白藜蘆醇對豚鼠心室肌細胞L(一)

1、白藜蘆醇對豚鼠心室肌細胞L(一)    作者：易方方，唐其柱，馮斯婷，王騰 【關(guān)鍵詞】 白藜蘆醇；全細胞膜片鉗；鈣電流Effects of resveratrol on Ltype calcium current in isolated ventricular myocytes of guinea pig【Abstract】 AIM: To investigate the effects of resveratrol on the Ltype calcium current (ICaL) in isolated ventricular myocytes

2、of guinea pig. METHODS: Single ventricular cell was obtained from healthy guinea pig heart using enzymatic dissociation methods. The wholecell patch clamp was used to record the ICaL following the administration of resveratrol at 1, 50, 100 mol/L. RESULTS: Resveratrol reduced the ICaL in a concentra

3、tiondependent manner, but it had no effect on IV shape of ICaL. Resveratrol markedly shifted the steadystate activation curve of ICaL to the right, and V1/2 value increased from (-18.97±4.08) mV in control to (-15.97±4.13) mV in the presence of resveratrol （n=7, P=0.02）, the value from (3.

4、64±0.56) to (3.82±0.60) (n=7，P=0.67). Inactivation curve of ICaL was not affected significantly. The time constant of reactivation of ICaL was reduced from (98.50±9.00) ms to (54.53±4.27) ms (n=6，P=0.000) by resveratrol. CONCLUSION: Resveratrol inhibited the Ltype calcium channel

5、, mainly acting on the activity and recovery processes.【Keywords】 resveratrol；wholecell patch clamp；calcium current【摘要】 目的：研究白藜蘆醇對正常豚鼠心室肌細胞L型鈣電流（ICaL）的影響. 方法：采用全細胞膜片鉗技術(shù),記錄不同濃度白藜蘆醇作用前后對ICaL的影響. 結(jié)果：白藜蘆醇呈濃度依賴性阻斷ICaL,但對激活電位、峰電位、反轉(zhuǎn)電位均沒有影響；白藜蘆醇使ICaL穩(wěn)態(tài)激活曲線右移，V1/2由對照的（-18.97±4.08） mV變?yōu)椋?15.97±4.13

6、） mV （n=7，P=0.02），由（3.64±0.56）變?yōu)椋?.82±0.60）（n=7，P=0.67）；對失活曲線無影響，不改變ICaL失活特性；白藜蘆醇使ICaL失活后再恢復(fù)時間常數(shù)縮短，從（98.50±9.00） ms變?yōu)椋?4.53±4.27） ms（n=6，P=0.000）. 結(jié)論：白藜蘆醇對ICaL有阻斷作用,主要作用于鈣通道激活和恢復(fù)過程.【關(guān)鍵詞】 白藜蘆醇；全細胞膜片鉗；鈣電流0引言白藜蘆醇化學(xué)名為3,5,4三羥基反二苯代乙烯(3,5,4 trihydroxyrans stilbene)，是一種主要存在于葡萄皮、花生中的多酚類植物

7、抗毒素. 現(xiàn)認為它是適量飲用葡萄酒有利于心血管健康的主要作用因子1. 大量研究2-3發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對心肌缺血再灌注損傷有保護作用；對血管有廣泛的舒張效應(yīng)4;能抗動脈粥樣硬化，防治冠心病5. 但其對心肌細胞離子通道的作用少見報道，我們采用膜片鉗技術(shù)研究白藜蘆醇對心室肌細胞ICaL的影響.1材料和方法1.1材料健康成年豚鼠31只（武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心），體質(zhì)量250350 g，雌雄不拘； I型膠原酶，蛋白酶E,HEPES（Gibco公司）； CSOH, CSCl, Na2ATP（Sigma公司）；白藜蘆醇（西安賽得高科生物股份有限公司）；其余均為國產(chǎn)分析純. 無鈣臺氏液 (mmol/L)：NaCl

8、 135，KCl 5.4，MgCl2 1，NaH2PO4 0.33，Glucose 20，HEPES 10，pH 7.38 (NaOH調(diào)節(jié));KB液(mmol/L)： glumatic acid 50，KOH 85，KCl 30，MgSO4 3，Taurine 20，Glucose 10，HEPES 10，EGTA 0.5，pH 7.2(KOH調(diào)節(jié))；電極外液組成(mmol/L)：NaCl 37，Choline Chloride 100，CaCl2 1.8，MgCl2 0.5， HEPES 10，Glucose 10，CSCl 4.6，pH 7.3(CSOH調(diào)節(jié))；電極內(nèi)液組成(mmol/L)

