分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告正文

1、圍繞Southern雜交的系列分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練報(bào)告Abstract：Bioengineering class 134 in Life Science College studied the molecular biology experiment under the theacher Junfeng Pans guidence. The whole experiment around the “southern hybridization of digoxin mark”as the center,including experiments with high standards(such

2、as amplication cDNA of RT-PCR and Southern hybridization) and fundamental experiments. Fundamental experiments include the plasmids DNA extraction,agarose gel electrophoresis,polymerase chain reaction,plant RNA extraction and electrophoresis,wheat genomes DNA extraction,enzyme digestion,electrophore

3、sis analysis,preparation and transferma-tion of cells. Most experiments went well,but the quality of extracted DNA and RNA was not very good.Additionally,the result of electrophoresis analysis of RT-PCRs product just showed primer,not target gene.After analysis,we think the reason of failing may be

4、material,it was freezed too long.Keywords: southern blot; molecular biology experiment; extraction of nucleic acid; PCR; electrophoresis1.前言：（略）2.實(shí)驗(yàn)：2.1 實(shí)驗(yàn)材料暗培養(yǎng)7天的小麥幼苗（黃化苗），含質(zhì)粒的大腸桿菌P382.2 試劑2.2.1質(zhì)粒DNA提取質(zhì)粒小提試劑盒（天根公司，中國產(chǎn)）LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶解于1000mL蒸餾水中，用NaOH調(diào)pH至7.0。高壓滅菌20分鐘。LB平板培養(yǎng)基：在每10

5、00mL LB液體培養(yǎng)基中中加入15g瓊脂，高壓滅菌20分鐘。溶液：50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/L Tris-Hcl(pH8.0),冰箱保存，RNA酶要提前加入溶液中；溶液：0.2mol/L NaOH,1%SDS（堿性的NaOH使蛋白質(zhì)變性，SDS結(jié)合變性的蛋白質(zhì)）；溶液：Ph4.8的醋酸鉀溶液（5mol/L乙酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml,水28.5ml）；TE緩沖液（pH8.0）：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTAl；無水乙醇和70%乙醇。2.2.2 質(zhì)粒DNA酶切及瓊脂糖電泳分析鑒定EcoR酶（Thermo,美國） DNAT

6、BE緩沖液（5×）：用時(shí)需稀釋10倍點(diǎn)樣緩沖液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚藍(lán)，40%甘油溴乙啶(EB)：10mg/ml溴乙啶 （注意：該試劑具致癌作用，用時(shí)要小心） 瓊脂糖1%2.2.3 質(zhì)粒載體和外源DNA的連接反應(yīng)目標(biāo)DNA片段（P38質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物）載體（pGEM-T Easy）2×ligation 緩沖液T4 DNA連接酶2.2.4感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化0.1mol/L CaCl2取20l PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖電泳分析。LB液體培養(yǎng)基LB固體培養(yǎng)基氨芐青霉素（100mg/mL）2.2.5地高辛標(biāo)記的Southern雜

7、交1.DIG Random Labeling Mix（高效）（博士德，中國）2.Anti-DIG-AP Conjugate3.BCIP/NBT Stock Solution 4.Blocking Reagent5.20×SSC：0.3M 檸檬酸鈉，3M NaCl6.2×SSC：0.03M 檸檬酸鈉，0.3M NaCl7.0.2M EDTA8.變性液：0.5N NaOH，1.5M NaCl9.中和度：0.5M Tris-HCl，pH7.4，3M NaCl10.Standard buffer：5×SSC，0.1%(w/v) N-Lauroylsarcosine, 0.

