蛋白質(zhì)組分析中變形鏈球菌的酸耐受性代謝表型

1、蛋白質(zhì)組分析中變形鏈球菌的酸耐受性代謝表型 愛(ài)麗絲氯萊恩，德里克是哈蒂和尼古拉斯答雅克 牙科學(xué)院的研究，韋斯特米德千年研究所和口腔健康韋斯特米德中心，郵政信箱533，Wentworthville，NSW，澳大利亞2145 摘要 雙向凝膠電泳的蛋白質(zhì)組分析鏈球菌變形鏈球菌生長(zhǎng)在一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)在一個(gè)葡萄糖有限厭氧連續(xù)培養(yǎng)揭示了時(shí)出現(xiàn)的差異表達(dá)的生長(zhǎng)pH值降低蛋白質(zhì)的數(shù)量從0到pH值pH值750 。在代謝蛋白表達(dá)的變化，一般限于3生化途徑：糖酵解，產(chǎn)酸的替代和支鏈氨基酸的合成。代表的蛋白質(zhì)與恩布登-邁爾霍夫-帕爾納斯途徑相關(guān)酶的所有景點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)水平，以及在主要替代變形鏈球菌發(fā)酵酸途徑參與所有的酶，

2、但一，鑒定和測(cè)量。蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)與最終產(chǎn)品和細(xì)胞產(chǎn)量的分析結(jié)合起來(lái)，進(jìn)行了表型改變，允許變形鏈球菌增殖的消耗能量，在低pH值從細(xì)胞擠出多余的氫離子相一致，同時(shí)盡量減少不利影響，該結(jié)果從代謝偶聯(lián)的碳通量和NADH和丙酮酸生產(chǎn)在隨后的不平衡。在酶水平的變化與在最強(qiáng)的酸，甲酸，這是一個(gè)對(duì)丙酮酸轉(zhuǎn)移的結(jié)果既乳酸和支鏈氨基酸生產(chǎn)時(shí)變形鏈球菌在酸性環(huán)境下栽培的形成目標(biāo)一致。 縮略語(yǔ)：2胃排空，雙向凝膠電泳;的ASB - 14，amidosulfobetaine - 14;研發(fā)，稀釋率;署署長(zhǎng)，差異表達(dá)（值），IPG集團(tuán)，固相pH梯度;新聞通訊社，胞內(nèi)多糖;的MALDI - TOF法，矩陣輔助激光解吸電離時(shí)間

3、飛行，PEP的，警校，磷酸：葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng);產(chǎn)品市場(chǎng)管理，肽質(zhì)量映射; YATP，ATP的產(chǎn)量，每摩爾ATP的細(xì)胞干重; YGlc，細(xì)胞產(chǎn)量，每摩爾葡萄糖細(xì)胞干重 齲齒引發(fā)的是與臨床相關(guān)產(chǎn)酸和耐酸細(xì)菌分泌和容忍的有機(jī)酸性發(fā)酵的碳水化合物代謝副產(chǎn)物。通過(guò)它們對(duì)牙齒琺瑯質(zhì)除鹽作用，這些有機(jī)酸都發(fā)起并有助于疾病的病因。在過(guò)去50年中，齲齒的研究集中于口腔鏈球菌，尤其是變形鏈球菌，目前接受的是與他的?。I田斯萊德，1980年;哈珀萊歇，1984年開(kāi)始相關(guān)的各種形式;萊歇，1986年;面包車(chē)烏特，1994年;車(chē)Ruyven等。，2000）。 許多研究一直致力于研究鏈球菌糖代謝，特別是生物化學(xué)和允許

4、變形鏈球菌產(chǎn)生酸和生存在口腔內(nèi)pH值低的生理適應(yīng)。從歷史上看，本研究采用了一種還原論的方法來(lái)研究，如酶的變構(gòu)調(diào)節(jié)和代謝通量的改變（巖見(jiàn)及山田，1980年;漢密爾頓，1984年;山田，1987年;卡爾松和漢密爾頓，1996年; Quivey等生化過(guò)程基地。，2001）。一個(gè)最近的一些報(bào)告，但已較全面的戰(zhàn)略使用蛋白質(zhì)組分析功能來(lái)重新評(píng)估在變形鏈球菌耐酸機(jī)制。例如，通過(guò)雙向電泳（2 -胃排空的14C標(biāo)記的細(xì)胞蛋白質(zhì)）的分析顯示了64個(gè)蛋白質(zhì)上調(diào)，以及49項(xiàng)下調(diào)，當(dāng)細(xì)胞從震驚pH值pH值5至75 0。這些蛋白質(zhì)的身份仍有待確定（Svensäter等。，2000）。在一項(xiàng)相關(guān)研究中，18個(gè)蛋白

5、質(zhì)上調(diào)和12個(gè)下調(diào)時(shí)，比較了S的2 -胃排空蛋白質(zhì)組變形鏈球菌生長(zhǎng)在了一批文化，沒(méi)有啟動(dòng)的pH控制pH值，70和5 2。由質(zhì)譜分析，確定了27個(gè)蛋白質(zhì)，13人參與糖代謝的運(yùn)輸和中部（威爾金斯等人。，2002）。在這后一份報(bào)告，變形鏈球菌是在收割和分析中指數(shù)的階段，在這階段，兩地文化的pH值下降到672和4分別。顯著不同的世代時(shí)間分別獲得10 h和66小時(shí)在兩個(gè)pH值（威爾金斯等人。，2002）。這是在培養(yǎng)一批pH值的變化作出了在蛋白質(zhì)難以觀測(cè)到的變化的了解，以評(píng)估有關(guān)pH值衡量，因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)一批收獲不斷應(yīng)對(duì)不斷變化的外部環(huán)境。相反，連續(xù)培養(yǎng)法在本研究使用具有讓細(xì)胞在穩(wěn)定狀態(tài)下嚴(yán)格規(guī)定的條件采樣

