菌體濃度對(duì)發(fā)酵的影響

1、一、菌體濃度對(duì)發(fā)酵的影響及控制菌體（細(xì)胞）濃度(cellconcentration)是指單位體積培養(yǎng)液中菌體的含量。無論在科學(xué)研究上，還是在工業(yè)發(fā)酵控制上，它都是一個(gè)重要的參數(shù)。菌濃的大小，在一定條件下，不僅反映菌體細(xì)胞的多少，而且反映菌體細(xì)胞生理特性不完全相同的分化階段。在發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究中，需要利用菌濃參數(shù)來算出菌體的比生長速率和產(chǎn)物的比生成速率等有關(guān)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，以研究它們之間的相互關(guān)系，探明其動(dòng)力學(xué)規(guī)律，所以菌濃仍是一個(gè)基本參數(shù)。菌濃的大小與菌體生長速率有密切關(guān)系。比生長速率大的菌體，菌濃增長也迅速，反之就緩慢。而菌體的生長速率與微生物的種類和自身的遺傳特性有關(guān)，不同種類的微生物的生長速率

2、是不一樣的。它的大小取決于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和生長機(jī)制，細(xì)胞結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，分裂所需的時(shí)間就越長。典型的細(xì)菌、酵母、霉菌和原生動(dòng)物的倍增時(shí)間分別為45min、90min、3h和6h左右，這說明各類微生物增殖速率的差異。菌體的增長還與營養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境條件有密切關(guān)系。營養(yǎng)物質(zhì)包括各種碳源和氮源等成分和它們的濃度。按照Monod方程式來看，生長速率取決于基質(zhì)的濃度(各種碳源的基質(zhì)飽和系數(shù)Ks在110mgL之間)，當(dāng)基質(zhì)濃度c(S)>10Ks時(shí)，比生長速率就接近最大值。所以營養(yǎng)物質(zhì)均存在一個(gè)上限濃度，在此限度以內(nèi)，菌體比生長速率則隨基質(zhì)濃度增加而增加，但超過此上限，基質(zhì)濃度繼續(xù)增加，反而會(huì)引起生長速率下

3、降。這種效應(yīng)通常稱為基質(zhì)抑制作用。這可能是由于高濃度基質(zhì)形成高滲透壓，引起細(xì)胞脫水而抑制生長。這種作用還包括某些化合物(如甲醇、苯酚等)對(duì)一些關(guān)鍵酶的抑制，或使細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分發(fā)生變化。一些營養(yǎng)物質(zhì)的上限濃度(gL)如下：葡萄糖100、NH4+5、PO43-10。在實(shí)際生產(chǎn)中，常用豐富培養(yǎng)基，促使菌體迅速繁殖，菌濃增大，引起溶氧下降。所以，在微生物發(fā)酵的研究和控制中，營養(yǎng)條件(含溶氧)的控制至關(guān)重要。影響菌體生長的環(huán)境條件有溫度、pH值、滲透壓和水分活度等因素。菌濃的大小，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的得率有著重要的影響。在適當(dāng)?shù)谋壬L速率下，發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率與菌濃成正比關(guān)系，即P=QPmc(X)式中P發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率

4、(產(chǎn)物最大生成速率或生產(chǎn)率)，g(L·h)；QPm產(chǎn)物最大比生成速率，h-1；c(X)菌體濃度，gL。菌濃愈大，產(chǎn)物的產(chǎn)量也愈大，如氨基酸、維生素這類初級(jí)代謝產(chǎn)物的發(fā)酵就是如此。而對(duì)抗生素這類次級(jí)代謝產(chǎn)物來說，控制菌體的比生長速率比臨略高一點(diǎn)的水平，達(dá)到最適菌濃即c(X)臨，菌體的生產(chǎn)率最高。但是菌濃過高，則會(huì)產(chǎn)生其他的影響，營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，培養(yǎng)液的營養(yǎng)成分發(fā)生明顯的改變，有毒物質(zhì)的積累，就可能改變菌體的代謝途徑，特別是對(duì)培養(yǎng)液中的溶氧，影響尤為明顯。菌濃增加而引起的溶氧下降，會(huì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生各種影響。早期酵母發(fā)酵，會(huì)出現(xiàn)代謝途徑改變、酵母生長停滯、產(chǎn)生乙醇的現(xiàn)象；抗生素發(fā)酵中，也受溶

5、氧限制，使產(chǎn)量降低。如圖7-7，為了獲得最高的生產(chǎn)率，需要采用攝氧速率OUR與傳氧速率OTR相平衡時(shí)的菌體濃度，也就是傳氧速率隨菌濃變化的曲線和攝氧速率隨菌濃變化的曲線的交點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的菌體濃度，即臨界菌體濃度c(X)臨。菌體超過此濃度，抗生素的比生成速率和體積產(chǎn)率都會(huì)迅速下降。圖7-7攝氧速率OUR曲線與傳氧速率OTR曲線關(guān)系示意圖發(fā)酵過程中除要有合適的菌濃外，還需要設(shè)法控制菌濃在合適的范圍內(nèi)。菌體的生長速率，在一定的培養(yǎng)條件下，主要受營養(yǎng)基質(zhì)濃度的影響，所以要依靠調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的濃度來控制菌濃。首先要確定基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方中有適當(dāng)?shù)呐浔?，避免產(chǎn)生過濃(或過稀)的菌體量。然后通過中間補(bǔ)料來控制，如當(dāng)菌體

