實用pcr流程表

1、臨床PCR僉驗流程記錄表檢驗日期： 檢驗項目： HBV-DNA 擴(kuò)增儀中保存文件名 使用說明：嚴(yán)格按單一流向進(jìn)行實驗，即試劑準(zhǔn)備區(qū)-標(biāo)本制備區(qū)-擴(kuò)增區(qū) ，嚴(yán)禁逆向移動。本記錄表的流向亦遵循此流程；各項工作 執(zhí)行后在相應(yīng)項目前的方框內(nèi)打；本記錄表最后歸檔保存在 PCR實驗室擴(kuò)增區(qū)的專用文件夾中，以備查找。實驗前準(zhǔn)備口試劑在有效期內(nèi)口擴(kuò)增儀、加樣器、金屬浴、溫濕度計等儀器在校準(zhǔn)有效期內(nèi)（校準(zhǔn)之日起1年）口生物安全柜的濾膜在使用有效期內(nèi)口離心管、帶濾芯吸頭已經(jīng)過質(zhì)檢合格口各區(qū)按消毒液配制 SOP配制500mg/L含氯消毒液、2000mg/L含氯消毒液與70%酉精，即用即配?？诖蜷_通風(fēng)設(shè)備操作者試劑準(zhǔn)

2、備區(qū)實驗前：口更換專用工作服、戴口罩、帽子、鞋套口實驗臺面清潔（500mg/L含氯消毒液、70%酉精或水擦拭）冰箱溫度：冷藏室（28C）C; 冷凍室（-20 ±2C）C實驗室溫度 C （允許范圍：1530C）;相對濕度：（允許范圍：30%70%）PCR式劑來源：試劑廠家：口深圳匹基生物工程有限公司批號：檢驗項目：HBV-DNA 本次實驗用量： 人份；剩余量： 人份其她有關(guān)試劑配制：儀器設(shè)備使用：離心機(jī)：口正常 口不正常； 振蕩器：口正常 口不正常；生物安全柜：口正常 口 不正常實驗后：口按實驗室清潔消毒 SOP青潔實驗室臺面、地面、加樣器與離心機(jī)，并進(jìn)行紫外線照射 30分鐘以上?？诎?/p>

3、實驗室廢棄物處理 SOP處理實驗廢棄物。操作者檢驗日期：檢驗項目： HBV-DNA樣本處理區(qū)實驗前：口更換專用工作服、戴口罩、帽子、鞋套口實驗臺面清潔（500mg/L含氯消毒液、70%酉精或水擦拭）冰箱溫度：冷藏室（28C）C; 冷凍室（-20 ±2C）C實驗室溫度 C（允許范圍：1530C）;相對濕度：（允許范圍：30%70%）HBV-DN屆性室內(nèi)質(zhì)控物來源：濃度及批號：擴(kuò)增位置：HBV-DN屈性室內(nèi)質(zhì)控物來源：批號:擴(kuò)增位置：所處理的HBV-DN“本（對應(yīng)標(biāo)本接收的唯一編號）及擬擴(kuò)增位置19172533414957657381892101826344250586674829031

4、1192735435159677583914122028364452606876849251321293745536169778593614223038465462707886947152331394755637179879581624324048566472808896核酸提取及加樣過程：口按乙型肝炎病毒 DNA熒光定量PCR操作程序SOP進(jìn)行。儀器設(shè)備使用：生物安全柜：口正常 口不正常； 恒溫金屬?。篊;離心機(jī)：口正常 口不正常； 振蕩器： 口正常口不正常；低溫離心機(jī)：制冷：口正常 口不正常；離心：口正?？诓徽嶒灪螅嚎诎磳嶒炇仪鍧嵪?SOP青潔實驗室臺面、地面、加樣器與離心機(jī)，并進(jìn)行

5、紫外線照射 30分鐘以上?？诎磳嶒炇覐U棄物處理 SOP處理實驗廢棄物?？谑褂煤髽?biāo)本冷凍保存 3個月，以備復(fù)查。操作者擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)實驗前：口更換專用工作服、戴口罩、帽子、鞋套口實驗臺面清潔（500mg/L含氯消毒液、70%酉精或水擦拭）實驗室溫度 C （允許范圍：1530C）;相對濕度：（允許范圍：30%70%）LightCycler擴(kuò)增儀操作：口開機(jī)自檢及運行正常；口按LightCycler操作使用SOP進(jìn)行編程、參數(shù)設(shè)定HBV-DNA準(zhǔn)曲線計算值 ：Slope 值: Intercept 值: r2 值:室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果：陰性質(zhì)控物結(jié)果：;陽性質(zhì)控物結(jié)果：口填寫室內(nèi)質(zhì)控記錄、質(zhì)控圖；就是否失控

