葡萄酒的釀造實(shí)驗(yàn)報(bào)告記錄

1、葡萄酒的釀造實(shí)驗(yàn)報(bào)告記錄作者：日期：2葡萄酒的釀造及其中酵母菌對發(fā)酵過程的影響實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案一、前言：葡萄酒是用新鮮的葡萄或葡萄汁經(jīng)發(fā)酵釀成的酒精飲料。通常分紅葡萄酒和白葡萄酒兩種。前者是紅葡萄帶皮浸漬發(fā)酵而成；后者是葡萄汁發(fā)酵而成的。我們所要釀造的是紅葡萄酒。葡萄酒有增進(jìn)食欲，滋補(bǔ)作用的作用。葡萄酒中含有糖、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)。這些都是人體必不可少的營養(yǎng)素。它可以不經(jīng)過預(yù)先消化，直接被人體吸收。非凡是對體弱者，經(jīng)常飲用適量葡萄酒，對恢復(fù) -健康有利。同時(shí)還有助于消化，葡萄酒能刺激胃酸分泌胃液，每60-100 克葡萄酒能使胃液分泌增加120 毫升。自釀的葡萄酒，不用添加發(fā)酵劑，也不添加任何防

2、腐劑和澄清劑。家釀的葡萄酒利用葡萄皮上的野生酵母菌分解葡萄中的糖份轉(zhuǎn)化為酒精，另加點(diǎn)糖提高酒精度。一般保質(zhì)期不超過兩年，所以成酒后應(yīng)在兩年內(nèi)喝光。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、熟悉釀造葡萄酒的過程和原理。2、學(xué)會葡萄酒中酵母菌的分離純化。3、熟悉酵母菌形態(tài)觀察和菌落計(jì)數(shù)法4、對比來說明，酵母菌對葡萄酒發(fā)酵的影響，殺菌劑(SO2)對發(fā)酵過程的影響。三、材料和儀器：（一）材料： 葡萄3 斤（因葡萄還未上市，可用提子代替，蘇果超市有，但比較貴）。白糖半斤（二）儀器： 1、主發(fā)酵器：玻璃罐（壇、瓶）、陶瓷壇、能耐受酒精又對人無害的塑料瓶罐等均可。2、二次發(fā)酵容器及裝酒的容器：可以用空酒瓶、飲料瓶、礦泉水瓶等都可3

3、、一根細(xì)塑料管。用來在發(fā)酵完成后利用虹吸法將葡萄酒從發(fā)酵容器中倒出。4、木棒或筷子。用來在發(fā)酵過程中攪拌葡萄皮和葡萄汁。5、絲襪或細(xì)紗布。用來過濾葡萄酒汁。四、實(shí)驗(yàn)步驟：（一）葡萄酒的釀造1、清洗：將主發(fā)酵器（即玻璃壇等）充分洗干凈，控干。2、浸泡：將葡萄摘除蒂，把剪好的葡萄沖洗干凈后用淡鹽水浸泡十分鐘左右，這是為了去掉葡萄皮上的農(nóng)藥和其他有害物質(zhì)，再次沖洗，晾干至表面沒有水珠。3、裝瓶：將葡萄捏破，葡萄肉連同葡萄皮擠到主發(fā)酵器中。當(dāng)把葡萄裝到發(fā)酵器容量的70%左右時(shí)，停止裝葡萄，蓋上蓋子，但不要完全擰緊。34、發(fā)酵：將裝好葡萄的發(fā)酵器放在28恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。葡萄裝入發(fā)酵器后，大約會在12 個(gè)小

