南海海洋微生物混合培養(yǎng)標(biāo)書

1、 項(xiàng)目編號(hào)：廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院課題設(shè)計(jì)大賽 申 請(qǐng) 書 項(xiàng)目名稱 一種南海軟珊瑚共生菌的抗腫瘤菌株的篩選及其培養(yǎng)條件優(yōu)化的研究字太多，控制在25字以內(nèi)。 項(xiàng)目負(fù)責(zé)人 專業(yè)班級(jí) 指導(dǎo)教師 單 位 聯(lián)系電話 申請(qǐng)日期 項(xiàng)目類別： A 中醫(yī)藥類 B 社會(huì)科學(xué)類廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院二O一一年 四 月 作品名稱 一種南海軟珊瑚共生菌的抗腫瘤菌株的篩選及其培養(yǎng)條件優(yōu)化的研究項(xiàng)目負(fù)責(zé)人性 別出生年月學(xué) 歷（）A本科生 B 大專類別（）A個(gè)人作品 B集體作品學(xué) 院專業(yè)年 級(jí)學(xué) 制入 學(xué)時(shí) 間指導(dǎo)老師學(xué)號(hào)聯(lián)系方式合作者情況姓 名性別所在單位（學(xué)院、專業(yè)、年級(jí)、學(xué)號(hào)）學(xué)歷年齡作者簽名此項(xiàng)刪除摘要（限400字

2、）目的：從一種南海軟珊瑚共生菌中篩選出一株抗腫瘤活性最強(qiáng)的菌株，并利用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化培養(yǎng)條件，以提高次級(jí)代謝產(chǎn)物含量和抗腫瘤活性。 方法：用不同抑菌劑將軟珊瑚共生菌進(jìn)行分類培養(yǎng)，純化分離出海洋細(xì)菌、放線菌和真菌，用MTT分析法對(duì)各培養(yǎng)液進(jìn)行抗腫瘤活性測試，選擇一株抗腫瘤活性最高的菌株，采用分子生物學(xué)進(jìn)行形態(tài)鑒定，并命名為“ZZCL菌株，同時(shí)采用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物運(yùn)用萃取，薄層色譜，正相、反相硅膠柱色譜等化學(xué)分離純化手段進(jìn)行分離，繼而利用理化性質(zhì)和波譜學(xué)（UV、MS等）等方法確定生物活性物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。結(jié)果：通過實(shí)驗(yàn)篩選出了抗腫瘤活性最強(qiáng)的一株菌株，同時(shí)確定出產(chǎn)生物活

3、性物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)及最佳培養(yǎng)條件。并非已有結(jié)果的正式論文，所以不用四段論。項(xiàng)目的立項(xiàng)依據(jù)（附參考文獻(xiàn)）研究意義與存在問題腫瘤是細(xì)胞異常增生所形成的，目前全球每年的癌癥（惡性腫瘤）患者達(dá)1270萬人，癌癥死亡者為760萬人。儼然，腫瘤已成為當(dāng)今嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一。近年來，抗腫瘤藥物的發(fā)展進(jìn)入了一個(gè)新的階段，由天然藥物的開發(fā)發(fā)展到了新靶點(diǎn)抗腫瘤藥研究以及基因療法等，隨著臨床應(yīng)用的進(jìn)一步擴(kuò)展，腫瘤的藥物治療將在未來一段時(shí)間內(nèi)得到更大發(fā)展1。而海洋微生物中許多結(jié)構(gòu)新穎、活性獨(dú)特的物質(zhì),因其很多具有抗腫瘤活性，備受科學(xué)家的重視。海洋生物活性物質(zhì)的研究是自20世紀(jì)60年代開始，然而海洋微生物活性

