EMS在作物育種應(yīng)用中的研究進(jìn)展

1、EMS在作物育種應(yīng)用中的研究進(jìn)展 甲基磺酸乙酯(簡(jiǎn)稱(chēng)EMS), 是一種改變DNA 結(jié)構(gòu)烷化劑, 對(duì)生物系統(tǒng)作用的重點(diǎn)主要是核酸, 對(duì)修復(fù)酶的鈍化也有一定的作用,它與DNA 中的磷酸嘌呤、嘧啶作用, 使之突變。 烷化劑甲基磺酸乙酯為植物最有效的化學(xué)誘變劑之一 , 自從1953年, KLMARK 首次報(bào)告了EMS 對(duì)突變誘導(dǎo)的有效性以來(lái),目前已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物誘變育種, 現(xiàn)已育成了2 250 個(gè)品種, 主要有水稻、小麥、大麥和大豆.二、水稻類(lèi)病斑突變體的初步研究 根據(jù)類(lèi)病斑出現(xiàn)的生長(zhǎng)階段,通常將類(lèi)病斑突變體分為全生育期型、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段起始型和生殖生長(zhǎng)階段起始型3種。四、水稻斑點(diǎn)葉變異研究進(jìn)展 可

2、遺傳的變異是水稻進(jìn)化的基礎(chǔ),通過(guò)變異水稻發(fā)生一系列肉眼可見(jiàn)或不可見(jiàn)的變化。水稻斑點(diǎn)葉( spotted leaf) 屬于肉眼可見(jiàn)的葉片形態(tài)變異,發(fā)生變異的葉片上產(chǎn)生色澤、形狀和大小不同的斑點(diǎn),在有些突變體中斑點(diǎn)還會(huì)出現(xiàn)在葉鞘、枝梗和谷殼。 這種斑點(diǎn)的發(fā)生是在沒(méi)有明顯逆境、機(jī)械和農(nóng)藥損傷或者病原菌侵染的條件下,由植物體自發(fā)形成的,大多數(shù)情況下與無(wú)毒病原菌侵染時(shí)產(chǎn)生的病斑相似。由于斑點(diǎn)的顏色多為褐色,類(lèi)似于水稻胡麻斑病和稻瘟病,許多學(xué)者又稱(chēng)之為類(lèi)病變或類(lèi)病斑(lesion mimic , lesion simulating disease) 。 之所以劃分為起始型和擴(kuò)散型兩類(lèi),是因?yàn)檎J(rèn)為植物中存在

3、激發(fā)和抑制程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death , PCD) 兩種途徑。很多時(shí)候斑點(diǎn)葉突變體又被稱(chēng)為類(lèi)病斑突變體(lesion mimic mutant) ,因?yàn)樗麄児餐奶卣魇前唿c(diǎn)部位的細(xì)胞壞死,這種壞死斑與植物過(guò)敏性反應(yīng)( hy per sensitive response , HR) 形成的病斑非常相似。 有些突變體的斑點(diǎn)受到溫度和光照等環(huán)境因子的影響,例如,水稻突變體s pl7 的斑點(diǎn)在高溫和太陽(yáng)光下表達(dá),而Oslsd1 在低溫和短日照條件下表達(dá)。這種現(xiàn)象在水稻和其他植物中還有許多報(bào)道。說(shuō)明有些斑點(diǎn)葉基因參與光溫調(diào)節(jié)的代謝途徑,可能與植物的光合作用以及耐逆境有關(guān)。

4、 除了產(chǎn)生斑點(diǎn)以外,許多突變體還伴隨其他農(nóng)藝性狀的改變,包括株高、育性、分蘗力和產(chǎn)量等。水稻突變體sl、cd r1 和s pl5 均為矮化植株，s pl3 和s pl4 部分不育,產(chǎn)量下降，spl19 葉片變窄、卷曲以及結(jié)實(shí)率降低。我們觀察到水稻斑點(diǎn)葉突變體HM42 除表現(xiàn)矮稈以外,還伴隨育性降低和分蘗力嚴(yán)重下降(未發(fā)表數(shù)據(jù)) 。此外,有些斑點(diǎn)葉突變是致死的, 突變體無(wú)法完成整個(gè)生命周期 ;還有些突變體是純合致死的,只能通過(guò)雜合體保存?？梢?jiàn)斑點(diǎn)葉基因作用廣泛,幾乎涉及植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老和死亡等所有生理生化過(guò)程。 并非所有的斑點(diǎn)葉突變體都能形成壞死斑(necrotic lesion) ,但其