4、時(shí)以內(nèi)啟動發(fā)酵，表現(xiàn)為葡萄汁中有較多氣泡產(chǎn)生。在發(fā)酵啟動后，每天兩次用木棒或筷子將葡萄皮壓入酒液中，然后蓋上蓋子。5、加糖：發(fā)酵啟動后一到兩天內(nèi)，放入250g 白糖，作用是提高酒精度。發(fā)酵啟動后三到四天時(shí)，再次放入白糖250g ，將糖浸入葡萄汁中攪拌均勻。6、二次發(fā)酵：當(dāng)酒精發(fā)酵完成后，首先利用虹吸法，將葡萄酒汁倒入二次發(fā)酵器，然后將剩下的葡萄皮、籽、糟等用絲襪或細(xì)紗布過濾，過濾后的酒液也混入二次發(fā)酵器中。葡萄皮、籽、糟扔掉。注意二次發(fā)酵器留有1/10 空隙，蓋子也不要擰的很緊。放在陰涼處。二次發(fā)酵主要是蘋果酸-乳酸發(fā)酵，不再產(chǎn)生酒精。7、加入澄清劑，加入少量酒精。二次發(fā)酵完成，即得到葡萄酒原

5、酒。8、口味：自釀出的葡萄酒是酸的,還有一些的刺激性味。附：葡萄酒的質(zhì)量檢測葡萄酒的質(zhì)量指標(biāo)是現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T15037-94 中規(guī)定的檢驗(yàn)指標(biāo)；色澤：紫紅、深紅、寶石紅、紅微帶棕色澄清程度：澄清透明、有光澤、無明顯懸浮物（使用軟木塞封口的酒允許有3 個(gè)以下不大于1mm 的軟木渣）。葡萄酒應(yīng)是澄清的，若酵母菌生長，則會出現(xiàn)渾濁，所以要檢測出我們自釀的葡萄酒中酵母菌的含量是否合格。香氣：具有純正、優(yōu)雅、怡悅、和諧的果香甜味：具有純凈、幽雅、爽怡的口味和新鮮（二）酵母菌的分離純化1、制備葡萄酒稀釋液取發(fā)酵 2-3 天時(shí)的葡萄酒液，稱量1g于盛有 99mL 無菌水的三角瓶中，充分振蕩，此即為10

6、-2 濃度的菌懸液。用無菌移液管吸取懸液0.5mL于4.5mL 無菌水試管中，用移液管吹吸三次，搖勻，此即為10-3 濃度。同樣方法，依次稀釋到10-7。稀釋過程需在無菌室或無菌操作條件下進(jìn)行。（稀釋倍數(shù)是根據(jù)微生物的數(shù)量進(jìn)行選擇，不固定。可以直接涂布、或劃線法分離純化。）2、涂布法分離（酵母菌定量分離用）依前法向無菌培養(yǎng)皿中傾倒已融化并冷卻至 4550的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，待平板冷凝后，用無菌移液管分別吸取三個(gè)不同稀釋度（ 10-4,10-5,10-6 ）菌懸液 0.1mL-0.2 ，依次滴加于相應(yīng)編號已制備好的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基平板上，右手持無菌玻璃涂棒，左手拿培養(yǎng)皿，并用拇指將皿蓋打開一

7、縫，在火焰旁右手持玻璃涂棒于培養(yǎng)皿平板表面將菌液自平板中央均勻向四周涂布擴(kuò)散，切忌用力過猛將菌液直接推向平板邊緣或?qū)⑴囵B(yǎng)基劃破。3 培養(yǎng)觀察接種后的所有平板倒置與適宜溫度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。大約 28-30 度，時(shí)間兩到三天。 將葡萄分為兩組發(fā)酵，一組為空白對照，另一組加入提取出的酵母菌，觀察其在發(fā)酵過程中酵母菌的生長對葡萄酒發(fā)酵時(shí)間的影響。4、酵母菌形態(tài)觀察4將每個(gè)發(fā)酵階段的葡萄汁用顯微鏡觀察其中酵母菌的菌體特征（三）酵母菌的檢測利用血球計(jì)數(shù)法測定材料與儀器：葡萄酒汁，血球計(jì)數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細(xì)管。操作步驟：1、鏡檢計(jì)數(shù)室在加樣前，先對計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗后才能進(jìn)行

8、計(jì)數(shù)。2、加樣品將清潔干燥的血球計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的細(xì)口滴管將稀釋的葡萄酒汁由蓋玻片邊緣滴一小滴（不宜過多），讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自行進(jìn)入計(jì)數(shù)室，一般計(jì)數(shù)室均能充滿菌液。注意不可有氣泡產(chǎn)生。3顯微鏡計(jì)數(shù)靜止 5 分鐘后，將血球計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。在計(jì)數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有 510 個(gè)菌體為宜。每個(gè)計(jì)數(shù)室選5 個(gè)中格（可選4 個(gè)角和中央的中格）中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí)，即作兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。計(jì)