4、物質(zhì)的研究相對(duì)比較緩慢，只有零星的來自海洋微生物的活性物質(zhì)被報(bào)道2，對(duì)軟珊瑚的研究也有同樣的情況，大部分研究還是針對(duì)其體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物。另外，現(xiàn)有的研究較少有探討培養(yǎng)條件的變化對(duì)生物活性物質(zhì)相關(guān)作用的影響。故本文選取一種南海軟珊瑚，分離純化其共附菌，篩選出抗腫瘤活性最強(qiáng)的菌株，并用正交試驗(yàn)確定最佳培養(yǎng)條件，更好地挖掘出海洋微生物分離抗腫瘤活性物質(zhì)的潛力，進(jìn)而通過分子生物學(xué)和化學(xué)等方法確定化學(xué)結(jié)構(gòu)式，豐富海洋微生物基因庫。腫瘤病國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分節(jié)好些。腫瘤是一類古老的疾病，早在2000-3000年前，國內(nèi)外已有關(guān)于腫瘤的記載。腫瘤是細(xì)胞異常增生所形成的，根據(jù)腫瘤的生物學(xué)行為可以分為良性，惡性及

5、交界性腫瘤，良性腫瘤一般生長緩慢，與周圍正常組織之間有明顯的界限，常有完整的包膜，也不向外擴(kuò)散侵入正常組織，不會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移，僅對(duì)周圍組織產(chǎn)生擠壓，通常預(yù)后效果較好，一般不會(huì)導(dǎo)致患者死亡，而惡性腫瘤生長迅速，呈浸潤性生長并侵犯周圍組織，瘤體質(zhì)地一般較堅(jiān)硬，多無包膜，常會(huì)發(fā)生血道和淋巴道的轉(zhuǎn)移或者種植于胸腔、腹腔及盆腔等處，手術(shù)后常會(huì)復(fù)發(fā)。生物學(xué)介于良性和惡性之間的腫瘤為交界性腫瘤，我們常說的癌事實(shí)上是惡性腫瘤的一種，在社會(huì)生活中，是所有惡性腫瘤的俗稱和統(tǒng)稱，醫(yī)學(xué)上指的是上皮組織的惡性腫瘤，約占惡性腫瘤的90%，另外一種惡性腫瘤是肉瘤，它來源于間葉組織/淋巴造血和神經(jīng)組織等，約占惡性腫瘤的10%。腫

6、瘤的產(chǎn)生和發(fā)展是一個(gè)多因素作用，多因素參與，經(jīng)過多階段才形成的生物學(xué)現(xiàn)象，不同的研究階段提出了不同的學(xué)說。目前為止，被學(xué)術(shù)界肯定并沿用的學(xué)說主要有三階段學(xué)說、兩次突變學(xué)說、多階段學(xué)說和干細(xì)胞起源學(xué)說。不過近些年研究比較多的是腫瘤干細(xì)胞理論，也有研究證實(shí)，正常組織器官存在一定數(shù)量的干細(xì)胞，它具有潛在的自我更新和分化能力，而正常組織干細(xì)胞與惡性腫瘤細(xì)胞有著極其相似的生長調(diào)控機(jī)制，腫瘤的發(fā)生與組織干細(xì)胞有著密切聯(lián)系，并認(rèn)為腫瘤細(xì)胞源于組織干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤除了具有一定的異常因素外，人類80%-90%以上的癌癥與外部環(huán)境因素也有關(guān)，即人類生活環(huán)境中的物理、化學(xué)和生物因素與癌癥的發(fā)生密切相

7、關(guān)。目前，已有不少惡性腫瘤可能通過化學(xué)治療痊愈，如惡性淋巴瘤，睪丸生殖細(xì)胞腫瘤，滋養(yǎng)葉細(xì)胞瘤等能夠通過化學(xué)治療獲得根治性療效。另外，近些年來腫瘤的抗血管生成治療、腫靶向治療、腫瘤熱療及腫瘤的生物治療也為腫瘤的內(nèi)科治療提供了多種手段 3。在抗腫瘤藥物的研究上，海洋微生物因環(huán)境特異，形成特有的代謝途徑和機(jī)體防御機(jī)制，其產(chǎn)生的代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)具極大的復(fù)雜性和多樣性。這就為從海洋微生物及其代謝產(chǎn)物中篩選和提取具有特異化學(xué)結(jié)構(gòu)的天然活性物質(zhì)提供了極大的可能性。近幾年來的研究表明海洋微生物提取物中至少有10%具有細(xì)胞毒活性，美國每年有1 500 個(gè)海洋化合物單體被分離出來,其中1%具抗腫瘤作用4。從海洋微

