng)物（批號070112中國藥品生物制品檢定所）2.3儀器LRH-250A生化培養(yǎng)箱YXQ-LS-50SI

3、I立式壓力蒸汽滅菌器HH-B11-600電熱恒溫培養(yǎng)箱9240MBE數(shù)顯鼓風(fēng)不銹鋼干燥箱HZY-III型智能集菌儀全封閉集菌培養(yǎng)器(杭州高得醫(yī)療器械有限公司，批號：20090309)2.4稀釋劑0.9%無菌氯化鈉溶液；含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液；pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液3、菌液制備(1) 將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽抱桿菌的新鮮培養(yǎng)物分別接種至10ml營養(yǎng)肉湯中，取此培養(yǎng)液1ml加到9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，采用10 倍遞增稀釋法，稀釋至10-310-8,使菌數(shù)小于100cfu/ml，見表1。(2) 接種生抱梭菌的新

4、鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基10ml中，30°C35°C培養(yǎng) 1824小時，取此培養(yǎng)液1ml加到9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，采用10倍遞增稀釋法， 稀釋至10-510-8,使菌數(shù)小于100cfu/ml，見表1。(3) 將白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物分別接種至 10ml改良馬丁培養(yǎng)基中，23C28C培 養(yǎng)2448小時，取此培養(yǎng)液1ml加到9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，采用10倍遞增稀釋法， 稀釋至10-510-6,使菌數(shù)小于100cfu/ml，見表1。(4) 將黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種至10ml改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23C28C培 養(yǎng)57天，加3ml5ml含0.05%

5、 (ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將抱子 洗脫，吸出菌液，取1ml菌液加到9ml含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉 溶液中，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-410-6,使抱子數(shù)小于100cfu/ml，見表1。表1活菌預(yù)試驗活菌計數(shù)菌名大腸埃布菌金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽抱桿菌生抱梭菌白色念珠菌黑曲霉代數(shù)第三代第三代第三代第三代第三代第三代第三代、稀釋級 次數(shù)、_7107 1ml_6106 1ml_6106 1ml_7107 1ml_6106 1ml_5105 1ml_5105 1ml17568798369667627062718863727

6、3平均值72.5657585.5666974.54培養(yǎng)基靈敏度檢查取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基9支，分別接種小于100cfu的金黃色葡萄 球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽抱桿菌、生抱梭菌各 2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng) 3天；取每管裝量為9ml的改良馬丁培養(yǎng)基5支,分別接種小于100cfu的白色念珠菌、黑曲 霉各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)5天。逐日觀察結(jié)果。結(jié)果見表2。表2:培養(yǎng)基靈敏度檢查結(jié)果拉H甘 培養(yǎng)基菌種管數(shù)觀察結(jié)果1d2d3d4d5d硫乙醇酸鹽金黃色葡萄球菌1+2+銅綠假單胞菌1+2+枯草芽抱桿菌1+流口養(yǎng)基2+生抱梭菌1+2+空白組改良馬丁培養(yǎng)基白色念珠菌

7、1+2+黑曲霉1+2+空白組“一”表示無菌生長?！?+”表示生長良好結(jié)果判定：空白對照管無菌生長，加試驗菌的培養(yǎng)基管均生長良好，該培養(yǎng)基的靈敏 度檢查符合規(guī)定。5.檢驗方法驗證5.1薄膜過濾法：取供試品10瓶，用0.9%無菌氯化鈉溶液溶解并稀釋至 250ml，用薄膜過濾法處理， 用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗（沖洗量分別為 300ml，500ml，800ml），在最 后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗菌，過濾，分別加入相應(yīng)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng) 基或改良馬丁培養(yǎng)基100ml，作為樣品驗證管。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的培養(yǎng)器，加 入等量試驗菌，作為陽性對照管?？瞻捉M：取供試品10瓶，

8、用0.9%無菌氯化鈉溶液溶解并稀釋至 250ml，用薄膜過濾 法處理，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗（沖洗量分別為300ml, 500ml, 800ml）， 不加試驗菌，分別加入相應(yīng)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基100ml，作為樣品管。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的培養(yǎng)器，作為對照管。同時以同體積的培養(yǎng)基的培養(yǎng)器 作為空白對照組。按規(guī)定溫度培養(yǎng)35天。各試驗菌同法操作。結(jié)果見表 3。表3不同沖洗量考察菌種沖洗量（ml）樣品驗證管陽性對照管1d2d3d4d5d1d2d3d4d5d大腸埃希菌300+500+800+金黃色葡萄球菌300+500+800+枯草芽孢桿菌300-+500+800

9、+生抱梭菌300+500+800+白色念珠菌300-+-+500-+800-+黑曲霉300-+-+500-+800-+“ + ”表示生長良好，“一”表示無菌生長。5.2結(jié)果判斷與對照管比較，樣品驗證管在沖洗量為300ml的情況下，對枯草芽抱桿菌的生長有輕 微抑制；而樣品驗證管在沖洗量為 500ml和800ml的情況下，各實驗菌均生長良好。結(jié) 果表明采用500ml的沖洗量，應(yīng)能消除對枯草芽抱桿菌的抑菌性，可以采用薄膜過濾法， 每管最低沖洗量500ml，進行無菌檢查。6驗證結(jié)論按照中國藥典（2010年版）無菌檢查法的方法驗證，注射用鹽酸甲砜霉素甘氨酸 酯的無菌檢查法為：取本品，加0.9%無菌氯化鈉適量溶解并稀釋成每1ml中含2mg的溶液, 經(jīng)薄膜過濾法處理，用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液分次沖洗（每膜不少于 500ml），依 法檢查（中國藥典2010年版二部 附錄XI H ），應(yīng)符合規(guī)定。7、樣品測定：取本品，加0.9%無菌氯化鈉適量溶解并稀釋成每 1ml中含2mg的溶液，經(jīng)薄膜過濾 法處理，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液分次沖洗（每膜不少于 500ml），以金黃色葡 萄球菌為陽性對照菌，同時以同體積的培養(yǎng)基的培養(yǎng)器作為陰性對照，依法檢查（中國藥典2010年版