蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng).

1、實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定:1目的：(1) 了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)。學(xué)習(xí)測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的一種方法2原理：蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在蛋白質(zhì)溶液中存在下列平衡:yCOOH p/COOrzCOO- .|.|h /COOHxNH2 匚oh 、NH二、NH；陰離子攝性高子"期離子- pH>p!pHplpH<pI電場中;琴向陽槻不務(wù)動(dòng)務(wù)向陰枇當(dāng)溶液的pH達(dá)到一定數(shù)值時(shí),蛋白質(zhì)分子的解離狀態(tài)和解離程度受溶液的酸堿度影響。蛋白質(zhì)顆粒上正負(fù)電荷的數(shù)日相等，在電場中，蛋白質(zhì)既不向陰極移動(dòng)，也不向陽極移動(dòng)，此時(shí)溶液的pH值稱為此種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。 不同蛋白質(zhì)各有其特異的等電點(diǎn)。

2、 在等電點(diǎn)時(shí), 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)都有變化， 可利用此種性質(zhì)的變化測定各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。 最常用的方 法是測其溶解度最低時(shí)的溶液 pH值。本實(shí)驗(yàn)借觀察在不同pH溶液中的溶解度以測定酪蛋白的等電點(diǎn)。用醋酸與酷酸鈉(醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中)配制成各種不同pH值的緩沖液。向諸緩沖溶液中加入酪蛋白后，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的等電點(diǎn)。3. 器材：(1) 水浴鍋。(2) 溫度計(jì)。(3) 200毫升錐形瓶。(4) 100毫升容量瓶。(5) 吸管。試管。(7)試管架。(8)乳缽。4試劑：(1) 0.4 %酪蛋白醋酸鈉溶液200毫升取0.4克酪蛋白，加少量水在乳缽中仔細(xì)地研6,將所得的蛋白質(zhì)懸

3、波移入200毫升錐形瓶內(nèi)，用少量4050 C的溫水洗滌乳缽，將洗滌液也移入錐形瓶內(nèi)。加入10毫升1當(dāng)量/升醋酸鈉溶液。把錐形瓶放到50C水浴中，并小心地旋轉(zhuǎn)錐形瓶，直到酪蛋白完全溶解為止。將錐形瓶內(nèi)的溶液全部移至100毫升容量瓶內(nèi)，加水至刻度，塞緊玻塞，混勻。(2)1.00當(dāng)量/升醋酸溶液100毫升(3)0.10當(dāng)量/升醋酸溶液100毫升(4)0.01當(dāng)量/升醋酸溶液50毫升5操作方法:(1) 取同樣規(guī)格的試營 4支，按下表顛序分別精確地加入各試劑，然后混勻。蓋懺水0衛(wèi)】當(dāng)量/升酣隈譏1當(dāng)出升陽敲14升)12«-70.338.01*017-A_ 11-1-ti(2) 向以上試管中各加

4、酪蛋白的醋酸鈉溶液1毫升，加一管，搖句一管。此時(shí)1、2、3、4管的pH值依次為5.9、5.3、4.7、3.5。觀察其混濁度。靜置10分鐘后，再觀察其混濁度。最混濁的一管的pH即為酪蛋白的等電點(diǎn)。二、蛋白廈的沉淀及變性：1.目 的：(1) 加深對蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認(rèn)識。(2) 了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實(shí)用意義。(3) 了解蛋白質(zhì)變性與沉淀的關(guān)系。2原理：在水溶液中的蛋白質(zhì)分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒，在定的理化因素影響下，蛋白質(zhì)穎拉可因失去電荷和脫水而沉淀。蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為兩類。(1)可逆的沉淀反應(yīng)：此時(shí)蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生顯著變化， 除去引起沉淀的

5、因素后， 蛋白質(zhì)的沉淀仍能 溶解于原來的溶劑中， 并保持其天然性質(zhì)而不變性。 如大多數(shù)蛋白質(zhì)的鹽析作用或在低溫下 用乙醇 (或丙酮 )短時(shí)間作用于蛋白質(zhì)。提純蛋白質(zhì)時(shí)，常利用此類反應(yīng)。(2) 不可逆沉淀反應(yīng)： 此時(shí)蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生重大改變，蛋白質(zhì)常變性而沉淀，不再溶于原來溶劑中。加熱引起的蛋白質(zhì)沉淀與凝固，蛋白質(zhì)與重金屆離子或某些有機(jī)酸的反應(yīng)都屬于此類。蛋白質(zhì)變性后，有時(shí)由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在(如電荷 )，并不析出。因此變性蛋白質(zhì)并不一定部表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性。3.試劉與材料：(1)蛋白質(zhì)溶液 500 毫升5卵清蛋白溶液或雞蛋清的水溶液(新鮮雞蛋清：水=1 :

6、 9)(2)pH4.7 醋酸醋酸鈉的緩沖溶液 100 毫升(3) 3%硝酸銀溶液 10 毫升(4) 5三氯乙酸溶液 50 毫升(5) 95乙醇 250 毫升(6) 飽和硫酸銨溶液 250 毫升(7) 硫酸銨結(jié)晶粉末1000 克(8) 0.1 當(dāng)量升鹽酸溶液 300 毫升(9) 0.1 當(dāng)星升氫氧化鈉溶液100 毫升(10) 0.1 當(dāng)員升碳酸鈉溶液 100 毫升(11) 0.1 當(dāng)量升醋酸溶液 100 毫升(12) 甲基紅溶液 20 毫升(13) 2氯化鋇溶液 150毫升4. 操作方法：(1 )蛋白質(zhì)的鹽析。無機(jī)鹽 (硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等 )濃溶液能析出蛋白質(zhì)。鹽的濃度不同，析出的蛋白質(zhì)也

7、不同。如球蛋白可在半飽和硫酸銨溶液中析出，而清蛋白則在飽和硫酸銨溶液中才能析出。由鹽析獲得的蛋白質(zhì)沉淀，當(dāng)降低其鹽類濃度時(shí)， 又能再溶解，故蛋白質(zhì)的鹽析作用是可逆過程。加5%卵靖蛋白溶液5毫升于試管中，再加等量的飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置數(shù)分鐘則析出球蛋白的沉淀。 倒出少量混蝕沉淀， 加少量水，是否溶解，為什么？將管內(nèi)容物過濾， 向?yàn)V液中添加硫酸銨粉末到不再溶解為止，I此時(shí)析出的沉淀為清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸餾水，觀察沉淀的再溶解。(2) 重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)重金屬離子與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶于水的復(fù)合物。取一支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2毫升,再加3%硝酸銀溶液12滴，振蕩試管，有沉淀產(chǎn)生。放置片刻，傾出上消液，向沉淀中 加入少量的水，沉淀是否溶解？為什么？(3) 某些有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)取一支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2毫升，再加入1毫升5%三氯乙酸溶液，振蕩試管，觀察沉淀的生成。放置片刻，傾出上清液，向沉淀中加入少量水，觀察沉淀是否溶解。(4) 有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)取一支試管，加入 2毫升蛋白質(zhì)溶液，再加入 2毫升95%乙醇?；靹颍^察沉淀的生 成。(5) 乙醇引起的變性與沉淀取3支試管，編號。依下表順序加入試劑：5滋朋梢超片氫氧代諭當(dāng)升95% 乙 8#pHi. 7 «沖1111'211131t . - 振搖混勻后，觀察各管