8、生物中篩選抗腫瘤活性物質(zhì)是當(dāng)今“向海洋要新藥”的熱點(diǎn)之一，這也為延長患者生存期、提高生存質(zhì)量提供了更多的方案。海洋微生物及其培養(yǎng)條件優(yōu)化的研究現(xiàn)狀一般認(rèn)為，海洋微生物是分離自海洋環(huán)境，需要在仿生條件下才能正常生長環(huán)境，但現(xiàn)在更為科學(xué)的認(rèn)識(shí)是，其生長不一定需要海水，但可產(chǎn)生不同于陸地微生物的代謝物( 如溴代化合物抗生素) 或擁有某些特殊的生理性質(zhì)( 如鹽耐受性、液化瓊脂等)。因此海洋微生物包括海洋中生物起源的種類，又包含陸地起源后流入海洋中并適應(yīng)了的微生物種類，因此，海洋微生物幾乎包括了所有的現(xiàn)有微生物種類。海洋微生物與陸地微生物有著很大不同。海洋中寡營養(yǎng)的條件，迫使許多海洋微生物與富含營養(yǎng)成分

9、的海洋動(dòng)植物共生, 以獲得生存必需的營養(yǎng),這種現(xiàn)象在海洋微生物中很普遍并具有很高的特異結(jié)合選擇性。微生物物種之間爭奪宿主的競爭也十分激烈, 導(dǎo)致很多微生物通過代謝產(chǎn)生一些小分子有機(jī)化合物來爭奪有限的營養(yǎng)和進(jìn)行自我防御,而且由于生存環(huán)境的原因, 很多海洋微生物次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、生物活性均與陸地微生物有明顯不同, 這些化合物是海洋微生物次生代謝產(chǎn)物作為新藥藥源的重要基礎(chǔ)5。研究認(rèn)為，海洋微生物有五類基本代謝物：胺及酞胺類、吲哚生物堿類、乙酰配基類、環(huán)肽類、聚丙酸酯類, 其生物活性包括抗菌、抗腫瘤、抗微生物、抗病毒、酶及酶的抑制活性等，抗腫瘤活性是其中的一個(gè)最重要方面6。在代謝產(chǎn)物提取分離等技

10、術(shù)上，傳統(tǒng)的液液萃取分離技術(shù)成本比較低、易于運(yùn)作，仍廣泛應(yīng)用于多組分物質(zhì)的分離。但由于溶劑的局限性，難于分離大分子生物活性物質(zhì)。因此，一些新的萃取技術(shù)如超臨界流體萃取技術(shù)、膜分離技術(shù)超和臨界流體色譜等應(yīng)運(yùn)而生7，雖然對(duì)海洋微生物生物活性代謝產(chǎn)物的分離提取和研究提供有力的技術(shù)支持，但據(jù)估計(jì)，目前只有不足5 % 的海洋微生物可以培養(yǎng)鑒定，已發(fā)現(xiàn)的活性物質(zhì)只占總數(shù)的1% 8，所以如何提高提取分離和鑒定的技術(shù)，也是當(dāng)下應(yīng)解決的重點(diǎn)問題。隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，微生物對(duì)工業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境、醫(yī)藥、食品衛(wèi)生、畜牧、獸醫(yī)等事業(yè)發(fā)揮著越來越重要的作用。由于各類微生物對(duì)營養(yǎng)有不同的要求以及微生物培養(yǎng)用途的不同，促進(jìn)

11、了微生物培養(yǎng)的研究、生產(chǎn)、使用技術(shù)的不斷改進(jìn)。但是發(fā)酵過程機(jī)理復(fù)雜，影響因素眾多，菌種的生理生化特性及發(fā)酵的工藝確定后，適宜的培養(yǎng)基配方成為發(fā)酵水平、原料成本高低的決定因素而一般的培養(yǎng)基種類繁多，各成分間的相互作用錯(cuò)綜復(fù)雜因而，微生物培養(yǎng)基的優(yōu)化工作就顯得尤為重要，對(duì)于培養(yǎng)基的優(yōu)化有一些比較成熟的方法，如單因素法、正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)法及響應(yīng)面分析法9，其中正交實(shí)驗(yàn)法以其試驗(yàn)次數(shù)少、考察因素多、水平合理、分布均勻等優(yōu)點(diǎn)成為實(shí)驗(yàn)室常用方法。為適應(yīng)實(shí)驗(yàn)的需要，研究者不斷開拓新方法或采用不同方法交叉對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，這為特定目的的資源菌株或特定環(huán)境的資源菌珠的分離和批量化生產(chǎn)提供更多選擇。 海洋微生物抗腫瘤