6、的優(yōu)勢(shì)，從而實(shí)現(xiàn)真正的比較蛋白質(zhì)組分析時(shí)，個(gè)別參數(shù)更改。 在目前的研究中，變形鏈球菌蛋白質(zhì)組，穩(wěn)定增長(zhǎng)狀態(tài)，在pH 7在人工唾液中定義的0，一直與細(xì)胞生長(zhǎng)在pH為5比0。這種方法已被選定為模仿更容易與主機(jī)的比較在一個(gè)健康的人牙菌斑的條件。同時(shí)，在一個(gè)層面上，這一分析強(qiáng)調(diào)了在耐酸性的表型的適應(yīng)程度，它已在另一個(gè)顯示，在對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化似乎只限于關(guān)鍵的代謝途徑;值得注意的是，糖酵解，產(chǎn)酸，和對(duì)支鏈氨基酸的合成。相對(duì)于以往的研究在無(wú)（Svensäter等。，2000），或少于18（威爾金斯等人。，2002年）在這些通路的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，本研究發(fā)現(xiàn)在這三個(gè)83的酶生化途徑。該數(shù)據(jù)與假設(shè)

7、一致，即變形鏈球菌適應(yīng)酸性環(huán)境，減少氫離子的生產(chǎn)，使用了一系列不同的戰(zhàn)略。這是如此，盡管對(duì)ATP對(duì)H +分泌和利用由此產(chǎn)生的碳同化過(guò)程解耦需要從流失。 菌株及生長(zhǎng)條件。 變形鏈球菌LT11（道等人連續(xù)的文化。，1993）厭氧條件下生長(zhǎng)在一個(gè)貧化率（四）0100 ± 0001的H - 1，在pH 70 ± 01或pH值50 ± 01養(yǎng)分限制為葡萄糖，如前面所述（雅克等人。，1979）。用萬(wàn)用表中，沒(méi)有粘液，但修改為包括腺嘌呤，鳥(niǎo)嘌呤和尿嘧啶在20微克毫升- 1，15毫米和15 mM的磷酸氫二鉀磷酸二氫鉀（錫松斯等。，1991）。分析表明，變形鏈球菌是有限的葡萄糖在D

8、 = 01的H - 1，pH值都在0和7在pH 50，因?yàn)?9和9989，分別是葡萄糖，在培養(yǎng)基為利用，而添加的氨基酸都仍然過(guò)剩（平均利用率為75，在pH 70，在pH 50 72）。 制備細(xì)胞蛋白質(zhì)。 當(dāng)已經(jīng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，在培養(yǎng)容器的細(xì)菌含量，收獲，清洗及凍干，然后等分（10毫克干重）的細(xì)胞經(jīng)mutanolysin（萊恩等人。，2003）。蛋白質(zhì)是要在酸性固相pH梯度（IPG集團(tuán)）條（pH值40-67）如前面所述提?。ㄈR恩等人分開(kāi)。，2003年），除了1（瓦特/ V）的amidosulfobetaine - 14（ASB的- 14）和65毫米數(shù)碼地面電視的生產(chǎn)增加了一個(gè)修改為2解磷解胃排空。

9、雖然這些試劑的加入提高了蛋白質(zhì)可以隨時(shí)在2看出胃排空凝膠點(diǎn)的總數(shù)，將其列入選擇性抑制提取或一弱先前已經(jīng)表示，可視化和蛋白質(zhì)少數(shù)隨后分離/或確定在2胃排空凝膠（萊恩等人。，2003）。 蛋白質(zhì)是在基礎(chǔ)IPG膠條（pH值6-11）是從mutanolysin處理的細(xì)胞獲得兩部分溶程序分開(kāi)。下面的細(xì)胞裂解液（12 000克，4，10分鐘）離心，細(xì)胞沉淀是儲(chǔ)存在-20 ° C和蛋白質(zhì)的沉淀上清于-20 °，15（重量/體積ç過(guò)夜）三氯乙酸。經(jīng)過(guò)離心（12 000克，4，10分鐘）和2名甲醇洗滌，沉淀的蛋白質(zhì)溶解在300微升1：1混合改性增溶液（無(wú)的ASB - 14）細(xì)胞及細(xì)

10、胞器膜和增溶試劑（Sigma - Aldrich公司），含1（5 / 5）劑Triton X - 100及2 mm丁基。被凍結(jié)的細(xì)胞沉淀解凍，再由超聲波懸?。ú继m森超聲波，50瓦，10x10秒，與彼此間爆裂冰制冷）在700同一溶解微升。核酸外切酶（150 U）的加入，在室溫（20-22 ° C下15分鐘的暫停），以降低任何的DNA。這兩個(gè)細(xì)胞體進(jìn)行合并，在室溫（12 000克，20-22，10分鐘）離心。在此之前國(guó)際盛事基金，100微升碘乙酰胺（500毫米）的混合物中加入在室溫（20-22 ° C下）2小時(shí) 2胃排空。 為了分開(kāi)2胃排空，是從075毫克重干細(xì)胞溶解在150微