5、中有一類(lèi)突變體能在無(wú)任何外界因子的作用下產(chǎn)生類(lèi)似病原菌侵染時(shí)的過(guò)敏性反應(yīng)( HR) ,局部形成壞死斑,即所謂的類(lèi)病斑突變體。與HR 相似,類(lèi)病斑處的細(xì)胞壞死,同屬程序性細(xì)胞死亡,而程序性細(xì)胞死亡( PCD) 在植物生長(zhǎng)發(fā)育、衰老和保持健康中起重要作用,因此,類(lèi)病斑突變體成為科學(xué)家對(duì)PCD機(jī)理研究和認(rèn)知的理想材料之一。 可穩(wěn)定遺傳的水稻斑點(diǎn)葉突變體均遵守孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。絕大多數(shù)突變體受單隱性基因控制,也有不少受單顯性基因控制的情況,個(gè)別突變體受到2 個(gè)隱性基因控制。有的突變體是母體遺傳的。 AP1M1 在原核與真核生物中高度保守,但到底與衰老有何關(guān)系卻鮮有報(bào)道HR 是研究得最多的一種程序性細(xì)胞死

6、亡,絕大多數(shù)斑點(diǎn)葉突變體也都有類(lèi)HR 特征,部分細(xì)胞死亡的知識(shí)就是來(lái)源于對(duì)這類(lèi)突變體的研究。但植物如何調(diào)控HR ,如何將細(xì)胞死亡限制于被病原菌侵染的部位,而不至于擴(kuò)散到周?chē)５募?xì)胞中,從而避免PCD 失去控制,這仍然是個(gè)謎。 可見(jiàn)斑點(diǎn)葉突變體的遺傳模式雖不復(fù)雜,但斑點(diǎn)形成的機(jī)制卻相當(dāng)復(fù)雜,不僅與植物防衛(wèi)反應(yīng)有關(guān),還與葉綠素代謝、脂肪酸代謝、耐逆境脅迫以及解毒作用等途徑有關(guān)。 確定相關(guān)的酶、蛋白和化合物在PCD 中的因果關(guān)系,是闡明PCD 的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些化合物/ 蛋白參與PCD 或PCD 的信號(hào)傳導(dǎo)。這些物質(zhì)包括酚類(lèi)、胼胝質(zhì)、活性氧中間產(chǎn)物(包括過(guò)氧化氫和自由氧基) 、PR

7、蛋白、植保素、水楊酸、茉莉酸、乙烯和一氧化氮等。有些物質(zhì)發(fā)生在HR的下游,例如, HR 可誘導(dǎo)水楊酸的積累,進(jìn)而誘發(fā)植物的系統(tǒng)獲得性抗性,相反,有些物質(zhì)發(fā)生在HR 的上游, 例如活性氧中間產(chǎn)物可能直接誘導(dǎo)HR 產(chǎn)生以及隨后的防衛(wèi)反應(yīng)。有些分子,例如一氧化氮,具有多重功能,不僅與PCD 有關(guān) ,還參與植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。因此,除了發(fā)掘更多突變體和克隆分離相應(yīng)的基因外,鑒定這些分子的靶標(biāo)物質(zhì)還有許多路要走,但這也是揭開(kāi)植物病斑發(fā)生和PCD 機(jī)理的關(guān)鍵。五、谷子類(lèi)病斑突變體09-1115的發(fā)現(xiàn)及遺傳分析 從2005年開(kāi)始構(gòu)建谷子功能基因研究突變體庫(kù), 通過(guò)多年積累, 目前已經(jīng)擁有15個(gè)穩(wěn)定的形態(tài)學(xué)突變

8、材料, 其中包括類(lèi)病斑突變體09-1115。對(duì)谷子類(lèi)病斑突變體091115進(jìn)行遺傳分析, 旨為實(shí)現(xiàn)突變基因的分子標(biāo)記定位, 以期為該基因的克隆及作用機(jī)理等方面的研究奠定基礎(chǔ)。 類(lèi)病變的發(fā)生與植物細(xì)胞程序性死亡、抗病生理過(guò)程、光信號(hào)等相關(guān)因子轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及活性氧與自由基的生理生化活動(dòng)等緊密相關(guān), 是研究植物超敏反應(yīng)激活機(jī)制的有利工具, 對(duì)揭示植物抗病反應(yīng)機(jī)理、了解植物細(xì)胞程序性死亡等具有十分重要的意義。 上述斑點(diǎn)的共同特征是在無(wú)病原菌、無(wú)機(jī)械損傷、無(wú)農(nóng)藥殘傷和無(wú)逆境的條件下產(chǎn)生的。有些斑點(diǎn)具有相對(duì)穩(wěn)定的分布位置和大小, 被稱(chēng)之為起始型( init iation) 斑點(diǎn) 。而另外一些斑點(diǎn)在形成后會(huì)很