9、數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的值來計(jì)算樣品的含菌量。4清洗血球計(jì)數(shù)板使用完畢后，將血球計(jì)數(shù)板在水籠頭上用水柱沖洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：次數(shù)各中格中細(xì)胞數(shù)平均菌液濃度 /( 個(gè)/ml ）1234512345注意事項(xiàng)：1、各類容器一定要洗干凈，葡萄在釀制過程中不能碰到油污、鐵器、銅器、錫器等，但可以接觸干凈的不繡鋼制品。2、在發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵器的蓋子一定不要蓋死，防止爆炸。3、糖不要多放，那樣會影響發(fā)酵過程，產(chǎn)生我們不希望的成分，如果想喝甜葡萄酒，可以在發(fā)酵完成后飲用時(shí)加糖。5五、具

10、體操作過程和實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象及分析（一）第一次發(fā)酵：葡萄的清洗，捏碎，裝罐，加蓋（稍微透氧）做成兩個(gè)瓶葡萄酒，一瓶對照（加入分離純化后的酵母菌），一瓶空白。將兩個(gè)發(fā)酵罐放在28 恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵。注意不要太用力搓洗葡萄，以防把葡萄皮上的野生酵母菌洗掉。每天都到實(shí)驗(yàn)室里，將浮在上面的葡萄按下去，以便皮上的酵母菌得到充分的利用。加糖：第一次加糖發(fā)酵兩天后，第二次發(fā)酵五天后。每次每瓶加75 克糖。（二）第一次培養(yǎng)和觀察： （ 1-3 天）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：制備PDA 培養(yǎng)基，滅菌，低溫保存；培養(yǎng)皿滅菌，制備無菌水并保存。1、據(jù)實(shí)驗(yàn)方案， 12 小時(shí)后酒精發(fā)酵啟動，所以1 天后，我們提取了適量葡萄汁，進(jìn)行酵母菌的分離

11、培養(yǎng)。取 0.5ml 的葡萄汁， 梯度稀釋成10-1，10-210-6 ，采用平板涂布的方法，進(jìn)行第一次培養(yǎng)。 取 10-4,10-510-6 的三個(gè)梯度的稀釋菌液進(jìn)行涂布接種，每個(gè)梯度三個(gè)培養(yǎng)皿。涂布完成后，放入28恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，一到兩天。2、葡萄汁的制片觀察：取適量葡萄汁和無菌水混合，再附上載玻片，置于十倍鏡下觀察現(xiàn)象：由于葡萄汁成分非常多，所以鏡頭里背景很模糊，而且，只能觀察到很少的類似于酵母菌的單個(gè)細(xì)胞，放置于40 倍鏡下，觀察也不是很清楚，其他大多是雜菌和雜物在亂跑。（分析，發(fā)酵未真正啟動，葡萄皮上的酵母菌，還未在葡萄汁中大量繁殖，所以是視野里的現(xiàn)象模糊，酵母菌很少）3、葡萄酒

12、的觀察現(xiàn)象從之前強(qiáng)烈的果香味轉(zhuǎn)變?yōu)橛械木葡阄?，而?3-4 天時(shí)，發(fā)酵罐中有大量的氣泡，葡萄皮顏色變暗，葡萄汁增多，且顏色更深。葡萄酒中的酵母菌的觀察，此時(shí)，由于，酵母菌的大量繁殖，在顯微鏡的視野里已經(jīng)能，觀察到很清晰的酵母菌個(gè)體，而且數(shù)量較多，圖像背景亮了很多，（可能是酵母菌的生長抑制了其他雜菌的生長，是的葡萄之中的雜質(zhì)變得很少了。）4、三天后，去取培養(yǎng)好的九個(gè)培養(yǎng)基，觀察其中菌落的生長情況現(xiàn)象：實(shí)驗(yàn)結(jié)果似乎沒有那么理想，培養(yǎng)基中的菌落，可謂五彩繽紛，有白色的菌落，有黃色的粉狀的菌落，有綠色的干燥的菌落，最多的就是黑色霉菌的菌落，散發(fā)出來的味道更偏于霉菌的味道，而且，大多的菌落干燥，且成