11、升修改到窄范圍2 -胃排空解磷解決方案之前，杯裝中提取細(xì)胞蛋白的量相當(dāng)于酸性蛋白（pH值40-50，45-55和55-67）IPG膠條（Amersham公司生物科學(xué)），預(yù)先與350相同的修改2胃排空解磷解微升腫脹。對(duì)于基本的細(xì)胞蛋白，IPG膠條（pH值6-11;阿麥斯罕生物科技公司）首次改良2胃排空解磷解前腫脹，沒(méi)有的ASB - 14，但含10（5 / 5）2 -丙醇。細(xì)胞蛋白提取相當(dāng)于1毫克的干細(xì)胞重當(dāng)時(shí)杯裝上IPG膠條。此修改導(dǎo)致了更好的2 -胃排空的基本蛋白質(zhì)的決議。 蛋白質(zhì)主要集中在20 ° C時(shí)使用一個(gè)Multiphor第二電泳系統(tǒng)（Amersham公司生物科學(xué)）蛋白質(zhì)集中

12、在狹窄的范圍IPG膠條為1415 KVH的（100伏為7小時(shí)，由300伏后6小時(shí)，2小時(shí)1000，2500為2小時(shí)，3500 2 H和V V V總5000 V的25 h）和一個(gè)798 KVH的（100伏2小時(shí)，由300伏隨訪2小時(shí)，2小時(shí)1000，2500為2小時(shí)，3500 V V V總就廣泛的范圍IPG膠條12小時(shí)和6小時(shí)5000五）。繼上10-18不亞于維梯度的SDS - PAGE分離，凝膠進(jìn)行染色與Sypro紅寶石的圖像分析，然后被'雙染'通用模塊構(gòu)建與考馬斯亮藍(lán)的G - 250為現(xiàn)貨切除，胰蛋白酶消化和質(zhì)量光譜分析（萊恩等人。，2003）。 1998年第03 Sypro

13、紅寶石染2凝膠蛋白斑點(diǎn)胃排空高度重復(fù)性觀察樣品間從同一生長(zhǎng)pH（數(shù)據(jù)未顯示）獲得。 密度/體積，或差異表達(dá)（DE）的價(jià)值（任意單位）各Sypro紅寶石染蛋白質(zhì)點(diǎn)，決心用軟件Z3的（Compugen）。在這項(xiàng)研究中，與此相關(guān)的量化形式主要來(lái)源是錯(cuò)誤的2 -重復(fù)性胃排空顯示自己，因?yàn)樯锏淖兓峭ㄟ^(guò)對(duì)文化的恒化器，以減少使用的細(xì)菌。這2 -胃排空顯示是錯(cuò)誤的主要來(lái)源是通過(guò)比較隨機(jī)選擇的25個(gè)蛋白點(diǎn)，從廣泛的范圍IPG膠條（pH值40-70）分隔兩地顯示選擇署署長(zhǎng)胃排空值確認(rèn)。從樣本一式三份等價(jià)蛋白連續(xù)培養(yǎng)3個(gè)重復(fù)每個(gè)點(diǎn)進(jìn)行了分析。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，2胃排空是錯(cuò)誤的決定署署長(zhǎng)值的主要來(lái)源。因此，各一式三

14、份的pH值在細(xì)胞生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)樣本為所有2胃排空用于分析，并在現(xiàn)場(chǎng)的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的增加是根據(jù)在平均DE值的變化。 蛋白異構(gòu)體。 一詞異構(gòu)體'是用在這里來(lái)描述多收取的一種蛋白質(zhì)，在2胃排空凝膠，在那里觀察到的平均從第二個(gè)（經(jīng)SDS - PAGE）尺寸計(jì)算出每種形式存在形式議員偏離了5或以下，和那里是沒(méi)有肽質(zhì)量退化任何形式的截?cái)嗷蛴成涞淖C據(jù)。 質(zhì)譜分析。 胰蛋白酶在凝膠消化，濃縮，低拷貝數(shù)蛋白脫鹽，和基質(zhì)輔助激光解吸電離時(shí)間飛行（的MALDI - TOF）質(zhì)譜分析，進(jìn)行（如前面所述）在每個(gè)點(diǎn)的蛋白質(zhì)是獨(dú)特的表達(dá)差異，或在pH 70或pH值50，或者形成利益的代謝途徑（萊恩等人的一部分。，20

15、03）。大規(guī)模從復(fù)制在兩個(gè)增長(zhǎng)pH值2胃排空凝膠，每個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)光譜分析，用確認(rèn)已經(jīng)由Z3的軟件匹配蛋白質(zhì)的身份。 蛋白質(zhì)鑒定。 肽質(zhì)量映射（產(chǎn)品市場(chǎng)管理）的蛋白質(zhì)進(jìn)行了分析，如前面所述，使變形鏈球菌UA159的重疊群使用的6個(gè)基因組10月6日2001年在所有六個(gè)閱讀框（萊恩等人翻譯的下載。，2003年） 。最初的6個(gè)重疊群中使用了這種方式在這些重疊群發(fā)現(xiàn)一些基因沒(méi)有在最后的注釋本中。 氨基酸分析。 在花中的游離氨基酸含量進(jìn)行分析柱前6 - aminoquinolyl -的N -羥基氨基甲酸酯衍生化，采用水AccQFluor試劑盒（科恩及米肖，1993;科恩及DeAntonis，1994）。氨基

