微生物限度檢驗操作規(guī)程(2015年版)

1、1 目的規(guī)范微生物限度檢驗操作，確保檢驗結(jié)果準確、可靠。2 依據(jù)中國藥典2015版。3 范圍本標準適用于微生物限度檢驗。4 責任中心化驗室負責人：對本規(guī)程的實施負責。中心化驗室檢驗人員：嚴格按照本規(guī)程執(zhí)行檢驗操作。5 程序5.1 執(zhí)行標準：中國藥典2015版。5.2 抽樣：照取樣標準操作規(guī)程進行。6 內(nèi)容6.1 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)計數(shù)方法包括平皿法、薄膜過濾法和最可能數(shù)法（MPN法）。檢查時，按已驗證的計數(shù)方法進行供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測定。6.1.1 設(shè)備、儀器及用具6.1.1.1 設(shè)備微生物限度檢測室、凈化工作臺、生化培養(yǎng)箱（30350C）、生化培養(yǎng)箱（202

2、50C）、電熱恒溫水浴鍋、烘箱、脈動真空滅菌柜、紫外燈等。6.1.1.2 儀器及器皿顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養(yǎng)皿、量筒、試管及塞、移液槍及吸頭、薄膜過濾器等。6.1.1.3 用具大、小橡皮乳頭，潔凈工作服、口罩、醫(yī)用手套、接種環(huán)、酒精燈、酒精棉球、滅菌剪刀、滅菌鑷子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、薄膜過濾膜等。6.1.2 試液6.1.2.1 消毒液 A0.1% 新潔爾滅溶液 B75%乙醇溶液6.1.2.2 稀釋液、試劑及配制ApH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液：取磷酸二氫鉀3.56g、無水磷酸氫二鈉5.77g、氯化鈉4.3g、蛋白胨1.0g，加純化水1000ml，微溫溶解，濾清，

3、分裝，1210C滅菌15分鐘。B聚山梨酯80C無菌十四烷酸異丙酯DpH6.8無菌磷酸鹽緩沖液6.1.3 培養(yǎng)基胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基6.1.4 操作方法6.1.4.1 試驗前準備6.1.4.1.1 將供試品及所有已滅菌的平皿、錐形瓶、試管、移液槍吸頭（1ml、10ml）、量筒、稀釋液、培養(yǎng)基等移至傳遞窗內(nèi)。每次試驗所用物品必須事先計劃，準備足夠用量，避免操作中出入操作間。6.1.4.1.2 開啟微生物檢測室紫外燈和空調(diào)凈化系統(tǒng)，并使其工作不低于30min。6.1.4.1.3 操作人員進入一更，用洗手液或肥皂洗手，烘干。進入二更，用0.1% 新潔爾滅溶液

4、洗手，穿戴潔凈無菌服、口罩、手套。6.1.4.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用乙醇棉球擦拭供試品瓶、盒、袋等的開口處周圍，待干后用滅菌的手術(shù)鑷或剪將供試品啟封。6.1.4.2 供試液的制備根據(jù)供試品的理化特征與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時，應(yīng)均勻加熱，且溫度不應(yīng)超過45。供試液從制備至加入檢驗用培養(yǎng)基，不得超過1小時。常用的供試液制備方法如下。如果下列供試液制備方法經(jīng)確認均不適用，應(yīng)建立其他適宜的方法。6.1.4.2.1 水溶性供試試品取供試品，用pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋制成1：10供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至68

5、。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。6.1.4.2.2 水不溶性非油脂類供試品取供試品，用pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋制成1：10供試液。分散力較差的供試品，可在稀釋液中加入表面活性劑如0.1的聚山梨酯80，使供試品分散均勻。若需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至68。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。6.1.4.2.3 油脂類供試品 取供試品，加入無菌十四烷酸異丙酯使溶解，或與最少量并能使供試品乳化的無菌聚山梨酯80或其他無抑菌性的無菌表面活性劑充分混勻。表面活性劑的溫度一般不超過40（特

6、殊情況下，最多不超過45），小心混合，若需要可在水浴中進行，然后加入預(yù)熱的稀釋液使成1：10供試液，保溫，混合，并在最短時間內(nèi)形成乳狀液。6.1.4.2.4 腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品取供試品10g，加入pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液，置45水浴中，振搖，使溶解，制成1：10的供試液。6.1.4.3 供試液的稀釋取1:10均勻供試液1ml，加入裝有9mlpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的試管中混勻，即為1:100供試液。以此類推，根據(jù)供試品污染程度，可稀釋至1:1000、1:10000等適宜稀釋級。每遞增1稀釋劑，必須另換一支吸管。6.1.4.4 檢查法6.1.4.4.1 檢驗量檢驗量即一次試驗所用