6、：口否口就是室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果：陰性質(zhì)控物結(jié)果：;陽性質(zhì)控物結(jié)果：口填寫室內(nèi)質(zhì)控記錄、質(zhì)控圖；就是否失控：口否口就是失控原因及分析：（失控判斷標(biāo)準(zhǔn)及原因分析按室內(nèi)質(zhì)控SOP進(jìn)行）實驗結(jié)果：見所附擴(kuò)增儀打印結(jié)果實驗結(jié)果有效性判斷：有效口無效（依據(jù)實驗結(jié)果有效性判斷 SOP進(jìn)行）實驗后：口按實驗室清潔消毒 SOP青潔實驗室臺面、地面、加樣器與離心機(jī)，并進(jìn)行紫外線照射 30分鐘以上?？诎磳嶒炇覐U棄物處理 SOP處理實驗廢棄物。操作者1、 操作步驟 :1.1.1 取n個1、5ml的滅菌離心管，作好標(biāo)記。（n=樣本數(shù)+1管HCV陰性對照+1管HCV強(qiáng)陽性對照 +1 管 HCV 臨界陽性對照 ）1.1.2 向上

7、述離心管中分別加入 25ul 蛋白酶溶液。1.1.3 分別加入待測樣本、 HCV 陰性對照、 HCV 臨界陽性對照與HCV 強(qiáng)陽性對照各200ul、1.1.4 加入 200ul 新鮮配制的裂解液工作液,蓋上蓋子 ,振蕩 15秒,充分混勻。 （注意 :不要把蛋白酶溶液直接加入裂解液工作液中）。1.1.5 56攝氏度溫浴15分鐘。瞬時離心,以去除管蓋上的滴液。1.1.6 加入 250ul 無水乙醇,蓋上蓋子,徹底混勻（振蕩15秒）。在室溫下靜置5 分鐘 （15-25攝氏度 ）。 注意 :如果環(huán)境溫度超過25攝氏度 ,無水乙醇需預(yù)冷。 瞬時離心,以去除管蓋上的滴液。1.1.7 將 n 個核酸提取柱放

8、入收集管中,小心地將步驟1.2.6 中的液體移入核酸提取柱中。蓋上蓋子 ,6000*g 離心 1 分鐘。倒掉收集管中的廢液,將提取柱重新放入收集管中。（如果離心后核酸提取柱中仍有部分液體,以更高的速度再次離心,確保提取柱中無殘余的液體）1.1.8 小心的打開核酸提取柱的蓋子,加入500ul 洗液1,蓋上蓋子,6000*g 離心1 分鐘,倒掉收集管中的廢液,將提取柱重新放入收集管中。1.1.9 小心的打開核酸提取柱的蓋子,加入500ul 洗液2,蓋上蓋子,6000*g 離心1 分鐘,倒掉收集管中的廢液,將提取柱重新放入收集管中。1.1.10 小心的打開核酸提取柱的蓋子,加入500ul 無水乙醇,

9、蓋上蓋子,6000*g 離心 1 分鐘 ,丟棄收集管,將提取柱放入新的收集管中。1.1.11 20000*g 高速離心 3 分鐘 ,徹底去除乙醇。1.1.12 丟棄收集管，將核酸提取柱放入干凈的1、5ml離心管中，打開提取柱的蓋子，56攝氏度溫浴3分鐘，以徹底去除殘余的液體。1、213將核酸提取柱放入另一干凈的1、5ml離心管中，小心打開提取柱的蓋子，加入60ul 洗脫液（請將洗脫液加到膜的中央），蓋上蓋子，室溫靜置5分鐘。20000*g高速離心1 分鐘收集濾出液，做好標(biāo)記，4攝氏度保存?zhèn)溆?。提取的病毒核酸?yīng)在2小時內(nèi)用于PCR擴(kuò)增，或在-70攝氏度下可以保存一個月。2、擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（PCR前

