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文檔簡介
1、精品文檔實驗基本步驟提取細(xì)胞蛋白BCA 定量制備蛋白膠(SDS-PAGE 交)蛋白樣品變性電泳轉(zhuǎn)膜封閉一抗TBST 洗滌二抗TBST 洗滌顯影結(jié)果分析1歡迎下載精品文檔試劑配制1.PBS 磷酸鹽緩沖溶液 1L磷酸二氫鉀0.24g磷酸氫二鈉1.44g氯化鈉8g氯化鉀0.2g加入 500ml 純水,調(diào) PH=7.2定容至 1L,高壓蒸汽滅菌2. PBST( PBS+0.05%吐溫 -20)500mlPBS+0.25ml 吐溫-203. 電轉(zhuǎn)液 500mlTris 1.5g甘氨酸 7.2g400ml 水溶解加入 100ml 甲醇,置于 4 C 冰箱預(yù)冷4. 電泳液(1X)10 x 稀釋,50ml10
2、 x 電泳液+450ml 純水5. TBS6. TBST (TBS+0.05%吐溫-20 )50mlTBS+450ml 純水 +0.25ml 吐溫-207. 封閉液TBST1X+5 奶粉40ml 封閉液=40mlTBST+2g 奶粉,40 C 預(yù)熱2歡迎下載精品文檔WB 實驗、蛋白樣品制備準(zhǔn)備:一管細(xì)胞,PBS( 4C 預(yù)冷),PMSF( 100mM,移液槍(1000ul , 10ul ), 1.5mlEP 管 2 個,高速冷凍離心機 4 C 預(yù)冷1. 于-20 C 冰箱中取出一管細(xì)胞樣品,吸去培養(yǎng)液2. 加入 1ml 4 C 預(yù)冷的 PBS( 0.01M pH7.27.3 )。用移液槍輕輕吹
3、成懸浮液后4 C, 8000r 離心 5mi n,然后棄去上清。重復(fù)以上操作一次,共洗細(xì)胞兩次以洗去培養(yǎng)液。3. 按 1ml 裂解液加 10 卩 l PMSF(100 mM,搖勻置于冰上。(PMSF 要搖勻至無結(jié)晶時才可與裂解液混合。)4. 在樣品中加入 300ul 含 PMSF 的裂解液,吹勻,于冰上裂解30 min,為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動。5. 裂解完后,于 4C 下 12000 rpm 離心 5 min。7.將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒 0.5 ml 的離心管中放于一 20C 保存。二、蛋白含量的測定(BCA 定量)準(zhǔn)備:96 孔板,移液槍(1000ul , 10ul , 20
4、0ul ), BCA 工作液(A+E) , 50mlEP 管,1xPBS, BSA 標(biāo)準(zhǔn)液1. 將 96 孔板分好區(qū)域,若不夠分則只做兩個重復(fù),(外圍一圈的孔最好不用)2. 算好孔數(shù)(總的)每孔加 200ulBCA 工作液(A+B) , (A 液:B 液=50:1,一般配多些,如 60 孔,A 液 12000ul ,B 液 240ul )3. 將樣品稀釋到一定倍數(shù)才能定量,(10 倍,20 倍,30 倍),每孔需要 20ul 樣品(2ul 樣品+18ulPBS,即稀釋 10 倍),做三個重復(fù)則需要 60ul,一般配 80ul4. 配蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品,將 2mg/ml 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至 0.5m
5、g/ml,若配 200ul 的 0.5mg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液則需要 50ul 的 2mg/ml 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液和 150ul PBS 溶液5. 將稀釋好的樣品加入孔板中(標(biāo)記的區(qū)域),接著標(biāo)準(zhǔn)品按0, 1,2,4,8,12,16,20加到標(biāo)號的區(qū)域,之后在加標(biāo)準(zhǔn)樣品的孔內(nèi),將孔內(nèi)溶液用PBS 補足到 20ul6. 每孔加 200ul 配好的工作液,平行加,不能上下加,以減少誤差7. 將加好的 96 孔板放在 37 C 下孵育 30 分鐘8.孵育完后,放在酶標(biāo)儀輕微震蕩 3-10S,中速,吸光值 595nm,進行比色測定,記錄標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品吸光值數(shù)據(jù)后,以蛋白含量(ml)為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐
6、標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。(R20.98 才有用,酶標(biāo)儀操作:兩個箭頭 圖標(biāo),1 是結(jié)果,2 是保存)3歡迎下載精品文檔9.計算蛋白含量(注意定量樣品已經(jīng)稀釋了10 倍)蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線加樣量骨口. 序號12345678標(biāo)準(zhǔn)蛋白量/ul0128121620(0.5mg/ml)4背景液(PBS /ul2019181612840標(biāo)準(zhǔn)液濃度mg/ml00.0250.050.10.20.30.40.5三、SDS- PAGE 電泳1.配膠(12%,可以提前配好)準(zhǔn)備:玻璃板,梳子,AP (解凍,現(xiàn)拿現(xiàn)用),聚丙烯酰胺(4 C 冰箱冷藏)(1)玻璃板驗漏 5mi n(2 )按表配置分離膠(3)灌膠,加酒精封壓,凝