16、酸衍生物進(jìn)行了分離和量化反相（C18柱）高效液相色譜法，使用水AccQTag列（15 cmx39毫米號(hào)），根據(jù)制造商的協(xié)議（科恩，2001）。高效液相色譜法進(jìn)行了一水聯(lián)盟2695分離模塊，474熒光檢測(cè)器和2487雙升吸光度檢測(cè)器，串聯(lián)?？刂坪头治鲕浖蛸x權(quán)臨模塊。色氨酸進(jìn)行了分析紫外檢測(cè)，熒光檢測(cè)和所有其他氨基酸。 代謝產(chǎn)物分析。 葡萄糖的濃度，醋酸，乙醇，甲酸和乳酸在穩(wěn)態(tài)測(cè)量中目前使用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)試劑盒（羅氏enzymically），根據(jù)制造商的指示（哈蒂及漢德利，1988）。胞內(nèi)多糖的累積金額（IPS）的測(cè)定等人的DiPersio碘化鉀法。 （1974年）。 一個(gè)穩(wěn)態(tài)組合連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)，縮

17、小范圍IPG膠條允許檢測(cè)，對(duì)Sypro紅寶石染2胃排空凝膠，155個(gè)蛋白點(diǎn)差異表達(dá)的細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)耐酸增長(zhǎng)超過(guò)15倍變形鏈球菌在pH 50。其中，123人確定了質(zhì)譜分析，并發(fā)現(xiàn)與53個(gè)法規(guī)和相關(guān)/或壓力的反應(yīng)途徑（萊恩等人。，2004）。其余70個(gè)蛋白點(diǎn)都與代謝;大部分是與糖酵解有關(guān)的，替代產(chǎn)酸和支鏈氨基酸的合成（表1）。    表1。代謝蛋白表達(dá)的差異變形鏈球菌生長(zhǎng)在pH 70或pH值50 葡萄糖的吸收和質(zhì)子擠壓 在pH 70，變形鏈球菌優(yōu)先運(yùn)輸?shù)拿傅牡诙哂H和力物磷酸葡萄糖：葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PEP的，警校），清理垃圾葡萄糖分子（埃爾伍德等人的能力。，19

18、79）。兩個(gè)這樣的系統(tǒng)存在變形鏈球菌：EIIman，已得到很好的特點(diǎn)，并EIIglc，它們的存在主要是基于對(duì)生理性意見(jiàn)（Vadeboncoeur，1984;內(nèi)龍Vadeboncoeur，1987）。然而，連續(xù)的文化研究表明，變形鏈球菌是完全缺乏EIIman和EIIglc活動(dòng)在pH 50（Vadeboncoeur等。，1991）。在這個(gè)酸性pH值，細(xì)菌優(yōu)先利用非警校葡萄糖通透系統(tǒng)（漢密爾頓和圣馬丁，1982年; Dashper與雷諾，1990年;巴克利和漢密爾頓，1994年），同時(shí)保持增加其質(zhì)子水平較堿性細(xì)胞質(zhì)-移位F1F0 - ATP酶（漢密爾頓和巴克利，1991年; Cvitkovitch等

19、。，1995）。在最近的變形鏈球菌基因組注釋?zhuān)珱](méi)有確定具體的基因編碼葡萄糖通透（Ajdi等。，2002）。 質(zhì)譜分析沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何與固有膜中變形鏈球菌葡萄糖攝取的蛋白質(zhì)。由于未能檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性菌固有的疏水膜蛋白變性是一種帶有2胃排空蛋白質(zhì)組分析（萊恩等人共同的問(wèn)題。，2003）。盡管有此限制，兩個(gè)細(xì)胞質(zhì)組成形式，EIIABman（ManL）的EIIman PEP的，警察訓(xùn)練學(xué)校，被確定（圖1，表1）。不幸的是，這兩種形式，對(duì)16 060名議員和14 940 ± 80 ± 30，與電點(diǎn)444 ± 005和446 ± 002，分別為（6只），分別為C -末端

20、截?cái)?。他們只代表了部分蛋白質(zhì)EIIA，肽質(zhì)量指紋以來(lái)覆蓋區(qū)域僅限于EIIA（數(shù)據(jù)未顯示）。雖然EIIman人教版，警校EIIABman組件已申報(bào)為組成型表達(dá)變形鏈球菌（Vadeboncoeur，1984年），該蛋白質(zhì)被截?cái)嗟男再|(zhì)，本研究發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重限制了觀察到的68倍下降的解釋調(diào)節(jié)這些蛋白質(zhì)在pH 50。這種限制也適用于是否下調(diào)反映了在PEP的葡萄糖，這些酸性條件下警校（圖1，表1減少使用問(wèn)題）。    圖。 1。比較表達(dá)，在細(xì)胞生長(zhǎng)，在pH 750 0或在運(yùn)輸和葡萄糖糖酵解有關(guān)的變形鏈球菌蛋白。在橢圓柱代表的相對(duì)平均DE值（任意單位）每個(gè)蛋白點(diǎn)在2胃排空凝膠鑒定?？?/p>

