表沒食子兒茶素沒食子酸酯減輕大鼠血管平滑肌細胞鈣化的實驗研究

1、表沒食子兒茶素沒食子酸酯減輕大鼠血管平滑肌細胞鈣化的實驗研究 作者：徐華, 納春祥, 李桂忠, 曹軍【摘要】 目的觀察表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechingallate, EGCG)對大鼠血管平滑肌細胞鈣化的影響。方法 制備-甘油磷酸鹽誘導血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)鈣化模型。實驗分為4組：對照組、鈣化組、單純EGCG組及EGCG 干預組(又分為10-7、10-6、10-5和10-4 mol·L-1的EGCG 4個亞組)。Von Kossa染色觀察細胞鈣化情況，生化試劑盒比色法測定鈣含量及堿性磷酸酶(a

2、lkaline phosphatase, ALP)活性。結(jié)果 VSMCs鈣化組Von Kossa染色見平滑肌細胞內(nèi)和細胞間基質(zhì)有大量黑色顆粒聚集;與對照組比較，鈣化組VSMCs鈣含量、ALP 活性均有明顯增加;10-710-4mol·L-1 EGCG干預組VSMCs鈣含量、ALP 活性呈劑量依賴性有顯著降低。結(jié)論 EGCG具有抑制VSMCs鈣化的作用。 【關鍵詞】 表沒食子兒茶素沒食子酸酯;血管鈣化綠茶及其主要提取物表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechingallate, EGCG)可延緩動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展，降低動脈粥樣硬化的危險 1-2，且能夠抑制由血管緊張

3、素(angiotensin II, Ang )誘導的c-Jun mRNA的表達，使c-Jun氨基端激酶(JNK)的激活受阻，從而抑制由Ang刺激產(chǎn)生的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)肥大，防治心血管疾病(高血壓、動脈粥樣硬化和血管成形術(shù)后再狹窄等)3。本研究組已證實4，綠茶可明顯減輕大鼠血管鈣化模型的鈣化程度，且綠茶抑制鈣化的效應可能部分與干預血漿和血管組織的Ang系統(tǒng)有關。但綠茶主要提取物EGCG與血管鈣化之間的關系迄今未見報道。本研究擬在制備大鼠血管平滑肌細胞鈣化的模型上，觀察EGCG對血管鈣化的影響，以探討EGCG對血管鈣化的作用。

4、1 材料與方法1.1 材料雄性Sprague-Dawley大鼠150180g，由寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心提供。-甘油磷酸鈉、DMEM、胰蛋白酶及EGCG購自Sigma公司;胎牛血清購自武漢三利生物制品廠;堿性磷酸酶、鈣測試盒購自南京建成生物技術(shù)有限公司;其余試劑均為市售分析純。1.2 原代大鼠血管平滑肌細胞培養(yǎng)1.2.1 取材及培養(yǎng)材料的制備 取大鼠，胸腹部備皮，環(huán)枕關節(jié)脫臼后，消毒、開胸，暴露并分離主動脈至腹主動脈腎動脈分支處。將分離出的動脈，置入預先加有培養(yǎng)液的無菌培養(yǎng)皿中，清洗，剝除外膜的纖維脂肪層。縱向剖開血管，內(nèi)膜面向上，用刀片刮內(nèi)膜12次。小心撕下近內(nèi)膜面的中膜層，浸泡在含10%胎

5、牛血清的DMEM培養(yǎng)液內(nèi)，將血管條剪成1 mm×1 mm的小塊。1.2.2 原代血管平滑肌細胞接種與培養(yǎng) 用吸管將小塊組織吸出注入培養(yǎng)瓶中，在瓶底壁上擺置均勻，以小塊間距離0.5 cm為宜，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，瓶底朝上(注意勿使組織塊流開)，加入培養(yǎng)液，37，5% CO2培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后慢慢翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，令液體緩緩覆蓋組織小塊，注意勿使組織小塊從瓶壁上沖掉，再繼續(xù)培養(yǎng)約5d，可見平滑肌細胞從組織塊的斷面中長出，待接近長滿瓶底85%時即可傳代。1.3 大鼠血管平滑肌細胞鈣化模型的制備及實驗分組 參照文獻5組織塊貼壁法培養(yǎng)大鼠VSMCs，培養(yǎng)液為含15%(v/v)胎牛血清的DMEM，細胞呈梭

6、形及典型的“峰谷”狀生長，成“峰”部位細胞密集多層生長，而成“谷”部位細胞密度相對較少，-actin免疫組化染色陽性證實培養(yǎng)的細胞為VSMCs。實驗用58代細胞，將細胞按1×105個·孔-1接種于24孔培養(yǎng)板，每組6孔，分為：對照組(CON)：單純DMEM培養(yǎng)基(含15%FBS，下同)培養(yǎng);鈣化組(VDN)：培養(yǎng)基中加入10-3 mol·L-1的-甘油磷酸鹽;EGCG組：培養(yǎng)基含10-4 mol·L-1的EGCG;鈣化+EGCG組(VDN+EGCG)：在鈣化培養(yǎng)液中分別加入10-7、10-6、10-5和10-4 mol·L-1的EGCG，共分四