7、的供試品量（g、ml、cm2）。一般應(yīng)隨機抽取不少于2個最小包裝的供試品，混合，取規(guī)定量供試品進行檢驗。除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗量為10g或10ml；膜劑為100cm2；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。檢驗時，應(yīng)從2個以上最小包裝單位中抽取供試品。6.1.4.4.2 平皿法6.1.4.4.2.1 取規(guī)定量供試品，按方法適用性試驗確認的方法進行供試液的制備和菌數(shù)測定，每稀釋級每種培養(yǎng)至少制備2個平板。6.1.4.4.2.2 陰性對照 以稀釋液代替供試液進行陰性對照試驗，陰性對照試驗應(yīng)無菌生長。如果陰性對照有菌生長，應(yīng)進行偏差調(diào)查。6.1.4.4.2.3 傾注培養(yǎng)基將預(yù)先配制好的培養(yǎng)

8、基（需氧菌總數(shù)計數(shù)用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）熔化，置45。C水浴中，備用。將45。C左右的瓊脂傾注上述各個平皿約15ml，以順時針或反時針方向快速轉(zhuǎn)動平皿（勿使培養(yǎng)基溢出）使供試液與培養(yǎng)基混勻，放置，待凝。6.1.4.4.2.4 培養(yǎng)和計數(shù)需氧菌總數(shù)計數(shù)平板倒置于3035培養(yǎng)箱中培養(yǎng)35天。霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)平板倒置于2025培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，必要時可延長至7天。觀察菌落生長情況，點計平板上生長的所有菌落數(shù)，計數(shù)并報告。菌落蔓延生長成片的平板不宜計數(shù)。點計菌落數(shù)后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)。若同稀釋級兩個平板的菌落平均數(shù)

9、不小于15，則兩個平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上。6.1.4.4.2.5 菌數(shù)報告規(guī)則需氧菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu的稀釋級、霉菌和酵母菌總數(shù)測定宜選取平均菌數(shù)小于100cfu的稀釋級，作為菌數(shù)報告的依據(jù)。以最高的平均菌落數(shù)，計算1g、1ml或10cm2供試品中所含的微生物，取兩位有效數(shù)字報告。如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1時，以1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。 6.1.4.4.3 薄膜過濾法6.1.4.4.3.1 薄膜過濾法所采用濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45m，直徑約為50mm，若采用其他直徑的濾膜，沖洗量應(yīng)進行相應(yīng)的調(diào)整。選擇濾

10、膜材質(zhì)時應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml。總沖洗量不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。6.1.4.4.3.2 取相當于每張濾膜含1g或1ml供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過濾。若供試品所含的菌數(shù)較多時，可取適宜稀釋級的供試液1ml,過濾。用pH

11、7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。濾膜貼于平板上是不得有空隙或氣泡，否則影響微生物的生長。6.1.4.4.3.3 陰性對照 取試驗用的稀釋液1ml照上述薄膜過濾法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。6.1.4.4.3.4 培養(yǎng)和計數(shù) 培養(yǎng)條件和計數(shù)方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100cfu。6.1.4.4.3.5 菌數(shù)報告規(guī)則 以相當于1g或1ml供試品的菌落數(shù)報告菌數(shù)；若濾膜上無菌落生長，以1報告菌數(shù)（每張濾膜過濾1g或1ml供試品），或1乘以最低

12、稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。6.1.4.4.4 MPN法MPN法的精密度和準確度不及薄膜過濾法和平皿法，僅在供試品需氧菌總數(shù)沒有適宜計數(shù)方法的情況下使用，本法不適用霉菌計數(shù)。取供試液至少3個連續(xù)稀級，每一稀釋級取3份1ml分別接種至3管裝有910ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。必要時可在培養(yǎng)基中加入表面活性劑、中和劑或滅活劑。接種管置3035培養(yǎng)3天，逐日觀察各管微生物生長情況。如果由于供試品的原因使得結(jié)果難以判斷，可將該管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng)12天，觀察是否有微生物生長。根據(jù)微生物生長的管數(shù)從表1查被測供試品每1g或1ml中需氧菌總數(shù)的最可能數(shù)。 表