9、快擴(kuò)散到葉片的其他部位, 包括葉鞘和莖稈,故稱(chēng)之為擴(kuò)散型( propagation) 或反饋型( feed back斑點(diǎn)。之所以劃分為起始型和擴(kuò)散性?xún)深?lèi), 是因?yàn)檎J(rèn)為植物中存在激發(fā)和抑制程序性細(xì)胞死亡2種途徑。這種斑點(diǎn)葉突變體又被稱(chēng)為類(lèi)病斑突變體( lesion mmiicmutant) 因?yàn)樗麄児餐奶卣魇前唿c(diǎn)部位的細(xì)胞壞死,這種壞死斑葉與植物過(guò)敏性反應(yīng)形成的病斑非常相似。 根據(jù)突變性狀受環(huán)境影響的敏感程度, 類(lèi)病變又可分為環(huán)境鈍感型和環(huán)境敏感型，根據(jù)突變性狀的發(fā)育進(jìn)程還可分為全生育期型、營(yíng)養(yǎng)階段起始型和生殖生長(zhǎng)階段起始型。六、水稻類(lèi)病變壞死突變體的形態(tài)觀察及基因初步分析 自70年代早期發(fā)現(xiàn)

10、水稻第一個(gè)類(lèi)病變壞死突變體sl（sekiguchi lesion）以來(lái)，至今已發(fā)現(xiàn)了近百種類(lèi)似的突變體。這些突變體雖然表現(xiàn)特征不盡相同，但類(lèi)似的表型使人們推測(cè)它們之間有一些共同的機(jī)制，尤其是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)類(lèi)病變壞死突變體的表現(xiàn)與抗病和細(xì)胞程序化死亡有關(guān)，但植物死亡的機(jī)理仍不清楚。因此，發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞死亡突變體，定位和克隆與植物細(xì)胞死亡有關(guān)的基因是闡明植物細(xì)胞死亡機(jī)理的重要途徑。遺傳作圖群體的構(gòu)建 在本研究中發(fā)現(xiàn)的水稻類(lèi)病變壞死突變體lmm3， 與以往在水稻中發(fā)現(xiàn)的sl、spl 突變體的表型有很大差異。七、水稻類(lèi)病變突變體lmm1 的誘發(fā)與初步分析 目前在水稻中也發(fā)現(xiàn)和誘發(fā)產(chǎn)生了該類(lèi)突變體, 包括自發(fā)

11、形成和人工誘變的壞死( Sekiguchi lethal,Sl ) 突變體、lmi 突變體和lrd 突變體等。利用不同濃度化學(xué)誘變劑EMS 處理高抗稻瘟病水稻品種Katy 干種子, 獲得一個(gè)水稻類(lèi)病變壞死突變體lmm1,八、植物類(lèi)病斑突變體的信號(hào)途徑與抗病性研究進(jìn)展 類(lèi)病斑一直作為一種抗性初始選擇策略加以利用,這些發(fā)生機(jī)理的深入闡述,可望為定向選擇出具有育種直接利用的抗病材料提供理論指導(dǎo)。 植物為抵御病原菌的侵染,在進(jìn)化過(guò)程中形成了一套復(fù)雜的防御機(jī)制,其中最為有效的是直接抗性反應(yīng)即過(guò)敏反應(yīng)(Hypersensitive response , HR) ,當(dāng)植物受到病原菌侵染時(shí),被侵染的細(xì)胞以及周

12、圍的細(xì)胞快速凋亡,形成一定區(qū)域的壞死斑,從而抑制了病原菌的增長(zhǎng)。目前,許多研究者在控制過(guò)敏性細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因檢測(cè)方面已開(kāi)展了大量的工作,主要集中在不受控的細(xì)胞凋亡突變體上,這些突變常表現(xiàn)出自發(fā)性的細(xì)胞凋亡(Programmed cell death , PCD) ,因其表現(xiàn)型類(lèi)似于病原菌誘導(dǎo),故被稱(chēng)作類(lèi)病斑突變(Lesion mimicmutation , LMM) 。LMM 最早在玉米中發(fā)現(xiàn),隨后相繼報(bào)道于水稻、大麥和擬南芥。觀察發(fā)現(xiàn),這些LMM相關(guān)的表現(xiàn)型可能涉及到一些正常的病原菌感染激活的反應(yīng)過(guò)程。研究這些LMM 的特征及其控制基因,對(duì)了解植物細(xì)胞程序性死亡的整個(gè)信號(hào)傳遞途徑和抗病機(jī)理