8、02%(w/v) SDS, 1% Blocking Reagent。11.Standard buffer+50% formamide12.Anti-DIG-AP堿性磷酸酶標(biāo)記抗地高辛單抗體13.BCIP/NBT儲(chǔ)備液：14.沖洗液：0.1M Tris-HCl，0.15M NaCl. pH=7.5.15.封閉液：1%Blocking Reagent/ 0.1M Tris-HCl，0.15M NaCl.16.顯色緩沖液：0.1mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH=9.5.17.TE緩沖液：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.02.2.6RNA分離與純化Trizol

9、Reagent（Trizol試劑盒）氯仿，異丙醇，70%乙醇，DEPC(含有RNA滅活酶)處理的ddH2O，溴乙錠（EB）10mg/ml，點(diǎn)樣緩沖液Loading buffer(10×)（0.25%溴酚藍(lán)，40%甘油）。2.2.7 RT-PCR擴(kuò)增目的基因cDNARNA模板，cDNA引物，反轉(zhuǎn)錄緩沖液，dNTP，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶（Thermo,美國），RNA抑制劑（RNasin），Taq酶及PCR緩沖液（10×），引物（P1、P2）。2.2.8小麥基因組DNA提取、酶切及電泳分析DNA抽提液（CT-AB）用時(shí)將下述三種溶液按1:1:0.4 (V/V)比例混勻，加入亞硫酸氫鈉

10、（3.8g/L），即為抽提液。 DNA extraction（500ml）：31.885g sorbitol(山梨醇)6.05g Tris pH8.2(一般不調(diào)) Nuclei lysis buffer（500ml）: 100ml 1M Tris pH7.5100ml 0.25M EDTA200ml 5M NaCl10g CTAB100ml ddH2O5OOml 5% sarkosyl (N-月桂酰肌氨基鈉鹽)氯仿：異戊醇（24：1） 70%乙醇 異丙醇 HindIII酶 EcoR酶2.3 實(shí)驗(yàn)器材2.3.1 質(zhì)粒DNA提取Eppendorf管，離心管，10,100.1000微量加樣器，臺(tái)式高

11、速離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5424 R)，搖床、高溫滅菌鍋。2.3.2 質(zhì)粒DNA酶切及瓊脂糖電泳分析鑒定電泳儀系統(tǒng)，紫外燈，恒溫水浴箱2.3.3 質(zhì)粒載體和外源DNA的連接反應(yīng)低溫離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5424 R)，恒溫移液器，恒溫水浴鍋2.3.4感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化 低溫離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5424 R)，平衡天平(UX620H,Uni Bloc)，無菌操作臺(tái)，微量移液器2.2.5地高辛標(biāo)記的Southern雜交臺(tái)式低溫離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5424 R)，恒溫水浴鍋，雜交管

12、，玻璃板，磚頭，大型皿，電泳系統(tǒng)，硝酸纖維素膜，分子雜交儀（1339，北京賓達(dá)英創(chuàng)科技有限公司）2.3.6 RNA分離與純化微量加樣器，離心管(1.5ml)，低溫離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5424 R)2.3.7 RT-PCR擴(kuò)增目的基因cDNAPCR擴(kuò)增（Applied biosystems by life technologies,ABI,美國），電泳儀，低溫離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5424 R)，恒溫水浴鍋2.3.8 小麥基因組DNA提取、酶切及電泳分析PCR擴(kuò)增（Applied biosystems by life technologi

13、es,ABI,美國）低溫離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5424 R)，恒溫水浴鍋，紫外分析儀，微量加樣器2.4 實(shí)驗(yàn)步驟（略）2.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22圖1 P38 質(zhì)粒電泳結(jié)果注：泳道2為質(zhì)粒提取結(jié)果，泳道22為Marker.80005000300020001000500750250100圖2 質(zhì)粒PCR電泳結(jié)果1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18750500注：泳道11為質(zhì)粒PCR產(chǎn)物，泳道15為Marker. 泳道16

14、為空白（被Marker污染）。圖3 質(zhì)粒P38和EcoR I 酶切產(chǎn)物對比電泳1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 4500300020001200800注：泳道1為Marker,泳道12為P38質(zhì)粒，泳道14為酶切產(chǎn)物。圖4 菌落PCR1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 152000500800120030004500注：菌落PCR結(jié)果條帶略小于500.圖5 植物RNA 提取結(jié)果注：圖中均為小麥RNA圖 6 小麥RT-PCR電泳結(jié)果4500300020001200800注：均無cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶圖 7 小麥基因組PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