7、個亞組。每2天換液1次，10d后收集細胞做下述測定。1.4 血管平滑肌細胞Von Kossa染色5參照文獻5的方法制作細胞爬片，孵育結(jié)束后將培養(yǎng)的細胞放入4，4%的多聚甲醛溶液中固定45 min，蒸餾水清洗后將玻片放入5%的硝酸銀溶液中，在紫外燈下照射30 min，經(jīng)2.5%的硫代硫酸鈉溶液定影處理5 min后，堿性品紅返染，脫水、透明、封片，于光鏡下觀察。1.5 血管平滑肌細胞總鈣含量6和堿性磷酸酶(ALP)活性測定細胞培養(yǎng)結(jié)束后用冷的PBS洗3次，用刮刀把細胞刮入200 L 的溶解緩沖液(0.2%NP-40溶于10-3 mol·L-1 MgCl2)中，使用超聲波破碎(功率40 W

8、)，樣品試管置入冰水中，破碎10s，暫停10s，共6次，破碎效果用顯微鏡證實，然后離心(4，3500 r·min-1，10 min)，取上清液。用生化試劑盒比色法進行細胞鈣含量及ALP活性測定。1.6 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示(±s)，兩樣本均數(shù)間比較采用t檢驗，多樣本均數(shù)間比較采用One-way ANOVA檢驗，組間的兩兩比較采用Student-Newman- Keuls(SNK)方法檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2 結(jié)果2.1 血管平滑肌細胞Von Kossa染色正常大鼠VSMCs呈梭形，貼壁正常，無鈣沉積現(xiàn)象(圖1A，見封3)

9、。-甘油磷酸鹽誘導的鈣化VSMCs生長911d后，細胞聚集呈菊花狀的結(jié)節(jié)，胞內(nèi)及細胞間質(zhì)可見大量鈣沉積(黑色顆粒沉積)，部分聚集成團并形成鈣結(jié)節(jié)(圖1B，見封3);而經(jīng)不同濃度的EGCG處理后的鈣化VSMCs鈣沉積明顯減少(圖1CF，見封3)。2.2 血管平滑肌細胞鈣含量的變化與對照組比較，-甘油磷酸鹽誘導的VSMCs鈣化組，其細胞總鈣含量高1.81倍(P<0.01)。與-甘油磷酸鹽鈣化組相比，EGCG 10-6、10-5和10-4 mol·L-1與-甘油磷酸鹽共同孵育減少其誘導的細胞鈣含量，分別低15.59%、37.45%和43.72%(均P<0.01)

10、，其相關分析見圖2。2.3 血管平滑肌細胞堿性磷酸酶的變化VSMCs鈣化組ALP活性較對照組高3.08倍(P<0.01)，見表1。EGCG(10-7、10-6、10-5和10-4mol·L-1)呈濃度依賴性降低-甘油磷酸鹽誘導的鈣化VSMCs 的ALP活性，與鈣化組比較，分別低10.59%(P<0.05)、25.32%、31.65%和45.94%(均P<0.01)，其相關分析見圖3。表1 VSMCs鈣含量、ALP活性變化(±s，n=6)3 討論本實驗用-甘油磷酸鈉誘導大鼠VSMCs鈣化5，引起大鼠VSMCs總鈣含量增加，ALP活性增

11、強，Von Kossa染色可見VSMCs內(nèi)有大量鈣沉積及鈣結(jié)節(jié)形成等典型血管鈣化表現(xiàn)，與文獻報道一致6，表明VSMCs鈣化模型建立成功。在離體培養(yǎng)的-甘油磷酸鹽誘導的VSMCs鈣化模型上，用綠茶的主要提取物EGCG進行干預，呈濃度依賴性降低VSMCs的ALP活性，減輕細胞鈣超負荷;本實驗條件下，隨培養(yǎng)用EGCG濃度的增加，VSMCs鈣化程度逐漸減輕。以上結(jié)果提示EGCG具有抑制VSMCs鈣化的作用。研究已證實，綠茶干預血管鈣化的效應與下調(diào)血漿和血管組織的Ang有關4，而EGCG抑制血管鈣化效應是否與Ang下調(diào)有關，及與其他鈣化調(diào)節(jié)因子如腫瘤壞死因子、尾加壓素等的關系值得進一步研究?！緟⒖嘉墨I】

12、 1 Janle EM, Portocarrero C, Zhu Y, et al. Effect of Long-Term Oral Administration of Green Tea Extract on Weight Gain and Glucose Tolerance in Zucker Diabetic (ZDF) RatsJ. J Herb Pharmacother, 2005, 5(3): 55-65.2 Bursill CA, Roach PD. Modulation of cholesterol metabolism by the green tea polyphenol

13、 (-)-epigallocatechin gallate in cultured human liver (HepG2) cellsJ. J Agric Food Chem, 2006, 54(5): 1621.3 Zheng Y, Song HJ, Kim CH, et al. Inhibitory effect of epigallocatechin 3-O-gallate on vascular smooth muscle cell hypertrophy induced by angiotensin IIJ. J Cardiovasc Pharmacol,2004, 43(2): 200.4 徐華, 萬定, 楊曉明，等. 綠茶對實驗大鼠血管鈣化的影響J. 寧夏醫(yī)學院學報,2008, 30(4): 424-426.5 Tintut Y, Parhami F, Bostrom K, et al. cAMP stimulates osteoblast-like differentiation of calcifying vascular cells. Potential signaling pathway for vas