13、具有重要意義,同時(shí)對(duì)選育相關(guān)抗病性狀材料以及后續(xù)的改造也有積極的推動(dòng)作用。本課題組通過(guò)誘變水稻品種9311 獲得了一系列LMM,在水稻中,類(lèi)病斑突變體cdr (cell death andresistance) 表明蛋白磷酸化過(guò)程的改變導(dǎo)致了NADPH氧化酶活性的激活。 事實(shí)上,許多植物L(fēng)MM是在篩選與相關(guān)抗病性反應(yīng)中獲得的,對(duì)LMM多方面的研究有助于進(jìn)一步了解細(xì)胞程序性死亡和防衛(wèi)反應(yīng)的途徑。由于LMM與抗病性相關(guān),它們還可作為一個(gè)直觀的選擇性標(biāo)記輔助育種。國(guó)內(nèi)包括浙江大學(xué)在內(nèi)的研究機(jī)構(gòu)也在這方面做了一些有益的嘗試。隨著這些發(fā)生機(jī)理不斷被深入闡述,有望定向選擇出具有育種直接利用的抗病材料。 在

14、篩選具有直接實(shí)用價(jià)值的抗病材料的研究中,我們注重新種質(zhì)的系統(tǒng)抗性,即著眼于通過(guò)基因網(wǎng)絡(luò)的有效調(diào)控,實(shí)現(xiàn)對(duì)不同類(lèi)型的病害及不同生物生理小種均表現(xiàn)抗性,類(lèi)病斑一直作為一種初始的選擇策略加以利用。與此同時(shí),為便于系統(tǒng)抗病性的快速育種利用,我們重點(diǎn)研究抗病性和優(yōu)良農(nóng)藝性狀有機(jī)結(jié)合新材料的抗性機(jī)制。九、植物類(lèi)病變突變體的誘發(fā)與突變機(jī)制 植物類(lèi)病變突變體(lesion mimic mutant, LMM)是在無(wú)明顯逆境或病原物侵染時(shí)，植物自發(fā)地形成類(lèi)似病斑的一類(lèi)突變體。它涉及到細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)，往往能提高植物的抗病能力。因此，它對(duì)于揭示植物抗病反應(yīng)機(jī)制

15、，增加植物的廣譜抗性具有重要意義 植物和病原菌之間的作用機(jī)制一直是植物病理學(xué)研究的重點(diǎn)與熱點(diǎn)課題之一。植物對(duì)病原物主要有以下兩層防御體系：第一層是植物利用本身固有的基質(zhì)或介質(zhì)來(lái)抵制外界病原物的侵襲，而第二層防御體系是植物在受到病原物侵染后誘導(dǎo)產(chǎn)生的。人們又將該防衛(wèi)體系分為局部和系統(tǒng)的抗病反應(yīng)兩種。前者主要是指過(guò)敏反應(yīng)。為了探明植物過(guò)敏性反應(yīng)的作用機(jī)制，學(xué)者們利用各種物理、化學(xué)和生物的方法誘發(fā)產(chǎn)生一系列細(xì)胞程序性死亡突變體。在這些突變體中，有一類(lèi)表型像感病癥狀，但無(wú)病原菌孢子，人們稱(chēng)之為類(lèi)病變突變體(lesion mimic mutant)。到目前為止，人們已在模式植物擬南芥和重要糧食作物玉米、

16、大麥和水稻中獲得許多此類(lèi)突變體，并開(kāi)展了一系列研究，包括類(lèi)病變壞死表型的形成機(jī)制、突變基因的分子定位與克隆及其結(jié)構(gòu)功能分析，并已取得顯著進(jìn)展。1 植物類(lèi)病變壞死突變體的誘發(fā)與表型特點(diǎn) 除玉米與擬南芥外，目前在水稻中也發(fā)現(xiàn)和誘發(fā)產(chǎn)生了該類(lèi)突變體，包括自發(fā)形成和人工誘變的壞死(sekiguchi lethal,Sl)突變體、Cheng等和王建軍等利用60Cog射線誘發(fā)產(chǎn)生的lmi突變體和lrd突變體等3 類(lèi)病變壞死表型的形成機(jī)制 眾所周知，任何生命現(xiàn)象或生理活動(dòng)都不是由單單某一個(gè)因子決定的，植物類(lèi)病變壞死突變表型的產(chǎn)生也不例外，它是由植物自身與外界環(huán)境中的眾多因素所共同決定的。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)上述