10、準(zhǔn)備區(qū)）從試劑盒中取出HCV RT-PCR反應(yīng)液、Enzyme Mix ,在室溫下融化后,2000*g離心5 秒。設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管數(shù)（玻璃毛細(xì)管）為n（n=樣本數(shù)+1管空白對照+1管HCV 陰性對照+1管HCV強(qiáng)陽性對照+1管HCV臨界陽性對照+4管HCV定量標(biāo)準(zhǔn)品），每個測試反應(yīng)體系配制如下表試齊HCV RT-PCR反應(yīng)液Enzyme Mix用量n*13uln*2ul計算好各試劑的使用量，加入到一適當(dāng)體積試管中，充分混勻均勻后2000*g離心10秒, 向各玻璃毛細(xì)管中分裝15ul,轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。3 .加樣（樣本處理區(qū)）吸取10ul樣本處理步驟1.2.13中收集得到的RNA溶液及HC

11、V定量標(biāo)準(zhǔn)品分別加入到上述反應(yīng)管中（空白對照直接加入10ul洗脫液），蓋緊反應(yīng)管管蓋，連同Roche專用金 屬反應(yīng)管套放在離心機(jī)中，于2000*g離心10秒，將毛細(xì)管轉(zhuǎn)移到檢測區(qū)。將毛細(xì)管排 放好放入熒光PCR檢測儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。4 、RT-PCR反應(yīng)（檢測區(qū)）4、1循環(huán)條件設(shè)置ProgramCyclesTemperatureIncubationTemperatureAcquisitioAnal攝氏度Time(min:sec)TransitionRate(攝氏度/sec)nModeysisMod e115030:0020NoneNon e219515:0020NoneNon e3459

12、500:0520NoneQua ntifi catio n5000:3020Single7200:2010None反應(yīng)體系為25ul、具體設(shè)置方法請參照各儀器使用說明書。5 .2儀器檢測通道選擇選擇F1檢測通道：HCV內(nèi)對照（IC）選擇F2檢測通道。6 .3樣本的設(shè)定在擴(kuò)增開始前條件設(shè)定時，將HCV定量標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)為“ Standard”并輸入試劑盒內(nèi)給定濃度值,待檢樣本與對照品設(shè)定為“ Unknown”。結(jié)果分析條件設(shè)定1. 對HCV的曲線與HCV內(nèi)對照（IC）的曲線進(jìn)行分別分析。2. 分析方式選擇 Fit Points,基線調(diào)整選擇 Arithmetic,閾值（threshold）設(shè)定原則以閾

13、值 線剛好超過正常HCV陰性對照曲線的最高點，且正常HCV陰性對照病毒滴度為0、 0IU/ml為準(zhǔn)。具體設(shè)置方法請參照各儀器使用說明書。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)1 .將HCV定量標(biāo)準(zhǔn)品1-4的濃度值輸入，儀器將自動以HCV定量標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為橫坐標(biāo) ,以其實際測得的外標(biāo)Ct 值為縱坐標(biāo)給出標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬與度絕對值應(yīng)大于等于 0、 980,四個 HCV 定量標(biāo)準(zhǔn)品的 Ct 值都應(yīng)<38、 0,否則視為定量結(jié)果無效。2 . HCV 陰性對照、空白對照 HCV RNA 應(yīng)為 0、 0IU/ml;HCV 強(qiáng)陽性對照 HCV RNA 應(yīng) 為 5、 0E+05-1、 0E+07IU/m l; HCV 臨界陽

14、性對照應(yīng)為1、 0E+03-1、 0E+05 IU/ml; 且HCV陰性對照、HCV臨界陽性對照中HCV內(nèi)對照（IC）的Ct值都應(yīng)小于等于33,否則 此次實驗視為無效。所有實驗從樣本處理開始重做。結(jié)果判斷1. 檢測樣本中 1、 0E+03 IU/ml 小于等于 HCV RNA 小于等于5、 0E+07 IU/ml, 測定結(jié)果有效 ,可直接報告相應(yīng)的濃度值。2. 檢測樣本中 HCV RNA 大于 5、 0E+07 IU/ml, 可按實際測得值報告相應(yīng)的病毒滴度,亦可將該樣本用正常人血漿按 10 倍梯度稀釋到本試劑盒定量檢測線性范圍內(nèi)后重新 測定 ,測定結(jié)果應(yīng)以稀釋倍數(shù)進(jìn)行校正。3. 檢測樣本中 0、 0IU/ml 小于 HCV RNA 小于 1、 0E+03 IU/ml, 且 HCV 內(nèi)對照 （IC） 的 Ct 值都應(yīng)小于