12、的研究在腫瘤治療中，手術(shù)治療、放療、化療是最傳統(tǒng)的3種治療方案，其中化療占據(jù)著不可替代的重要地位10，因此對(duì)化療藥物的研究，成為抗腫瘤的重點(diǎn)問題之一。常用的抗腫瘤藥物有烷化劑類、抗代謝藥、抗生素、植物藥、激素及內(nèi)分泌類藥物、雜類、生物治療藥物、中藥類單方、中成藥、海洋藥物等11。海洋生物的天然活性產(chǎn)物因其正在不斷地為抗腫瘤新藥的研究與開發(fā)提供大量的母核結(jié)構(gòu)和藥物前體，成為學(xué)者預(yù)言的最有前途的抗腫瘤藥物，而海洋微生物在此領(lǐng)域有著巨大的潛力。目前已從海綿、海鞘、海兔、海藻、海苔蟲、鯊魚、珊瑚以及海洋微生物中分離出2萬余種天然產(chǎn)物,其中不少化合物顯示出明顯的抗腫瘤活性, 一些化合物已被作為抗腫瘤候選

13、藥物進(jìn)入了臨床前或臨床研究階段12。軟珊瑚是其中一個(gè)重點(diǎn)開發(fā)物種，研究表明軟珊瑚大部分都含有豐富的化學(xué)物質(zhì)，其分離出來的化學(xué)物質(zhì)已經(jīng)被證實(shí)能抑制癌細(xì)胞的增長，具有作為天然藥物的潛力。隨著海洋中微生物新種的不斷發(fā)現(xiàn)及分離到的海洋微生物代謝產(chǎn)物逐年增多，海洋微生物尤其是海洋細(xì)菌作為活性物質(zhì)的新來源正日益受到國內(nèi)外海洋工作者的重視13。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在海洋動(dòng)、植物體表附生及海洋動(dòng)物腸道內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量比真菌和放線菌的數(shù)量高1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。同時(shí)，海洋細(xì)菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)的種類也最為豐富，有抗菌素、抗病毒和抗腫瘤物質(zhì)、毒素、酶類、多糖、酶抑制劑等14-16。雖然海洋生物蘊(yùn)藏著重要且豐富的資源，但目前人們對(duì)海洋生

14、物的認(rèn)識(shí)仍相當(dāng)有限，利用率僅有1%,而且更大部分是對(duì)海洋生物活性物質(zhì)化學(xué)成分的研究。綜上所述，海洋微生物雖然以抗腫瘤藥源之一成為研究重點(diǎn)，但其研究技術(shù)還不夠成熟，相應(yīng)的培養(yǎng)條件還需進(jìn)一步優(yōu)化，尤其是缺乏對(duì)海洋動(dòng)植物體共生菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)條件優(yōu)化的研究。因此，本課題將從眾多科學(xué)家認(rèn)為較有研究意義的軟珊瑚共附菌中分類培養(yǎng)出海洋細(xì)菌、真菌、放線菌，尋找一株抗腫瘤活性最強(qiáng)的菌株，并通過正交試驗(yàn)探討培養(yǎng)條件的優(yōu)化對(duì)其抗腫瘤活性的影響，同時(shí)提取分離并確定生物活性物質(zhì)，不僅為腫瘤病提供新藥源，也豐富海洋微生物基因庫。參考文獻(xiàn)：1 唐永剛.抗腫瘤藥物臨床應(yīng)用現(xiàn)狀與研究進(jìn)展J. 藥學(xué)專論,2008 ,17