13、1 微生物最可能數(shù)檢索表生長管數(shù)需氧菌總數(shù)最可能數(shù)95置信限每管含樣品的g或ml數(shù)MPN/g或ml下限上限0.10.010.001000309.400130.19.501030.1100116.11.2170206.21.2170309.43.5351003.60.2171017.21.217102114351107.41.320111114351201143512115538130165382009.21.5352011443520220538210154382112053821227994220215402212899422235994230299942313699430023594301

14、3891043026416181310439181311751719931212030360313160303803209318360321150303803222103040032329090990330240409903314609019803321100200400033311006.1.4.4.5 結(jié)果判斷需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)（包括真菌菌落數(shù)）；霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)（包括細菌菌落數(shù)）。若因沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的細菌使霉菌和酵母菌的計數(shù)結(jié)果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、慶大霉素）的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)

15、基或其他選擇性培養(yǎng)基（如玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基）進行霉菌和酵母菌總數(shù)測定。使用選擇性培養(yǎng)基時，應(yīng)進行培養(yǎng)基適用性檢查。若采用MPN法，測定結(jié)果為需氧菌總數(shù)。若供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢查結(jié)果均符合該品種項上的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；若基中任何一項不符合該品種項下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定。控制菌檢查控制菌檢查法系用于在規(guī)定的試驗條件下，檢查供試品中是否存在物定的物生物。當本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否符合相應(yīng)的微生物限度標準時，應(yīng)按下列規(guī)定進行檢驗、包括樣品取樣量和結(jié)果判斷等。供試品檢出控制菌或其他致病菌時，按一次檢出結(jié)果為準，不再復(fù)試。供試液制備及實驗環(huán)境要求同需氧菌總數(shù)

16、、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)應(yīng)為內(nèi)容，這個羅列成子項。如果供試品具有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中種。供試品檢查時，若使用了中和劑或滅活劑，應(yīng)確認有效性及對微生對無毒性。供試液制備如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認其對微生物無毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。陽性對照試驗方法同供試品的控制菌檢查，對照菌的加量應(yīng)不大于100cfu。陽性對照試驗應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。陰性對照試驗：以稀釋劑代替供試液照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，陰性對照試驗應(yīng)無菌生長，如陰性對照有菌生長，應(yīng)進行偏差調(diào)查。6.2 大腸埃希菌6.2.1 設(shè)備、儀器及用具6.2.1.1 設(shè)備微生物限度檢測室、陽性菌檢測室、生物安全柜、凈化工作臺、生化培養(yǎng)

17、箱（30350C、42440C）、電熱恒溫水浴鍋、烘箱、滅菌柜、紫外燈等。6.2.1.2 儀器及器皿顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養(yǎng)皿、量筒、試管及塞、吸管、注射器、注射針頭、載玻片、蓋玻片、薄膜過濾器等。6.2.1.3 用具大、小橡皮乳頭，潔凈工作服、口罩、醫(yī)用手套、接種環(huán)、酒精燈、酒精棉球、滅菌剪刀、滅菌鑷子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、薄膜過濾膜等。6.2.2 試液指示液PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、PH6.8無菌磷酸鹽緩沖溶液、革蘭染色液、碘液、95%乙醇。6.2.3 培養(yǎng)基 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基等。6.2.4 操作方法6.2.4.1

18、 供試液制備和增菌培養(yǎng) 取供試品，照“6.1.4.2”制成1：10供試液。取相當于1g或1ml供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，在3035培養(yǎng)1824小時。6.2.4.2 選擇和分離培養(yǎng) 取上述培養(yǎng)物1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中， 4244培養(yǎng)2448小時。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1872小時。6.2.4.3 結(jié)果判斷 若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，應(yīng)進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，判供試品未檢出大腸埃

19、希菌。6.2.4.4 若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，應(yīng)進行分離、純化及適宜的鑒定試驗。以接種針輕輕接觸單個疑似菌落的表面中心，沾取培養(yǎng)物，應(yīng)挑選23個以上疑似菌落，分別接種營養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)1824小時，作以下檢查。6.2.4.4.1 革蘭染色、鏡檢 以接種環(huán)沾取無菌水于潔凈載玻片上,取上述疑似菌落的營養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物少許,制成均勻涂片,自然或微溫干燥,再通過火焰23次(載玻片不燙手)固定。滴加結(jié)晶紫染液,染色1min,水洗,滴加碘液,媒染1min,水洗,以濾紙吸干余水。滴加95%乙醇,脫色2030s,水洗。滴加沙黃染液,復(fù)染1min,待干后,鏡檢。6.2.4.4.2 染色結(jié)果 革蘭