21、選擇丟棄值大于100萬(wàn)個(gè)是一個(gè)高度打破所示。在pH 50，蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行上調(diào)（綠色），下調(diào)（紅色），非差異表達(dá)（<15倍的差異，灰色），或獨(dú)特的表達(dá)（藍(lán)色），相對(duì)于pH值7 0。膜蛋白的蛋白質(zhì)組分析沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有淡藍(lán)色矩形顯示。括號(hào)中的數(shù)字對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)數(shù)目表1;上標(biāo)確定蛋白點(diǎn)的N端（1）或C -末端（二）片段。  相反，葡萄糖激酶（GLK級(jí)），所需的任何自由進(jìn)入的方式通過(guò)一項(xiàng)通透細(xì)胞葡萄糖依賴(lài)ATP的磷酸化，上漲了由21倍，在pH調(diào)節(jié)50。但是，由于葡萄糖激酶擁有約80（波特等人的最佳pH值。，1982年），其相對(duì)活性和穩(wěn)定性都受到了細(xì)胞質(zhì)酸化在生長(zhǎng)pH為50，其中內(nèi)部pH值會(huì)減少超

22、過(guò)65（Dashper與雷諾，1990年;漢密爾頓，1990年;石見(jiàn)等。，1992）。由于對(duì)糖酵解最適pH似乎是70（Dashper雷諾茲，1992年），在細(xì)胞質(zhì)pH值下降最可能解釋了為什么葡萄糖激酶是糖酵解的速率控制步驟時(shí)，細(xì)胞在pH 70是懸浮在低增長(zhǎng)pH值在體外（巖見(jiàn)及山田，1980）。在觀察蛋白質(zhì)的增加可能因此只反映了需要克服這種抑制作用在細(xì)胞生長(zhǎng)，在pH 50。 在變形鏈球菌的質(zhì)子移位F1F0 - ATP酶的擠出氫離子耐酸研究已受到相當(dāng)?shù)闹匾暎且驗(yàn)殒溓蚓|(zhì)膜質(zhì)子滲透（班德等人。，1986）。阿75倍在（AtpA）和36在了F1這項(xiàng)復(fù)雜的組件（AtpC）亞基倍，觀察pH值增加50（圖

23、1，表1）。這種觀察與顯示的H + - ATPase的變形鏈球菌增加因應(yīng)環(huán)境酸化水平，以維持一個(gè)跨膜pH梯度（pH值）與細(xì)胞內(nèi)部，更多的堿性（貝利及以前的數(shù)據(jù)相一致侯爵，1991年;漢密爾頓和巴克利，1991年; Dashper與雷諾，1992年; Quivey等。，2001）。 糖酵解 葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞中，無(wú)論是人教版，警校或通透/葡萄糖激酶通路，進(jìn)入恩布登-邁爾霍夫-帕爾納斯葡萄糖6磷酸糖酵解途徑，并轉(zhuǎn)化為丙酮酸。作者在對(duì)2個(gè)蛋白點(diǎn)確定胃排空凝膠（圖1，表1個(gè)不同途徑的酶每本）。 在該恩布登-邁爾霍夫-帕爾納斯通路上半年代謝中間體上形成的分析表明，6級(jí)的葡萄糖磷酸略有升高時(shí)，變形鏈球菌是在連

24、續(xù)培養(yǎng)生長(zhǎng)在pH 55和D = 015的H - 1，而所有其他中間體的含量基本相同，直至并包括磷酸二羥丙酮和甘油三磷酸（巖見(jiàn)等。，1992）。在此基礎(chǔ)上，葡萄糖-6磷酸異構(gòu)酶（簡(jiǎn)稱(chēng)GPI增加一倍）和一個(gè)整體15倍的果糖1,6二磷酸醛縮酶（的FBA三個(gè)亞型水平的提高），類(lèi)似于以前觀察在分批培養(yǎng)（威爾金斯等人。，2002年;圖。1，表1），可能反映了需要克服的細(xì)胞質(zhì)酸化對(duì)酶活性的影響，在pH 50。有些保健應(yīng)在行使這種簡(jiǎn)化的解釋?zhuān)?，因?yàn)殡p方都果糖6磷酸和甘油三磷酸可能需要作為轉(zhuǎn)酮酶底物（TKT公司），以增加核糖核酸的合成，在pH 50（見(jiàn)下文）。 不僅是在ATP的形式在糖酵解產(chǎn)生能量，但合成代

25、謝反應(yīng)也前兆。例如，一個(gè)特定的變形鏈球菌具有輔酶依賴(lài)性甘油三磷酸脫氫酶（GapN）繞過(guò)第一個(gè)ATP產(chǎn)生的糖酵解步驟，以生成還原（布朗Wittenberger，1971a合成反應(yīng)所需的NADPH;烏鴉Wittenberger，1979年;博伊德等。，1995;圖。1）。這種酶是必不可少的，因?yàn)樽冃捂溓蚓哂屑炔粚儆谖焯橇姿嵫h(huán)氧化的部分，也不是對(duì)輔酶NADH的所（布朗和Wittenberger，1971b減少transhydrogenase）。 20 - 34倍增加的輔酶依賴(lài)性甘油三磷酸脫氫酶的兩個(gè)異構(gòu)體量平均在pH 50，隨著對(duì)異構(gòu)體的含量變化與NAD依賴(lài)甘油三磷酸脫氫酶（GAPDH）和磷酸激