9、: CSCl 120， CaCl2 1.0， MgCl2 5， Na2ATP 5，EGTA 11， HEPES 10，Glucose 11，pH 7.4(CSOH調(diào)節(jié)). 白藜蘆醇在DMSO中配成1.5 mmol/L母液，每次實驗時,母液溶于電極外液中配成實驗所需終濃度進行灌流,DMSO終濃度低于1 mL/L.1.2方法1.2.1心室肌細胞的分離將豚鼠腹腔注射肝素500 U/kg，頭部擊昏,迅速開胸取出心臟置于1000 mL/L O2飽和的4生理鹽水中沖洗，剪開心包，連接于Langendorff心臟灌流裝置上逆行灌流，灌流壓維持在70 mm H2O，用無鈣臺氏液灌流35 min，沖出心臟內(nèi)殘留

10、血液，心臟完全停跳后，改用含0.33 mg/L 型膠原酶，0.1 mg/L蛋白酶E的低鈣液（Ca2+ 80 mmol/L）灌流35 min,至心臟膨大松弛流出液成絲后取下，除去心房，在含BSA 1 g/L的KB液中剪碎心室肌，37溫孵，稀釋，倒出上清液, 此為第一份細胞貯存液. 剩余的沉淀部分繼續(xù)用KB液溫孵，稀釋，倒出上清依次可以得到多份細胞存儲液. 灌流液始終給予1000 mL/L O2飽和,循環(huán)水浴使灌流液保溫在37左右.1.2.2全細胞記錄技術(shù)吸數(shù)滴細胞保存液加于1.5 mL灌流槽，置于倒置顯微鏡（Olympus IX70）載物臺上，待細胞靜置貼壁，細胞外液灌流清洗細胞，電極選用硬質(zhì)玻

11、璃(上海神經(jīng)生理所提供),經(jīng)微電極拉制(Narishige PB7)二次拉制而成,電極充以內(nèi)液后阻抗3.55 M. 選取橫紋清晰，表面無顆粒，無收縮的細胞，采用微電極操縱儀(Narishige MD320)移動電極，當(dāng)電極尖端與細胞表面形成高阻抗封接后（2 G）,補償電極與細胞膜之間的電容,進一步給負壓吸破細胞膜,經(jīng)電容電流和電極串聯(lián)補償即可行全細胞記錄. 所有實驗均在室溫下進行.1.2.3試驗分組共分為4個濃度組,分別為對照組（n=8）,1 mol/L（n=9）,50 mol/L（n=7）,100 mol/L（n=7），記錄藥物灌流前后ICaL ，50 mol/L組還需記錄通道激活，失活和失

12、活后恢復(fù)電流.統(tǒng)計學(xué)處理：數(shù)據(jù)分析采用pulse 8.31軟件對全細胞記錄進行圖形與數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，數(shù)據(jù)以x±s表示，origin 6.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，并進行曲線擬合. 不同濃度藥物作用前后間比較采用Oneway ANOVA檢驗及LSDt，50 mol/L白藜蘆醇作用后通道動力學(xué)改變采用t檢驗，P0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異.2結(jié)果2.1對ICaL濃度依賴性阻斷作用采用保持電位-40 mV,指令電壓-4060 mV,鉗制時間200 ms，階躍10 mV的刺激程序引出ICaL，并且記錄30 min內(nèi)“rundown”現(xiàn)象（n=7），得出在12 min內(nèi)衰減明顯，所有的電流記錄均在電流穩(wěn)

13、定后進行. 灌流給藥5 min后藥效穩(wěn)定. 結(jié)果顯示白藜蘆醇（1100 mol/L）對ICaL呈濃度依賴性阻斷作用，0,1,50,100 mol/L作用時ICaL峰值分別為（0.79±0.05），（0.55±0.05），（0.42±0.05）,（0.17±0.04 ）nA (F=159.104,P=0.000;多重比較后，任兩組間P=0.000，圖1）. 白藜蘆醇作用后洗脫，ICaL大部分恢復(fù)（圖2）.a：給藥前;b：1 mol/L白藜蘆醇; c：50 mol/L白藜蘆醇;d：100 mol/L白藜蘆醇.圖1不同濃度白藜蘆醇對ICaL的影響（略）a：給藥

14、前;b：50 mol/L白藜蘆醇;c：洗脫后.圖2白藜蘆醇作用及洗脫后對ICaL的影響（略）2.2對電流電壓曲線的影響從保持電位-40 V逐步去極化至+60 V,階躍為10 V,持續(xù)時間200 ms. 50 mol/L藜蘆醇作用后，對鈣電流的最大激活電位和反轉(zhuǎn)電位均無影響，但使最大峰值電流降低（56.20±2.50）（n=5，P0.000，圖3）.圖350 mol/L白藜蘆醇對ICaL的IV曲線的影響（略）2.3對穩(wěn)態(tài)激活動力學(xué)曲線的影響根據(jù)上述脈沖刺激得到的電流值,按Boltzmann方程進行擬合:G/Gmax=1/1+exp(VV1/2/). (G為電導(dǎo),V1/2為曲線中點的電壓