15、5001200800200030004500注：條帶在500至800之間，擴(kuò)增成功。圖8 小麥基因組和EcoR I 酶切對比電泳結(jié)果1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24注：依次從左至右，泳道數(shù)奇數(shù)為酶切結(jié)果，偶數(shù)為g-DNA.圖 9 southern 雜交結(jié)果231注：泳道1 為P38 質(zhì)粒，泳道2為PCR產(chǎn)物，泳道3為酶切產(chǎn)物。2.6 分析討論 在感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果只出現(xiàn)了極少極少數(shù)的藍(lán)斑，可能存在一些假陽性的結(jié)果。原因可能是X-Gal和IPTG量比較少，又是直接混入培養(yǎng)基中的，大部分不能發(fā)揮作用

16、。X-Gal是-半乳糖苷酶(-galactosidase)的顯色底物，在-半乳糖苷酶的催化下會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物。IPTG是半乳糖苷酶的活性誘導(dǎo)物質(zhì)。如果將X-Gal和IPTG均勻涂抹于培養(yǎng)基表面，或許效果會(huì)明顯一些。圖1顯示，提取的質(zhì)粒電泳條帶結(jié)果表明其分子量大于2000，條帶較為清晰。圖2顯示，質(zhì)粒PCR產(chǎn)物分子量在500至750之間。圖3中，泳道6號(hào)和7號(hào)組切割不完全或有的沒有切開。正確的酶切產(chǎn)物應(yīng)該只有一條帶，且?guī)У奈恢煤唾|(zhì)粒條帶幾乎在同一直線上。圖4顯示，菌落PCR的條帶分子量在500至800之間。圖5（變性后又常溫復(fù)性后補(bǔ)照的）顯示，提取出來的RNA質(zhì)量不好，沒有明顯的18S和28S條帶

17、，呈彌散狀，降解嚴(yán)重，下圖（第一次高壓快速跑出的條帶）中的RNA 質(zhì)量要稍好一些。可能就是在變性又常溫復(fù)性的過程中RNA被降解。 注：第一次高壓快速跑出的RNA條帶 圖6顯示均無cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶，但圖7小麥基因組擴(kuò)增成功，說明不是PCR體系及程序的問題。往屆有RT-PCR成功的例子，應(yīng)該也不是反轉(zhuǎn)錄體系的問題。注：往屆成功的PT-PCR由于其他三個(gè)班的RT-PCR同樣沒有結(jié)果（下圖泳道2為三班同學(xué)的RT-PCR結(jié)果）。故失敗原因可能為材料的問題。可能在處理中，小麥苗中水通道蛋白的表達(dá)量過低，相關(guān)RNA過少，或材料儲(chǔ)存時(shí)間過長，相應(yīng)RNA降解。 當(dāng)然，反轉(zhuǎn)錄的失敗也可能是由于RNA在提出后加到反轉(zhuǎn)錄體系的過程中降解了，不過我們一共做了十管左右，上述情況又為概率事件，故全部降解的可能性比較小，基本可以排除這種原因。圖8中，植物基因組DNA降解明顯，且RNA污染嚴(yán)重，可能是RNA酶出了問題。對于酶切結(jié)果，因?yàn)槟z的分辨率不夠，故呈現(xiàn)出彌散狀條帶。圖9中，質(zhì)粒顯示出兩條條帶，實(shí)際上，質(zhì)粒中有多種大小的線性及環(huán)裝DNA分子，只是凝膠只分辨出兩條條帶。質(zhì)粒PCR產(chǎn)物呈彌散狀是由于引物為通用引物。同樣的，酶切結(jié)果應(yīng)當(dāng)為一條帶。后一組出現(xiàn)了兩條帶，原因可能是切割不完全或有的沒有切開。3.參考