15、（7）：1-22 詹萍，梁靜娟，龐宗文產(chǎn)生物活性物質(zhì)海洋微生物的研究進(jìn)展J玉林師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，28(3)：71743 華東. 如何正確認(rèn)識(shí)惡性腫瘤J.抗癌之窗, 2012, 2 (2 ), 40-44.4 陳鋼，朱衛(wèi).海洋微生物抗腫瘤活性物質(zhì)研究進(jìn)展J. 浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào), 2008，27（3）：322-324.5 王 幸,吳文惠,陳志華,等.海洋微生物次生代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征和生物活性的研究進(jìn)展J.中國天然藥物, 2010 ,8(4)：309-311）.6 胡艷紅,張慶林,王正平.海洋微生物生物活性代謝物研究進(jìn)展及技術(shù)問題J.科學(xué)技術(shù)與工程,第2004,4(2)：160-162.7 張

16、奕婷,遲海洋,張麗霞,等. 海洋微生物活性物質(zhì)分離提取方法研究進(jìn)展J.2010,30(6)：121-124.8 Knight V.Sanglier J J.Ditullio D,et al.Diversifying microbial natural products for drug discovery.Appl Microbiol Bitechnol ,2003,1-28.9 SAUDAGAR P SSINGHAL R SOptim ization of NutritionalRequirements and Feeding Strategies for Clavulanic Acid P

17、roduc·tion by Streptomyces ClavuligerusJBioresour Technol，2007，98(10)：2 0102 01710 巫蒙,王梅.腫瘤多藥耐藥性產(chǎn)生機(jī)制及其逆轉(zhuǎn)的研究J.現(xiàn)狀當(dāng)代醫(yī)學(xué),2011, 17(21) ：26-27.11 劉因華. 抗腫瘤藥物的研究現(xiàn)狀與發(fā)展前景J.中國醫(yī)藥指南,2007 , 6(17)： 105-106.12 連煒,葉波平.海洋天然抗腫瘤活性產(chǎn)物的臨床研究現(xiàn)狀J藥學(xué)進(jìn)展，2009, 33(5) ：24 . 13 鄭立，林偉，嚴(yán)小軍，等海洋細(xì)菌抗菌和細(xì)胞毒活性的初步研究J應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2004，15(9)：163

18、3一l63614 詹萍，梁靜娟，龐宗文產(chǎn)生物活性物質(zhì)海洋微生物的研究進(jìn)展J玉林師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，28(3)：717415 孫倩，洪葵海洋細(xì)菌生物活性物質(zhì)多樣性0海南省生物工程會(huì)2005年熱帶亞熱帶微生物資源遺傳多樣性與基因發(fā)掘利用研討會(huì)論文集，三亞：海南省生物工程協(xié)會(huì)，2005：36-4116 呂家森，黃惠琴，叢明，等一株海洋細(xì)菌的鑒定及其活性物質(zhì)的初步研究J海洋學(xué)報(bào)，2006，28(5)：173178研究目標(biāo)針對(duì)這兩字精簡。1.綜合微生物學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)等多學(xué)科的知識(shí)，對(duì)一種南海軟珊瑚的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，為進(jìn)一步擴(kuò)大天然生物中的活性成分篩選，開發(fā)出更多的高效低

19、毒的天然抗腫瘤藥物，以便直接用于臨床或作為先導(dǎo)物通過結(jié)構(gòu)改造成新的抗癌成分。2.測定活性菌株的抗瘤譜，對(duì)抗瘤譜較好的菌株進(jìn)行下一步研究。3.對(duì)抗腫瘤活性最強(qiáng)的一株菌株進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化，更好地挖掘海洋微生物分離出抗腫瘤活性物質(zhì)的潛力。研究內(nèi)容內(nèi)容太多，選取一部分即可。1.南海海域一種軟珊瑚的共附生微生物的分離與活性篩選；2.采用MTT法，以胃癌、肝癌腫瘤細(xì)胞為篩選模型進(jìn)行體外抗腫瘤活性的一級(jí)、二級(jí)篩選，并結(jié)合HPLC指紋圖譜及薄層色譜進(jìn)行化學(xué)篩選；3.選擇（2）中抗腫瘤活性最高的一株菌株，命名為“ZZCL菌株”，結(jié)合分子生物學(xué)方法對(duì)該菌株進(jìn)行系統(tǒng)的分類鑒定，并對(duì)其次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)研究；4.對(duì)