26、酶（精確制導(dǎo)組件），強(qiáng)調(diào)通過(guò)通路的兩個(gè)分支（圖1，表1）在確定碳通量的困難。但是，由于整體代表27倍，輔酶依賴(lài)性甘油三磷酸脫氫酶增加，在pH 50近兩倍于其他兩個(gè)備選糖酵解氧化酶每個(gè)分支的累積水平不斷上升，這表明，輔酶依賴(lài)性甘油三磷酸脫氫酶可能確實(shí)是最重要的是決定這個(gè)方向。這將是在與合成代謝活動(dòng)所需，以維持高如蛋白質(zhì)和DNA在非最佳酸性細(xì)胞質(zhì)（烏鴉與Wittenberger，1979年; Quivey等的分子水平保持結(jié)構(gòu)完整性。，2001年;萊恩等人。 ，2004）。這種觀點(diǎn)是完全支持2 -胃排空凝膠在由一個(gè)高層次的轉(zhuǎn)酮酶（TKT公司）檢測(cè)pH值50。轉(zhuǎn)酮酶形成的糖酵解途徑重定向到磷酸戊糖途徑

27、甘油三磷酸果糖和6 -磷酸交界處，并最終合成核苷酸（圖1，表1）。 3種酶參與了3 -磷酸最終轉(zhuǎn)化為丙酮酸。其中第一，phosphoglyceromutase，是由6個(gè)代表在變形鏈球菌基因組（Ajdi等等位基因。，2002）。在這兩種蛋白質(zhì)的檢測(cè)產(chǎn)品，一（PmgY）是上調(diào)27倍，pH為50，而其他（PGM）中是在此pH值（圖1，表1缺席）。最后糖酵解酶，丙酮酸激酶（Pyk），4個(gè)亞型也上調(diào)在pH 50 24 - 71 - 23 - 78倍。丙酮酸激酶被認(rèn)為是關(guān)鍵的速率限制在變形鏈球菌糖酵解調(diào)節(jié)步驟，因?yàn)樗怯善咸烟?磷酸激活的，而是由無(wú)機(jī)磷（山田和卡爾松，1975年b;阿貝和山田，1982年抑

28、制;石見(jiàn)與山田，1980）。然而，對(duì)在恩布登-邁爾霍夫-帕爾納斯糖酵解酶的主要形式前減少93，烯醇化酶（伊諾），連同其他輕微高先生和截?cái)嘈问降臏p少，預(yù)計(jì)將有顯著影響碳流在pH 50，尤其是在為烯醇化酶的最適pH值是75（BunickKashet，1981）。 由于在連續(xù)培養(yǎng)變形鏈球菌生長(zhǎng)，是衡量血糖人教版，警?；顒?dòng)缺乏在pH 50（Vadeboncoeur等。，1991年），磷酸無(wú)須啟動(dòng)該攝取葡萄糖的磷酸化級(jí)聯(lián)系統(tǒng)。最后三個(gè)糖酵解酶的水平，在pH為50與1的磷酸減少池，因?yàn)橄┐蓟杆降慕档?，整體28倍，丙酮酸激酶的四個(gè)異構(gòu)體的增加，同時(shí)，一致將預(yù)期到二，磷酸丙酮酸沒(méi)有向任何集結(jié)磷酸。這個(gè)想法

29、是支持四個(gè)中間體，三磷酸，2磷酸，磷酸和測(cè)量在S丙酮酸，變形鏈球菌生長(zhǎng)在pH值55和D = 015的H - 1，其中3人的水平 - 磷酸和磷酸減少，2 -磷酸這仍然未變，丙酮酸增加（巖見(jiàn)等人的數(shù)額。，1992）。這是由另一進(jìn)一步研究，其中一個(gè)細(xì)胞內(nèi)pH值下降可以顯著提高丙酮酸：磷酸比（巖見(jiàn)及山田，1980）的支持。磷酸也是L -乳酸脫氫酶（山田和卡爾松，1975年b;山田，1987年）的抑制劑，這種代謝物如此之低的水平將允許更高的乳酸濃度在pH 50累積，如確實(shí)如此（表2，見(jiàn)下文）。    表2。生長(zhǎng)pH值對(duì)產(chǎn)量和最終的代謝產(chǎn)物變形鏈球菌在S 數(shù)字代表了至少3確定

30、的意思。 YATP決心根據(jù)哈蒂及漢德利（1988）的假設(shè)。 NAD的再生 在變形鏈球菌，丙酮酸可以轉(zhuǎn)化成酸性終端產(chǎn)品（圖2）新品種。在有氧環(huán)境下，變形鏈球菌利用丙酮酸脫氫酶丙酮酸轉(zhuǎn)換為乙酰輔酶A（卡爾松等人。，1985）。盡管這種酶，應(yīng)根據(jù)本研究利用經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)的厭氧條件不活躍，在兩個(gè)多酶丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的三個(gè)組成部分，乙偶姻脫氫酶E1的組成部分，（AcoB），和C -末端片段對(duì)二氫的S -乙酰轉(zhuǎn)移酶（AdhC），確定了2 -胃排空凝膠（圖2，表1）。  圖。 2。比較表達(dá)，在細(xì)胞生長(zhǎng)，在pH 70或50，在NADH氧化變形鏈球菌參與蛋白質(zhì)和葡萄糖的替代使用6磷酸鹽。在橢圓柱代表的相對(duì)