20、陽性菌呈藍紫色;革蘭陰性菌呈紅色,大腸埃希菌為革蘭陰性短桿菌,或球桿菌狀,亦有桿菌狀。6.2.4.4.3 注意事項6.2.4.4.3.1 玻片必須潔凈，涂片菌量宜少，菌不可濃。否則，菌細胞成堆或連成片。染色反應(yīng)難于判斷，菌細胞形態(tài)難于觀察。6.2.4.4.3.2 培養(yǎng)物的菌齡以16-24h為宜。培養(yǎng)時間過長的革蘭陽性菌易染成紅色。6.2.4.4.3.3 脫色是關(guān)鍵，脫色時間不足，菌細胞易染成陽性，脫色時間過長易染成陰性。6.3 耐膽鹽革蘭陰性菌6.3.1 設(shè)備、儀器及用具6.3.1.1 設(shè)備微生物限度檢測室、陽性菌檢測室、生物安全柜、凈化工作臺、生化培養(yǎng)箱（30-350C）、電熱恒溫水浴鍋、烘

21、箱、滅菌柜、紫外燈等。6.3.1.2 儀器及器皿顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養(yǎng)皿、量筒、試管及塞、吸管、注射器、注射針頭、載玻片、蓋玻片、薄膜過濾器等。6.3.1.3 用具大、小橡皮乳頭，潔凈工作服、口罩、醫(yī)用手套、接種環(huán)、酒精燈、酒精棉球、滅菌剪刀、滅菌鑷子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、薄膜過濾膜等。6.3.2 試液、指示液 PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、PH6.8無菌磷酸鹽緩沖溶液等。6.3.3 培養(yǎng)基 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基等6.3.4 操作方法6.3.4.1 供試液制備和預(yù)培養(yǎng) 取供試品，用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為稀釋劑照

22、“6.1.4.2”制成1：10供試液，混勻，在2025培養(yǎng)，培養(yǎng)時間應(yīng)使供試品中的細菌充分恢復(fù)但不增殖（約2小時）。6.3.4.2 定性試驗 除另有規(guī)定外，取相當于1g或1ml供試品的上述預(yù)培養(yǎng)物接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定）腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)2448小時后，劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1824小時。如果平板上無菌落生長，判供試品未檢出耐膽鹽革蘭陰性菌。6.3.4.3 定量試驗 6.3.4.3.1 選擇和分離培養(yǎng) 取相當于0.1g、0.01g和0.001g（或0.1ml、0.01ml、0.001ml）供試品的預(yù)培養(yǎng)物或其稀釋液分別接種至適宜體

23、積（經(jīng)方法適用性試驗確定）腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)2448小時。和述每一培養(yǎng)物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)平板上，3035培養(yǎng)1824小時。6.3.4.3.2 結(jié)果判斷 若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，則對應(yīng)培養(yǎng)管為陽性，否則為陰性。根據(jù)各培養(yǎng)管檢查結(jié)果，從表2查1g或1ml供試品中含有耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數(shù)。表2 耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數(shù)（N）各供試品量的檢出結(jié)果每1g（或1ml）供試品中可能的菌數(shù)cfu0.1g或0.1ml0.01g或0.01ml0.001g或0.001mlN103102N10310N102N10注：（1）+代表紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上

24、有菌落生長；代表紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上無菌落生長。 （2）若供試品量減少10倍（0.01g或0.01ml，0.001g或0.001ml，0.0001g或0.0001ml），則每1g（或1ml）供試品中可能的菌數(shù)（N）應(yīng)相應(yīng)增加10倍。6.4 沙門菌6.4.1 設(shè)備、儀器及用具6.4.1.1 設(shè)備微生物限度檢測室、陽性菌檢測室、生物安全柜、凈化工作臺、生化培養(yǎng)箱（30-350C）、電熱恒溫水浴鍋、烘箱、滅菌柜、紫外燈等。6.4.1.2 儀器及器皿顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養(yǎng)皿、量筒、試管及塞、吸管、注射器、注射針頭、載玻片、蓋玻片、薄膜過濾器等。6.4.1.3 用具大、小橡皮乳頭，潔凈