17、各種植物類(lèi)病變壞死突變表型的產(chǎn)生機(jī)制進(jìn)行了廣泛而深入的研究，結(jié)果表明植物各種類(lèi)病變壞死突變表型的起因存在以下幾個(gè)方面：(1) 植物類(lèi)病變壞死的產(chǎn)生可能源自抗病基因的改變或過(guò)量表達(dá)從而不當(dāng)?shù)貑?dòng)HR(包括早期步驟中的功能錯(cuò)誤、信號(hào)受體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)問(wèn)題等) 導(dǎo)致難以控制的細(xì)胞死亡。Hu 等發(fā)現(xiàn)玉米抗銹病基因rp1發(fā)生突變可引發(fā)玉米葉片類(lèi)病變壞死病斑的產(chǎn)生。Tang等發(fā)現(xiàn)番茄抗病基因Pto的過(guò)量表達(dá)可誘導(dǎo)類(lèi)病變壞死表型的發(fā)生；(2) 植物類(lèi)病變壞死突變屬于細(xì)胞程序性死亡的特殊類(lèi)型，而后者在生物界非常普遍，它是生物自身發(fā)育與適應(yīng)外界不良環(huán)境所具有的本能反應(yīng)。因此任何干擾或影響正常PCD 發(fā)生的因素都有可

18、能引發(fā)植物類(lèi)病變突變壞死表型的發(fā)生，即植物類(lèi)病變壞死突變與植物PCD失控有關(guān)。限于篇幅，這里不展開(kāi)論述；正常代謝途徑發(fā)生紊亂也會(huì)引起植物的類(lèi)病變壞死突變。H u 等對(duì)玉米中的Les22 基因進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明該基因編碼尿卟啉脫羧酶(UROD)合成血紅素或葉綠素過(guò)程中的卟啉代謝途徑的關(guān)鍵酶。一旦它發(fā)生突變，將使UROD 活性顯著下降，從而使其反應(yīng)底物尿卟啉原III大大積累。該底物在光照條件下能使分子氧轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚匝?，由此引發(fā)玉米葉片中類(lèi)病變壞死表型。隨后又出現(xiàn)許多類(lèi)似的研究報(bào)道。中科院遺傳與發(fā)育研究所李家洋研究小組對(duì)擬南芥m o d 突變體進(jìn)行了深入地研究，發(fā)現(xiàn)MOD 基因編碼的是烯?；；d

19、體蛋白還原酶脂肪酸生物合成的關(guān)鍵酶。在突變體中該基因所編碼的產(chǎn)物發(fā)生了一個(gè)氨基酸殘基的差異，使烯酰基酰基載體蛋白還原酶的活性大大降低，脂肪酸生物合成受阻，從而減少了植物內(nèi)的總脂含量，進(jìn)而影響擬南芥的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致類(lèi)病變壞死表型的出現(xiàn)。Ueno 等研究發(fā)現(xiàn)，色氨酸脫羧酶和單胺氧化酶活性的提高能引發(fā)水稻Sekiguchi 損傷的形成；(4) 活性氧與自由基在壞死形成過(guò)程中可能扮演了重要角色5153，如上述已提到的玉米類(lèi)突變體les22中的葉片壞死就是由活性氧直接誘發(fā)產(chǎn)生的42。Overmyer等26在研究擬南芥rcd 突變體時(shí)發(fā)現(xiàn)，臭氧和過(guò)氧化物是引發(fā)類(lèi)病變壞死的直接原因；(5) 水楊酸(SA)、

20、茉莉酸(JA)和乙烯等激素與其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子在植物類(lèi)病變壞死表型形成過(guò)程中可能也起一定作用 (6) 外源轉(zhuǎn)基因的過(guò)量表達(dá)也會(huì)引發(fā)植物類(lèi)病變壞死表型的發(fā)生。如霍亂毒素和細(xì)菌視蛋白基因的過(guò)量表達(dá)可誘發(fā)類(lèi)病變壞死病斑的產(chǎn)生。此外，（7）外界環(huán)境，如光照、溫度與濕度條件也可誘發(fā)植物類(lèi)病變壞死表型的形成，如Arase 等和Cheng 等誘發(fā)獲得的水稻類(lèi)病變突變體的細(xì)胞壞死都是受光誘導(dǎo)的，而Jambunathan等獲得的擬南芥cpn1突變體則受環(huán)境濕度條件誘導(dǎo)。 上述引發(fā)植物類(lèi)病變壞死表型的眾多起因不是單方面起作用的，而往往是多種因素綜合作用的結(jié)果。更有趣的是，人們研究發(fā)現(xiàn)不少植物類(lèi)病變突變體比原親本具有