31、平均DE值（任意單位）每個(gè)蛋白點(diǎn)在2胃排空凝膠鑒定。在pH 50，蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行上調(diào)（綠色），下調(diào)（紅色），非差異表達(dá)（<15倍的差異，灰色），或獨(dú)特的表達(dá)（藍(lán)色），相對(duì)于pH值7 0。膜蛋白的蛋白質(zhì)組分析沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有淡藍(lán)色長(zhǎng)方形所示，而在橢圓形的棕褐色鑒定以前，（萊恩等人。，2003）。括號(hào)中的數(shù)字對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)數(shù)目表1;上標(biāo)確定蛋白點(diǎn)的N端（1）或C -末端（二）片段。 在厭氧條件下，在過(guò)量葡萄糖，L -乳酸是由L -乳酸脫氫酶（LDH）。在降低丙酮酸為L(zhǎng) -乳酸，NADH的氧化為NAD和細(xì)胞的氧化還原平衡得以維持。但是，在厭氧條件下，當(dāng)葡萄糖限制，這種細(xì)菌依靠丙酮酸甲酸裂解酶途徑，它有兩

32、個(gè)分支，導(dǎo)致無(wú)論對(duì)甲酸和乙酸或乙醇的形成（卡爾松和格里菲斯，1974;山田形成與卡爾松，1975年b;山田，1987）。乙醇分支包括兩個(gè)步驟，其中有2 NADH的氧化為2 NAD的。在變形鏈球菌，這兩個(gè)步驟，其中乙酰輔酶A是先轉(zhuǎn)換為乙醛，然后到乙醇，是由雙功能酶催化，酒精，乙醛脫氫酶（粘附）。在通路，一個(gè)額外的ATP的生成醋酸分公司為乙酰輔酶A，先轉(zhuǎn)換為磷酸鹽，然后乙酰乙酸，與隨之而來(lái)的ADP的轉(zhuǎn)化為ATP的影響。通過(guò)對(duì)醋酸和丙酮酸，甲酸裂解酶途徑適當(dāng)使用乙醇分行，變形鏈球菌可以隨時(shí)調(diào)整NADH氧化實(shí)際需要。如果沒(méi)有進(jìn)一步的合成代謝的最終產(chǎn)品轉(zhuǎn)移，由糖酵解產(chǎn)生甲酸金額相當(dāng)于醋酸和乙醇總量。 蛋

33、白質(zhì)組分析顯示，在2胃排空凝膠檢測(cè)L -乳酸脫氫酶的兩個(gè)亞型被上調(diào)，在pH 525 0 - 17倍，而pH值在70的水平。這些值是類(lèi)似于一共有17倍報(bào)告所指出的關(guān)于L -乳酸脫氫酶中變形鏈球菌的三個(gè)亞型2和胃排空凝膠口腔鏈球菌生長(zhǎng)時(shí)的5個(gè)亞型無(wú)批次pH值控制文化（威爾金斯等人。，2001年，2002年）。在L -乳酸脫氫酶同工酶增加我們的研究中觀察到的是不太可能的解釋在根據(jù)（表2）酸性條件下生產(chǎn)的L -乳酸量127倍，盡管L -乳酸脫氫酶具有廣泛的在酸性催化活性的最佳pH值范圍0-652，類(lèi)似的pH值范圍0-66細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的pH值增長(zhǎng)5 50（Dashper與雷諾，1990年;漢密爾頓，1

34、990 ;石見(jiàn)等。，1992）。更有可能的解釋是，這種酶是糖酵解中間調(diào)節(jié)pH值在較低的增長(zhǎng)（山田和卡爾松，1975年b;高橋等人。，1982年;山田，1987）。 雖然沒(méi)有在對(duì)丙酮酸甲酸裂解酶表達(dá)水平的變化是在目前的研究發(fā)現(xiàn)，由于沒(méi)有檢測(cè)到酶2 -胃排空凝膠（圖2，表1），酒精，乙醛脫氫酶同工酶的6人，平均下調(diào)70倍，在pH 50，而眾多的C -末端截短形式是在這個(gè)pH值或下調(diào)或丟失。醋酸激酶（AckA）在醋酸分支，也被下調(diào)的一個(gè)因素調(diào)節(jié)21。相比之下，磷酸轉(zhuǎn)水平的提高，在pH 50（角17倍;圖。2，表1）。盡管一般的蛋白質(zhì)表達(dá)減少整體觀察在丙酮酸甲酸裂解酶途徑這兩個(gè)分支2凝膠胃排空，增加數(shù)

35、額甲酸，醋酸，乙醇生產(chǎn)了在pH 50，隨著乙醇的水平為4 6倍，在pH大于70（見(jiàn)表2）。這個(gè)觀察可以解釋主要是由增加糖酵解率（漢密爾頓，1984年）需要生產(chǎn)的H +擠壓在pH 50（本德?tīng)柕華TP的影響。，1986;貝利和侯爵，1991年;漢密爾頓和巴克利，1991年;宮城等基地。，1994;史密斯等人。，1996）。事實(shí)上，有一個(gè)碳在pH 50徒勞的使用是在ATP的產(chǎn)量均減少測(cè)量反映，（YATP;哈蒂及漢德利，1988）9日至16日39克（干重）細(xì)胞每摩爾三磷酸腺苷，細(xì)胞產(chǎn)量（YGlc），從0到28151克（干重）每摩爾葡萄糖，當(dāng)pH值下降的增長(zhǎng)從細(xì)胞750到0（表2）。但顯然沒(méi)有阻止替代