13、絨毛絲狀。顯微鏡觀察：盡量挑取一些，純凈的白色菌落的菌種，和無菌水混合置于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)，菌種不純，有一些清晰可見的酵母菌細(xì)胞，但也參雜著一些霉菌的特征結(jié)構(gòu)。結(jié)果處理方案：挑取一些疑似的白色菌種，進(jìn)行涂布培養(yǎng)，方法同上，培養(yǎng)1-2 天。同時(shí)，也要再做一個(gè)備份，萬一，白色的菌落不是酵母菌，所以，再取此時(shí)的葡萄汁，再做六個(gè)培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)，原理同上。（三）第二次培養(yǎng)觀察： （ 4-5 天）葡萄酒里發(fā)酵現(xiàn)象的觀察：葡萄酒里產(chǎn)生了濃郁的酒精味到，而且葡萄酒里有很多泡沫。6疑似菌落的觀察：觀察上次疑似菌種培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)效果還是不佳，雖然有很少的的黑色霉菌生長，但是通過顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)，它應(yīng)該

14、是霉菌的一種，而不是酵母菌備份培養(yǎng)基的觀察：有意外的收獲，發(fā)現(xiàn)，備份的六個(gè)培養(yǎng)基，酵母菌生長的都很好，有很多的乳白色的圓形斑點(diǎn)，濕潤且光滑，聞起來有酒香味，且沒有其他的雜菌，很符合，酵母菌的菌落培養(yǎng)特征。且通過顯微鏡的觀察，觀察到了很清晰的酵母菌細(xì)胞。對比分析：第一次培養(yǎng)的失敗的原因：1、可能是剛一開始，葡萄汁中的酵母菌很少，而稀釋的倍數(shù)太大，導(dǎo)致涂布培養(yǎng)時(shí)，其他雜菌的數(shù)量優(yōu)勢甚于酵母菌，所以才會出現(xiàn)那樣的結(jié)果。2、也有可能在超凈工作臺進(jìn)行涂布操作時(shí)，沒有嚴(yán)格做到無菌，培養(yǎng)基被污染。3、而備份成功的緣由是3-4 天時(shí)，酵母菌生長旺盛，抑制了其他雜菌的生長，使得生長出來的菌落，很純凈。（四）第三

15、次培養(yǎng)觀察： （ 6-7 天）準(zhǔn)備工作： PDA 培養(yǎng)基的制備，麥芽汁培養(yǎng)基的制備，培養(yǎng)皿的滅菌。將備份培養(yǎng)基中長出的酵母菌，進(jìn)行涂布接種，在 10-4 、10-5、10-6 三個(gè)稀釋度，每組做四個(gè)培養(yǎng)基（兩個(gè) PDA ，兩個(gè)麥芽汁） ，做好后放入28 度恒溫的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。觀察：兩天后取出觀察， PDA培養(yǎng)基上菌落長勢良好， 10-4 的兩個(gè)培養(yǎng)基上菌落數(shù)過多，無法計(jì)數(shù)，而 10-5 、 10-6 的培養(yǎng)基上，菌落分布均勻，可以計(jì)數(shù)。可能是由于涂布不均勻的問題，麥芽汁培養(yǎng)基上菌落，太過集中，沒有PDA 上生長的好。由于時(shí)間的有限，我們將此組培養(yǎng)基的菌種接種到對照的葡萄酒中。由于7 天左右已經(jīng)是酒精發(fā)酵的后期，我們發(fā)現(xiàn)在空白的葡萄酒中，已經(jīng)幾乎看不到氣泡，而在對照的試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)還有很多的泡沫，而且酒精味更濃。（五）第二次發(fā)酵8-9 天后，過濾進(jìn)行第二次發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)葡萄果肉大部分已變?yōu)榫疲l(fā)酵基本完成，過濾出的葡萄酒，顏色呈暗紫色，而且很渾濁。葡萄酒放入到第二次發(fā)酵罐中進(jìn)行二次發(fā)酵