7、30min (注意不要有氣泡)(4)按表配濃縮膠,倒掉酒精,用吸水紙吸去酒精,灌膠,插梳子(注意不要有氣泡),凝30mi n(5) 取膠,用水沖洗一下濃縮膠,加少量水放入一次性手套中4C 冰箱保存?zhèn)溆?.樣品處理準(zhǔn)備:PBS 移液槍,1.5mlEP 管(1) 稀釋樣品:一般每孔上樣 5ul,即 1mg/ml 濃度的樣品,測完蛋白含量后,將樣品用PBS 稀釋至 1mg/ml(注意 loadingbuffer的加入也得算入)(2)取出上樣樣品 15ul 至 1.5 ml 離心管中,加入 6X SDS 上樣緩沖液 3ul 至終濃度為 1 xo(上樣總體積一般不超過 15 卩 l,加樣孔的最大限度可加
8、20 卩 l 樣品。)(3)將樣品在 100C 煮 5 min 震蕩使蛋白完全變性(注意儀器操作)3.電泳準(zhǔn)備:電泳液 500ml (現(xiàn)配),蛋白膠,10ul 移液槍(槍頭),樣品, Marker,冰盒,電泳裝置(1 )將 SDS-PAGE 交放入電泳槽中,加足夠的電泳液。(短玻璃板面向內(nèi),長玻璃板面向外。若只跑一塊膠,那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。電泳液至少要漫過內(nèi)測的短玻璃板。注意先檢漏。)(2)上樣。用移液槍貼壁吸取樣品, 將樣品吸出不要吸進氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。(加樣太快可使樣品沖出加樣孔,若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時,進樣器需在外槽電
9、泳 緩沖液中洗滌3 次,以免交叉污染。)4歡迎下載精品文檔(3)先設(shè)置 80V,開始電泳,樣品溴酚藍跑至分離膠后增至120V 電壓,電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳,進行轉(zhuǎn)膜。(此時準(zhǔn)備好電轉(zhuǎn)液)四、轉(zhuǎn)膜準(zhǔn)備:電轉(zhuǎn)液(現(xiàn)配 4 C 冰箱冷藏),鑷子,濾紙,PVDFM( 0.45um),電轉(zhuǎn)裝置,冰盒注意:拿濾紙和膜時一定要戴手套或用鑷子,因為手上的蛋白會污染膜。1.在加有轉(zhuǎn)移液的盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊2. 濾紙浸入電轉(zhuǎn)液中,PVDF 膜在甲醇中潤濕成半透明,小心將膜放入4C 電轉(zhuǎn)液中平衡至少 5min。3.將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊,用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣
10、泡。(一 手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。)在墊子上墊三層濾紙(可三張紙先疊在一起在墊于墊子上),一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。4. 先將玻璃板撬掉才可剝膠,撬的時候動作要輕,要在兩個邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會兒玻璃板便開始松 動,直到撬去玻板。(撬時一定要小心,玻板很易裂。)除去小玻璃板后,將濃縮膠輕輕刮去(濃縮膠影 響操作),要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上(做好標(biāo)記),用手調(diào)整使其與濾紙對齊,輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上,要蓋滿整個膠(膜蓋下后不可再移動)并除氣泡。在膜上蓋3 張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊,搟幾下就可合起夾子。整個操作在轉(zhuǎn)移液中進行,
11、要不斷的搟去 氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸,接觸后會發(fā)生短路。(轉(zhuǎn)移液含甲醇,操作時要戴手套,實驗室要開 門以使空氣流通。)5.將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中(電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱,漿槽放入冰中),要使夾的黑面對槽的黑面,夾的白面對槽的 紅面。一般用100mA 轉(zhuǎn)移 90min。6.轉(zhuǎn)完后將膜用 1X 麗春紅染液染 5 min (于脫色搖床上搖)。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜 上的蛋白。將膜晾干備用。(準(zhǔn)備封閉液)六、免疫反應(yīng)準(zhǔn)備:封閉液,一抗,二抗,TBST1 .將膜移至含有封閉液的平皿中,室溫下脫色搖床上搖動封閉2h。2.TBST 洗 4 次。每次 5 分鐘。3. 將膜按照目的蛋白所處位置剪切并做好標(biāo)記,加入相對應(yīng)的一抗,室溫孵育2h 或者 4 C 過夜4. 室溫下孵育 12 h 后,用 TBST 在室溫下脫色搖床上洗四次,每次5min5.同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸,室溫下孵育12 h 后,用 TBST 在室溫下脫色搖床上洗 4 次,每5歡迎下載次 5 min七、顯影準(zhǔn)備:樣品膠片,移液槍(200ul ),中槍頭,吸水紙,顯影液(A+B,薄鑷子二抗28kd目的蛋白17kd Sep15 1:10001.將 A 和 B 兩種試劑在保鮮膜上等體積混合;2.1 min 后,取適量顯影液于顯影儀臺面上,將膜用鑷子夾起來正反面充分和顯影液接觸,注意切角在左上,即正面
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