20、“ZZCL菌株”的發(fā)酵條件進(jìn)行探討，通過對(duì)不同濃度和種類的碳源、氮源、不同的發(fā)酵溫度、培養(yǎng)時(shí)問、初始培養(yǎng)基pH等做正交實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行大量篩選，最終確定出最適的培養(yǎng)條件。擬采取的方案1. 樣品處理用75%消毒酒精清洗樣品表面無菌海水清洗樣品表面3遍，制成共附微生物組織液用無菌組織勻漿器研磨至呈粘稠狀液體切碎樣品靜置20min，上清液即為內(nèi)生菌組織液1800r/min振蕩1min3g于9ml無菌海水中2. 菌種分離各取適量體表和體內(nèi)菌組織液配成濃度為10-1的母液，并依次稀釋梯度至10-2、10-3,，各取0.2ml不同梯度的樣品稀釋液到相應(yīng)的分離培養(yǎng)基平板上，用無菌玻璃涂布棒在相應(yīng)培養(yǎng)基表面輕輕地涂

21、布均勻，于28。C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察，待菌絲長出后，及時(shí)挑出形態(tài)差異較大的單菌落，采用平板劃線法二次純化后接種于固體斜面培養(yǎng)基，長成后置于冰箱4。C下保存。培養(yǎng)基配方：添加有兩性霉素的LB培養(yǎng)基（分離細(xì)菌用），添加有硫酸鏈霉素的PDA培養(yǎng)基（分離真菌用），添加有0.03%重鉻酸鉀的高氏一號(hào)培養(yǎng)基（分離放線菌用） 。3. 菌種保存挑取純化后的單菌落用20%甘油水溶液保存于保存管中，4。C保存?zhèn)溆谩?. 抗腫瘤測試用MTT分析法進(jìn)行抗腫瘤活性測試，即取對(duì)數(shù)生長期的小鼠腫瘤細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，接細(xì)胞于96孔板中，培養(yǎng)過夜。加實(shí)驗(yàn)藥物，再培養(yǎng)3d，PBS洗后加入MTT，再培養(yǎng)4h，去除MTT，

22、加DMSO與甘氨酸pH緩沖液，搖床搖0.51h（細(xì)胞看不見為止），酶標(biāo)儀測定吸光度（A），=570nm。以阿霉素作為陽性對(duì)照。抑制率計(jì)算：抑制率=100%×（A對(duì)照-A實(shí)驗(yàn)）/ A實(shí)驗(yàn)發(fā)酵液活性以ID50衡量，ID50為抑制率為50%時(shí)發(fā)酵液所稀釋的倍數(shù)；抗腫瘤藥物的活性以IC50衡量，IC50為抑制率為50%時(shí)藥物的濃度。5. 菌種鑒定形態(tài)學(xué)觀察：在平板上點(diǎn)植“ZZCL菌株”，28。C培養(yǎng)3-10d，觀察菌落形態(tài)、菌落顏色、產(chǎn)色素情況、表面滲出物情況。培養(yǎng)基均用海水配制，并添加抑菌劑。革蘭氏染色：取“ZZCL菌株”的菌液，革蘭氏染色，顯微鏡下觀察。顯微形態(tài)觀察：在平板上點(diǎn)植“ZZC

23、L菌株”，28。C培養(yǎng)，觀察菌絲形態(tài)、大小、表面特征、顏色、有無橫隔、產(chǎn)孢器結(jié)構(gòu)及孢子大小、形狀、顏色。檢索相關(guān)菌株鑒定手冊(cè)，初步確定菌株的分類地位。18S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析：技術(shù)路線如下“ZZCL菌株”菌絲體的收集 菌絲DNA的抽提 菌絲DNA PCR擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物回收 目的DNA片段的克隆 序列測定 GenBank Blast 分析 多序列比對(duì) 系統(tǒng)發(fā)育分析 6. 提取和分離將菌體和培養(yǎng)液分開收集，菌體風(fēng)干后，用甲醇提取數(shù)次，提取液濃縮后，經(jīng)硅膠柱層析，用石油醚乙酸乙酯，乙酸乙酯甲醇梯度洗脫，收集各組分再反復(fù)經(jīng)過硅膠層析柱分離?！癦ZCL菌株”的代謝產(chǎn)物提取分離流程圖見圖：