21、更強(qiáng)的抗病能力因此植物類(lèi)病變壞死突變體可望在植物廣譜抗性改良上發(fā)揮作用10、EMS 誘變六倍體小麥偃展4110 的形態(tài)突變體鑒定與分析【目的】構(gòu)建小麥EMS 突變體庫(kù)，為小麥功能基因組學(xué)研究準(zhǔn)備基礎(chǔ)材料。【方法】利用化學(xué)誘變劑甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，EMS）誘變處理小麥品種偃展4110 種子，將獲得的M2 代材料進(jìn)行生物學(xué)性狀與農(nóng)藝性狀鑒定，部分M3 材料播種家系進(jìn)行驗(yàn)證?！窘Y(jié)果】對(duì)M2代全生育期田間表型進(jìn)行觀察鑒定，突變?nèi)后w的表型變異率約為6.6%；獲得了幼苗、葉、莖、穗及成熟期等生物學(xué)特性與主要農(nóng)藝性狀的變異體和突變體，變異類(lèi)型豐富，特別是發(fā)現(xiàn)了自然突

22、變中少見(jiàn)的變異類(lèi)型，如株高在10-15 cm 左右的特矮變異類(lèi)型?！窘Y(jié)論】本研究所構(gòu)建的兩個(gè)偃展4110 EMS 突變?nèi)后w較為理想，可望有效地被用于小麥功能基因組研究和小麥遺傳改良中?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】構(gòu)建飽和突變體庫(kù)是進(jìn)行功能基因組研究的重要途徑，擬南芥、水稻等模式植物的功能基因組研究均已證明它在闡明基因功能方面具有重要作用。 Ray 等利用構(gòu)建的水稻突變體庫(kù)篩選到一株易感細(xì)菌病害的突變體，并將它應(yīng)用到水稻抗病研究中?；瘜W(xué)誘變是構(gòu)建突變體庫(kù)的重要方法之一。EMS 誘變不需進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，容易形成點(diǎn)突變，而又不容易對(duì)染色體造成畸變，因而被廣泛地利用構(gòu)建突變體庫(kù)。目前，已經(jīng)在擬南芥、玉米、番茄、大麥

23、等植物中利用EMS 誘變技術(shù)構(gòu)建了突變體庫(kù)，并在功能基因組學(xué)研究中發(fā)揮了重要作用。【本研究切入點(diǎn)】雖然在六倍體小麥中已經(jīng)構(gòu)建了一個(gè)EMS 突變體庫(kù)，但目前構(gòu)建的小麥突變體庫(kù)還遠(yuǎn)沒(méi)有達(dá)到飽和狀態(tài)，還需要構(gòu)建新的突變體庫(kù)來(lái)補(bǔ)充小麥功能基因組學(xué)研究材料；另一方面，目前國(guó)外所選用構(gòu)建小麥突變體庫(kù)的材料不適合中國(guó)的小麥生態(tài)環(huán)境，對(duì)中國(guó)小麥功能基因組學(xué)研究是一個(gè)障礙。特別需要提出的是，突變體庫(kù)主要用于重要功能基因的克隆，而重要的功能基因具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因此要獲得有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基因，必須構(gòu)建自己的突變體庫(kù)，利用這些材料搶先克隆與重要農(nóng)藝性狀相關(guān)的基因?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】目前小麥突變體庫(kù)構(gòu)建很少，且不

24、飽和。本研究的目的就是構(gòu)建適合中國(guó)小麥生態(tài)環(huán)境的突變體庫(kù)，為中國(guó)小麥功能基因組研究準(zhǔn)備基礎(chǔ)材料。筆者對(duì)分蘗性狀進(jìn)行了M3 驗(yàn)證，多蘗和單蘗變異M3 仍然分離，而少蘗獲得純合M3 株系。生育期突變體：發(fā)現(xiàn)101 株晚熟突變株和5 株晚熟突變株系，突變頻率為1.22%。表型性狀是由一系列的基因控制的，這些基因中的一個(gè)基因發(fā)生突變，其性狀都可能發(fā)生變化；而且，突變又是隨機(jī)發(fā)生的，基因組中的各不同基因具有相同的突變頻率。因此，分析基因組中不同性狀的突變頻率，可以在一定程度上預(yù)測(cè)控制該性狀的基因數(shù)量的多少。筆者對(duì)10 個(gè)農(nóng)藝性狀突變頻率進(jìn)行了分析（圖4），發(fā)現(xiàn)育性突變、生育期突變、株高突變所占比例較高，