15、,為曲線的斜率). 給予50 mol/L白藜蘆醇前后，V1/2/分別為（-18.97±4.08），（15.97±4.13）V（n=7，P=0.02）, 分別為3.64±0.56，3.82±0.60（n=7，P=0.67）. 白藜蘆醇能使激活曲線明顯右移（圖4）.圖4白藜蘆醇對ICaL激活曲線的影響（略）2.4對穩(wěn)態(tài)失活動力學(xué)曲線的影響采用雙脈沖刺激法，保持電位為-60 V,開始逐步去極化至+30 V,階躍10 V,持續(xù)1 ；在每次條件脈沖后都緊跟一個固定的去極化至10 V,持續(xù)300 的脈沖,然后回到-60 . 將記錄到的ICaL值經(jīng)Boltzmann方

16、程擬合I/Imax=1/1+exp(V-V1/2/). 50 mol/L白藜蘆醇作用前后，V1/2/分別為（20.17±1.17），（20.81±0.75）V（n=8，P=0.20）, 分別為7.16±1.04，6.97±0.67（n=8，P=0.90）. 因而白藜蘆醇對ICaL穩(wěn)態(tài)失活曲線無影響（圖5）.圖5白藜蘆醇對ICaL失活曲線的影響（略）2.5對失活后恢復(fù)動力學(xué)曲線的作用采用雙脈沖刺激法. 保持電位為-60 ,給予去極化至10 的刺激,持續(xù)250 ,回到保持電位持續(xù)50 后,再給予同樣刺激,前后兩個脈沖的間隔時間逐漸增加,每次增加50 s,共9

17、次脈沖. 加藥前得到的曲線可以用單指數(shù)方程擬合. 給藥前后的時間常數(shù)（）為（98.50±9.00），（54.53±4.27）ms( n=6，P=0.000，圖6）.圖6白藜蘆醇對ICaL失活后恢復(fù)曲線的影響（略）3討論ICaL在心肌細胞電活動中起重要作用. 它是維持一個較長平臺期的主要內(nèi)向電流，為其他離子流的活動提供合適的電位條件. 鈣通道阻滯劑不僅可以減少細胞內(nèi)鈣離子濃度，減少鈣超載的發(fā)生，減少降解酶類的激活釋放而引起的的心肌缺血再灌注損傷；還可以縮短APD，減少興奮性折返引起的早后去極化，減少心律失常的發(fā)生.白藜蘆醇的研究最早始于“法國悖論”現(xiàn)象，即法國人喝大量葡萄酒，

18、血液中飽和脂肪酸幾乎是其他發(fā)達國家的四倍，但是罹患心臟病的危險確只是后者的三分之一6. 研究表明這種現(xiàn)象與葡萄酒中的一種稱為白藜蘆醇的物質(zhì)有著密切關(guān)系，它可以減少心肌缺血再灌注損傷、舒張血管、抗動脈粥樣硬化等. 白藜蘆醇作為鈣通道阻斷劑減少胞內(nèi)鈣超載的特點進一步揭示其發(fā)揮心肌保護作用的機制. Pakaki等7研究發(fā)現(xiàn)預(yù)先給予大鼠不同劑量的白藜蘆醇進行干預(yù)，可以不同程度的減少心肌缺血再灌注后室早室顫的發(fā)生率. 本試驗可以進一步解釋此研究結(jié)果，白藜蘆醇作為鈣通道阻斷劑可以減少興奮折返，減少心律失常的發(fā)生.本實驗不足之處是僅就正常心室肌細胞的鈣通道進行研究，對于病理狀態(tài)如缺血缺氧，以及其他通道如鈉，

19、鉀，氯通道及其各種亞型，和細胞膜上的各種離子泵的作用還有待進一步研究.【參考文獻】1 Wu JM, Wang ZR, Hsieh TC, et al. Mechanism of cardioprotection by resvertrol, a phenolic antioxidant present in red wineJ. Int J Mol Med, 2001, 8(1): 3-17.2 Hung LM, Chen JK, Huang SS, et al.Cardioprotective effect of resvertrol,a natural antioxidant derived from grapesJ. Cardiovasc Res, 2000, 47(3): 549-555.3 陳莉娜,臧偉進,唐玉海.白藜蘆醇心血管保護作用研究進展J. 生理科學(xué)進展,2003,34(3):272-274.4 ElMowafy AM. Resvertrol activates membranebround guanylyl cyclase in coronary arterial smooth muscle: A nov