25、工作服、口罩、醫(yī)用手套、接種環(huán)、酒精燈、酒精棉球、滅菌剪刀、滅菌鑷子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、薄膜過濾膜等。6.4.2 試液、指示液 PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、PH6.8無菌磷酸鹽緩沖溶液等。6.4.3 培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧酸鹽瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基等。6.4.4 操作方法6.4.4.1 供試液制備和增菌培養(yǎng) 取10g或10ml供試品直接或處理后接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，3035培養(yǎng)1824小時。6.4.4.2 選擇和分離培養(yǎng) 取上述培養(yǎng)物0.1ml接種至10mlRV沙門增菌液

26、體培養(yǎng)基中， 3035培養(yǎng)2448小時。取少量RV沙門增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1848小時。沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上生長良好，菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。用接種針挑選疑似菌落于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)1848小時，或采用基他適宜方法進一步鑒定。 6.4.4.3 結(jié)果判斷 若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上有疑似菌落生長，且三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面為紅色、底層為黃色，或斜面黃色、底層黃色或黑色，應(yīng)進一步進行適宜的鑒定試驗，確證是否為沙門菌。如果平板上沒有菌落生長，或雖有菌落

27、生長但鑒定結(jié)果為陰性，或三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層未見黃色或黑色，判供試品未檢出沙門菌。 6.5 銅綠假單胞菌6.5.1 設(shè)備、儀器及用具6.5.1.1 設(shè)備微生物限度檢測室、陽性菌檢測室、生物安全柜、凈化工作臺、生化培養(yǎng)箱（30-350C）、電熱恒溫水浴鍋、烘箱、滅菌柜、紫外燈等。6.5.1.2 儀器及器皿顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養(yǎng)皿、量筒、試管及塞、吸管、注射器、注射針頭、載玻片、蓋玻片、薄膜過濾器等。6.5.1.3 用具大、小橡皮乳頭，潔凈工作服、口罩、醫(yī)用手套、接種環(huán)、酒精燈、酒精棉球、滅菌剪刀、滅菌鑷子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、

28、薄膜過濾膜等。6.5.2 試液、指示液PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、PH6.8無菌磷酸鹽緩沖溶液等。6.5.3 培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基等。 6.5.4 操作方法6.5.4.1 供試液制備和增菌培養(yǎng) 取供試品，照“6.1.4.2”制成1：10供試液。取相當于1g或1ml供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，在3035培養(yǎng)1824小時。6.5.4.2 選擇和分離培養(yǎng) 取上述培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上， 3035培養(yǎng)1872小時。取上述平板上生長的菌落進行氧化酶試驗，或采用其他適宜方法進一步鑒定。

29、6.5.4.3 氧化酶試驗 取潔凈濾紙片置于平皿內(nèi)，用無菌玻棒取上述平板上生長的菌落涂于濾紙片上，滴加新配制的 1%二鹽酸N，N二-甲基對苯二胺試液，在30秒內(nèi)若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗陽性，否則為陰性。6.5.4.4 結(jié)果判斷 若溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，且氧化酶試驗陽性，應(yīng)進一步進行適宜的鑒定試驗，確證是否為銅綠假單胞菌。如果平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，或氧化酶試驗陰性，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。6.6 金黃色葡萄球菌6.6.1 設(shè)備、儀器及用具6.6.1.1 設(shè)備微生物限度檢測室、陽性菌檢測室、生物安全柜、凈化工作臺、生化培

30、養(yǎng)箱（30-350C）、電熱恒溫水浴鍋、烘箱、滅菌柜、紫外燈等。6.6.1.2 儀器及器皿顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養(yǎng)皿、量筒、試管及塞、吸管、注射器、注射針頭、載玻片、蓋玻片、薄膜過濾器等。6.6.1.3 用具大、小橡皮乳頭，潔凈工作服、口罩、醫(yī)用手套、接種環(huán)、酒精燈、酒精棉球、滅菌剪刀、滅菌鑷子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、薄膜過濾膜等。6.6.2 試液、指示液PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、PH6.8無菌磷酸鹽緩沖溶液等。6.6.3 培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基等。6.6.4 操作方法6.6.4.1 供試液制備和增菌培養(yǎng) 取供試品，照“6.1.4.2”制成1：10供試液。取相當于1g或1ml供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻。在3035培養(yǎng)1824小時。6