25、推測(cè)與這些性狀相關(guān)的基因較多。這些EMS突變體可以用于以下三方面的研究。3.1 可用于已知序列基因的等位變異檢測(cè)3.2 用于基因的圖位克隆 假病斑突變體在小麥中未見(jiàn)報(bào)道，通過(guò)小麥偃展4110 EMS 突變體庫(kù)的構(gòu)建，已獲得M3 代穩(wěn)定的葉片假病斑大小不同的突變體，并已配制了不同的雜交組合，這為將來(lái)研究小麥的假病斑遺傳機(jī)制奠定了很好的基礎(chǔ)。水稻中報(bào)道的假病斑基因有7 個(gè)，spl1-spl7，其中spl7 已經(jīng)被圖位克隆，假病斑性狀的產(chǎn)生是由一個(gè)堿基突變所致27。本研究發(fā)現(xiàn)的突變體為研究比較兩種作物的假病斑基因創(chuàng)造了材料水稻類(lèi)病斑的報(bào)道、研究狀況3.3 優(yōu)異突變體在育種上的利用 總體來(lái)說(shuō)，EMS

26、突變產(chǎn)生的農(nóng)藝性狀不良突變較多，而優(yōu)良突變較少。但本試驗(yàn)也的確獲得了一些具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的突變體，如上述的大穗、大粒、矮稈、抗病、抗逆等突變體。特別要提出的是，這些優(yōu)異種質(zhì)資源源于人工誘變，控制這些優(yōu)良性狀的基因或等位基因與來(lái)自自然變異的基因或等位基因通常是不相同的，因此是一種新的優(yōu)異基因源。11、EMS 誘變玉米突變體苗期生理生化特性研究 EMS(甲基磺酸乙酯)化學(xué)誘變技術(shù)是創(chuàng)造玉米新種質(zhì)、改良農(nóng)藝性狀的常用方法,許多科學(xué)家認(rèn)為EMS 是當(dāng)今應(yīng)用效果最好的誘變劑之一。12、TILL ING在水稻育種中的應(yīng)用前景 育種過(guò)程是對(duì)控制農(nóng)藝性狀的有利等位基因的選擇過(guò)程,例如水稻矮桿基因sdO1的應(yīng)用

27、使水稻產(chǎn)量大幅度提高,帶來(lái)了水稻的“綠色革命”。 TILL ING(Targeting Induced LocalLesions in Genomes)是功能基因組研究中應(yīng)用的一種反向遺傳學(xué)技術(shù)。它能高通量、低成本地在EMS誘變?nèi)后w中鑒定出發(fā)生在特定基因上的點(diǎn)突變。在其基礎(chǔ)上發(fā)展出的EcoTILL ING技術(shù)可發(fā)現(xiàn)種質(zhì)資源中的SNP位點(diǎn)及小插入或缺失多態(tài)性位點(diǎn)。水稻是非常重要的糧食作物, 也是已經(jīng)完成了全基因組序列測(cè)定,有豐富的生物信息學(xué)資源可以利用的基因組研究模式植物。 作物品種改良關(guān)鍵是利用一些控制重要農(nóng)藝性狀的有利等位基因,也就是要鑒定含有利等位基因的種質(zhì)資源。要有效地利用這些資源目前的

28、主要方法是進(jìn)行基因定位及基因克隆,用分子標(biāo)記輔助育種的方法改良現(xiàn)有品系特定的農(nóng)藝性狀。如果現(xiàn)有的種質(zhì)資源中沒(méi)有育種價(jià)值非常顯著的等位基因則可以考慮進(jìn)一步擴(kuò)大種質(zhì)資源篩選的范圍,或者利用EMS誘變結(jié)合TILL ING技術(shù)篩選到有育種價(jià)值的等位基因。EMS誘變?cè)谒居N中的應(yīng)用 在育種過(guò)程中經(jīng)常會(huì)遇到種質(zhì)資源匱乏的問(wèn)題。對(duì)這個(gè)問(wèn)題的解決一方面是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)為作物帶來(lái)新的有利性狀。轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成功地應(yīng)用到作物的遺傳改良中,但由于能夠改良的性狀有限;另外公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因作物還持抵制態(tài)度,所以轉(zhuǎn)基因作物的商品化生產(chǎn)受到了限制。另外一個(gè)方面是利用野生近緣種中的有利等位基因。但由于親緣關(guān)系較遠(yuǎn),利用野生近緣種

29、中的有利基因需要通過(guò)大量的回交導(dǎo)入到栽培種中,還需要對(duì)導(dǎo)入的基因進(jìn)行進(jìn)一步鑒定,利用的過(guò)程比較復(fù)雜。除此之外還可以利用作物本身的變異產(chǎn)生新的有利等位基因, EMS誘變就是其中一種非常重要的方法。 EMS誘變育種是一種已經(jīng)在動(dòng)植物育種中成功應(yīng)用的技術(shù)。TILL ING技術(shù)的出現(xiàn)為這種技術(shù)的應(yīng)用注入了新的活力。通過(guò)對(duì)擬南芥約1900個(gè)EMS突變體的192 個(gè)基因上發(fā)生的點(diǎn)突變分析表明: EMS誘變產(chǎn)生的點(diǎn)突變?cè)诨蚪M中是隨機(jī)分布的;在擬南芥中,平均每kb的掃描片段能在3000個(gè)體的突變?nèi)后w中鑒10 個(gè)突變基因; 99%的突變是EMS誘變產(chǎn)生。所以,用EMS誘變的方法可以產(chǎn)生一個(gè)基因的一系列突變的等