24、 ZZCL菌株 培養(yǎng)150L 抽濾 培養(yǎng)液菌體風(fēng)干乙酸乙酯提取物 甲醇浸漬物 硅膠柱 溶劑 產(chǎn)物 梯度洗脫 硅膠柱 溶劑梯度洗脫 產(chǎn)物7. “ZZCL菌株”的發(fā)酵條件優(yōu)化7.1 培養(yǎng)條件優(yōu)化7.1.1 培養(yǎng)基的選擇：在最佳碳源選擇、最佳氮源選擇、最佳無機(jī)鹽選擇、碳源濃度、氮源濃度、無機(jī)濃度這六個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)。7.1.2 培養(yǎng)條件的選擇：在培養(yǎng)基初始PH值、海水濃度、接種量、裝液量、培養(yǎng)時(shí)間、溫度這六個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，同樣選擇L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)。7.2 抗腫瘤活性物質(zhì)理化性質(zhì)初步研究采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件對(duì)“ZZCL菌株”進(jìn)行發(fā)酵，收集發(fā)酵

25、液5000r/min離心10min，取上清液進(jìn)行性質(zhì)確認(rèn)實(shí)驗(yàn)：六份上清液分別置于室溫、40、60、80、100和121水浴維持20min境中，維持7.2.1 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)抗腫瘤活性測試（以原始發(fā)酵液為對(duì)照）熱穩(wěn)定性 冷卻至 室溫取上清液回調(diào)pH值為原始pH值，并用蒸餾水調(diào)整每份發(fā)酵液為等體積取12份發(fā)酵上清液，用lmolL的HCI和lmolL的NaOH分別調(diào)pH值為100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100和1200，4放置24h酸堿穩(wěn)定性 離心抗腫瘤活性測試7.2.2 抗腫瘤活性物質(zhì)萃取實(shí)驗(yàn)：取5份發(fā)酵上清液，分別加入等體積的三氯甲烷、石油醚、乙

26、酸乙酯、正丁醇和苯，振蕩使二者混合，4"C放置24h，分別收集有機(jī)相和水相，測其抗腫瘤活性。本項(xiàng)目的特色和與創(chuàng)新之處建議精簡。1.利用包括微生物學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)等學(xué)科在內(nèi)的多學(xué)科知識(shí)，使軟珊瑚的研究乃至海洋天然產(chǎn)物的研究得到進(jìn)一步的發(fā)展，使從海洋微生物中篩選抗腫瘤活性物質(zhì)具有更廣闊的前景。2.在傳統(tǒng)的化學(xué)合成和人工培養(yǎng) (包括細(xì)胞培養(yǎng))的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步優(yōu)化和改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法，以期能夠解決海洋藥物研究進(jìn)程中的藥源不足問題。3.開展海洋微生物的研究，將有利于促進(jìn)我國海洋生物資源的開發(fā)利用。4.不只停留在藥理作用可以和第二點(diǎn)結(jié)合，在傳統(tǒng)的化學(xué)合成和人工培養(yǎng) (包括細(xì)胞培養(yǎng))的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步優(yōu)化和改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法，探討培養(yǎng)條件對(duì)抗腫瘤作用和生物活性物質(zhì)的影響，為抗腫瘤新藥的研究與開發(fā)提供母核結(jié)構(gòu)和藥物前體提供可能?？尚行苑治?. 研究表明軟珊瑚大部分都含有豐富的化學(xué)物質(zhì)，其分離出來的化學(xué)物質(zhì)已經(jīng)被證實(shí)能抑制癌細(xì)胞的增長，具有作為天然藥物的潛力。2. 目前對(duì)于軟珊瑚的相關(guān)分離