36、酸生產(chǎn)，問(wèn)題是是否在乙醇和丙酮酸甲酸，醋酸分支酶途徑酶在細(xì)胞水平降低成為越來(lái)越多的限制，在pH 50，這樣增強(qiáng)了流動(dòng)丙酮酸通過(guò)L -乳酸脫氫酶途徑。 支鏈氨基酸的形成 甲酸鹽在下降：（乙+乙醇）的比例最高糖酵解從理論價(jià)值，10到1 056，觀察值pH值在50（見(jiàn)表2）。由于醋酸濃度為pH值都相同，在甲酸在pH 50相對(duì)減少變形鏈球菌建議，這是進(jìn)一步代謝酸。替代方案的乙醇產(chǎn)量的增加被其他代謝過(guò)程，可以排除，因?yàn)榫凭荒芡ㄟ^(guò)丙酮酸甲酸裂解酶途徑形成。比較蛋白質(zhì)組分析顯示，在一些對(duì)甲酸在pH 50的命運(yùn)在于支鏈氨基酸的生物合成途徑，由于增加了與此氨基酸通路在pH 50（圖觀察單相關(guān)的酶 圖

37、。 3。比較表達(dá)，在細(xì)胞生長(zhǎng)，在pH 750 0或在支鏈氨基酸參與蛋白質(zhì)合成變形鏈球菌。在橢圓柱代表的相對(duì)平均DE值（任意單位）每個(gè)蛋白點(diǎn)在2胃排空凝膠鑒定。蛋白質(zhì)點(diǎn)上升，在pH 50（綠色），并下調(diào)調(diào)節(jié)pH值在70（紅色）。蛋白質(zhì)不能鑒定蛋白質(zhì)組分析，在淡藍(lán)色的矩形顯示。括號(hào)中的數(shù)字對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)數(shù)目表1。  在pH 50，四酮醇酸還原異構(gòu)酶異構(gòu)體（IlvC）被上調(diào)39 - 57 - 26 - 35倍，而支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ IlvE）和谷氨酰胺合成酶（GlnA）被上調(diào)27 - 87倍，分別為（圖3，表1）。對(duì)支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)品，2 oxoglutaric酸（-酮戊二酸），也比谷

38、氨酸較弱酸，與28 pKa值和50，而pKa值的22和4 2對(duì)谷氨酸的羧基。支鏈氨基酸會(huì)形成以來(lái)，所有3個(gè)氨基酸的生物合成一個(gè)額外的好處，涉及氨由谷氨酰胺合成酶的形成。這氨氣，加上從絲氨酸生產(chǎn)異亮氨酸生物合成的過(guò)程中，將提供一個(gè)緩沖在50，由于氨的反應(yīng)與H +形成（圖生長(zhǎng)pH在酸性細(xì)胞質(zhì)中變形鏈球菌的替代機(jī)制3）。有趣的是，丙酮酸激酶活性有一個(gè)或鉀離子，或和一個(gè)不似乎不利于（阿貝與山田，1982年;山田，1987年; Pitty和雅克，1989）口腔鏈球菌生長(zhǎng)高濃度的強(qiáng)制性要求。 對(duì)于一個(gè)支鏈中的作用鏈球菌生存氨基酸生物合成在低pH值的支持來(lái)自最近的兩個(gè)觀測(cè)。在嗜熱鏈球菌中，支鏈氨基酸的生物合

39、成途徑已被認(rèn)為是必要的，但并不足以確保最佳生長(zhǎng)，并已發(fā)揮作用，在維護(hù)（內(nèi)部pH值Garault等途徑推測(cè)。，2000）。和乙偶姻合成途徑。在乙偶姻合成途徑導(dǎo)致雙乙酰的形成（圖2）。雖然只有在最后這個(gè)途徑酶，乙偶姻脫氫酶（布塔），于2查明胃排空凝膠，這種酶在pH 50量只有3是在pH 70（表1）表明，是的2 -乙酰乳酸已經(jīng)定向到最亮氨酸/纈氨酸生物合成途徑。 雖然蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，在演唱會(huì)與酸和乙醇的最終產(chǎn)品的分析，都對(duì)支鏈的形成一致的氨基酸，在連續(xù)文化的中這些氨基酸的濃度僅為2，在pH 5高在pH值大于70 0（數(shù)據(jù)未顯示）。不同于其他氨基酸在變形鏈球菌運(yùn)輸系統(tǒng)，支鏈氨基酸的吸收了很好的研究，并

40、已被證明是由質(zhì)子動(dòng)力，推動(dòng)它在細(xì)胞內(nèi)的高支鏈氨基酸水平的成果（Dashper雷諾茲，1990）。從這些細(xì)胞氨基酸損失是由于被動(dòng)流出通過(guò)細(xì)胞膜（Dashper雷諾茲，1990）。由于剩余的支鏈氨基酸濃度每外約03毫米的連續(xù)培養(yǎng)穩(wěn)定狀態(tài)，其細(xì)胞濃度將高達(dá)10毫米（Dashper與雷諾，1990）。因此，一個(gè)在pH 50增加了這些細(xì)胞的生物合成氨基酸不一定會(huì)已在細(xì)胞外水平提高的反映。另外值得一提的是，密碼子使用的分析表明，244中變形鏈球菌蛋白質(zhì)的氨基酸是支鏈氨基酸，這意味著將有一個(gè)很高的蛋白質(zhì)合成這些氨基酸生物合成的要求。 在其他生物合成途徑的改變 在個(gè)別蛋白表達(dá)水平的變化，即不完整的代謝途徑，還確定了2胃排空。這些是與形成葡萄糖1磷酸利用，繼從葡萄糖6磷酸由phosphoglucomutase（PgmA）轉(zhuǎn)換的第一次。一個(gè)C -末端截短的這種酶的形式，檢測(cè)pH值70只（圖2，表1）