30、位基因。這些等位基因中可能存在有重要育種利用價(jià)值的等位基因。Slade將TILL ING技術(shù)用于小麥直鏈淀粉含量的改良,在800 個(gè)個(gè)體組成的EMS誘變?nèi)后w中鑒定了246個(gè)W axy基因的等位基因,篩選到了3個(gè)W axy 基因位點(diǎn)均為功能失活突變的株系,為低直鏈淀粉含量小麥的培育提供了寶貴的材料。這是TILL ING技術(shù)在育種中應(yīng)用的一個(gè)比較成功的例子。除了能篩選到有育種價(jià)值的等位基因外,利用該方法的另一個(gè)好處是,具有優(yōu)良等位基因的材料和原材料的基本遺傳背景相同。即使發(fā)生了背景突變也可以通過(guò)一次雜交回到原來(lái)的遺傳背景。這樣可以最大限度地保持原材料的優(yōu)良性狀。水稻中已經(jīng)用秈稻品種IR64 建立了

31、EMS突變?nèi)后w。對(duì)2000 個(gè)個(gè)體的10 個(gè)基因進(jìn)行TILL ING分析,鑒定了發(fā)生在兩個(gè)基因上的突變。表明該技術(shù)可以在水稻中成功地應(yīng)用。另外,分析發(fā)現(xiàn)水稻中突變密度為0. 5 個(gè)突變體每Mb。這和擬南芥中突變密度為3. 3個(gè)突變體每Mb相比,后者是前者6. 6倍。提高了EMS的使用劑量后突變的密度增加了1倍。但仍比擬南芥中的突變密度低。EMS濃度的提高使M1代致死或者不育,這為突變?nèi)后w的構(gòu)建帶來(lái)困難。所以,水稻中EMS誘變的應(yīng)用也有其特殊性。需要在今后的研究中進(jìn)一步摸索。 我國(guó)有非常豐富的水稻種質(zhì)資源,水稻的育種水平也處于世界的前列,為了保持在該領(lǐng)域的持續(xù)領(lǐng)先地位,應(yīng)當(dāng)利用包括TILL IN

32、G在內(nèi)的先進(jìn)技術(shù)手段對(duì)水稻種質(zhì)資源進(jìn)行系統(tǒng)的研究,發(fā)現(xiàn)或創(chuàng)造更多的育種有利等位基因,以便更好地為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)服務(wù)。14、化學(xué)誘變及其在農(nóng)作物育種上應(yīng)用 化學(xué)誘變具有成本低、使用方便、誘變作用專(zhuān)一性強(qiáng)等特點(diǎn),是一種迅速發(fā)展的育種途徑。農(nóng)作物化學(xué)誘變育種是人工利用化學(xué)誘變劑誘發(fā)作物發(fā)生突變,再通過(guò)多世代對(duì)突變體進(jìn)行選擇和鑒定,直接或間接地培育成生產(chǎn)上能利用的農(nóng)作物品種。2常用化學(xué)誘變劑的誘變機(jī)制及誘變效應(yīng)化學(xué)誘變劑種類(lèi)很多,然而在栽培作物中只有少數(shù)化學(xué)物質(zhì)具有誘變效果。常用的化學(xué)誘變劑有烷化劑、堿基類(lèi)似物、抗生素、疊氮化物、亞硝酸、羥胺和吖啶等。按其誘變機(jī)制則可分為3 類(lèi): (1) 堿基類(lèi)似物誘變劑,如52溴尿嘧啶(52BU) 、22氨基嘌呤(AP) ; (2) 直接誘DNA結(jié)構(gòu)的誘變劑,如烷化劑、亞硝酸; (3) 誘發(fā)移碼突變的誘變劑,如吖啶類(lèi)、抗生素。而在農(nóng)作物育種中應(yīng)用較廣泛的是甲基磺酸乙酯(EMS) 、疊氮化鈉(NaN3 ) 、平陽(yáng)霉素(PYM) ?，F(xiàn)將這3 種誘變劑的特點(diǎn)介紹如下。211 甲基磺酸乙酯( EMS) EMS 屬于烷化劑的一種。烷化劑通常帶有1