6、生長緩慢、菌濃太稀時(shí)，則可補(bǔ)加一部分磷酸鹽，促進(jìn)生長，提高菌濃；但補(bǔ)加過多，則會(huì)使菌體過分生長，超過c(X)臨，對(duì)產(chǎn)物合成產(chǎn)生抑制作用。在生產(chǎn)上，還可利用菌體代謝產(chǎn)生的CO2量來控制生產(chǎn)過程的補(bǔ)糖量，以控制菌體的生長和濃度。總之，可根據(jù)不同的菌種和產(chǎn)品，采用不同的方法來達(dá)到最適的菌濃。 基質(zhì)對(duì)發(fā)酵影響及其控制基質(zhì)即培養(yǎng)微生物的營養(yǎng)物質(zhì)。對(duì)于發(fā)酵控制來說，基質(zhì)是生產(chǎn)菌代謝的物質(zhì)基礎(chǔ)，既涉及菌體的生長繁殖，又涉及代謝產(chǎn)物的形成。因此基質(zhì)的種類和濃度與發(fā)酵代謝有著密切的關(guān)系。所以選擇適當(dāng)?shù)幕|(zhì)和控制適當(dāng)?shù)臐舛?，是提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的重要方法。據(jù)Monod方程，在分批發(fā)酵中菌體比生長速度是基質(zhì)濃度的函數(shù)

7、。在c(S)<<Ks的情況下，菌體比生長速率與基質(zhì)濃度呈線性關(guān)系。在正常的情況下，可達(dá)到菌體最大比生長速率，然而，由于代謝產(chǎn)物及其基質(zhì)過濃，而導(dǎo)致抑制作用，出現(xiàn)菌體比生長速率下降的趨勢。當(dāng)葡萄糖濃度低于100150gL，不出現(xiàn)抑制作用；當(dāng)葡萄糖濃度高于350500gL，多數(shù)微生物不能生長，細(xì)胞出現(xiàn)脫水現(xiàn)象。就產(chǎn)物的形成來說，培養(yǎng)基過于豐富，有時(shí)會(huì)使菌體生長過旺，黏度增大，傳質(zhì)差，菌體不得不花費(fèi)較多的能量來維持其生存環(huán)境，即用于非生產(chǎn)的能量大量增加。所以，在分批發(fā)酵中，控制合適的基質(zhì)濃度不但對(duì)菌體的生長有利，對(duì)產(chǎn)物的形成也有益處。這里要著重說明碳源、氮源和無機(jī)鹽等對(duì)發(fā)酵的影響及其控制

8、。碳源對(duì)發(fā)酵的影響及其控制碳源，按菌體利用快慢而言，分為迅速利用的碳源和緩慢利用的碳源。前者(如葡萄糖)能較迅速地參與代謝、合成菌體和產(chǎn)生能量，并產(chǎn)生分解代謝產(chǎn)物(如丙酮酸等)，因此有利于菌體生長，但有的分解代謝產(chǎn)物對(duì)產(chǎn)物的合成可能產(chǎn)生阻遏作用；后者多數(shù)為聚合物(也有例外)，為菌體緩慢利用，有利于延長代謝產(chǎn)物的合成，特別有利于延長抗生素的生產(chǎn)期，也為許多微生物藥物的發(fā)酵所采用。例如，乳糖、蔗糖、麥芽糖、玉米油及半乳糖分別是青霉素、頭孢菌素C、鹽霉素、核黃素及生物堿發(fā)酵的最適碳源。因此選擇最適碳源對(duì)提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量是很重要的。在青霉素的早期研究中，就認(rèn)識(shí)到了碳源的重要性。在迅速利用的葡萄糖培養(yǎng)基

9、中，菌體生長良好，但青霉素合成量很少；相反，在緩慢利用的乳糖培養(yǎng)基中，青霉素的產(chǎn)量明顯增加。糖對(duì)青霉素生物合成的影響見圖7-8。由圖可見，糖的緩慢利用是青霉素合成的關(guān)鍵因素。所以緩慢滴加葡萄糖以代替乳糖，仍然可以得到良好的結(jié)果。這就說明乳糖之所以是青霉素發(fā)酵的良好碳源，并不是它起著前體作用，只是它被緩慢利用的速度恰好適合青霉素合成的要求，其他抗生素發(fā)酵也有類似情況。在初級(jí)代謝中也有類似情況，如葡萄糖完全阻遏嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)生胞外生物素(屬同效維生素，vitamer，化學(xué)構(gòu)造及生理作用與天然維生素相類似的化合物)的合成。因此，控制使用能產(chǎn)生阻遏作用的迅速利用的碳源是非常重要的。在工業(yè)上，發(fā)酵培

10、養(yǎng)基中常采用含迅速利用和緩慢利用的混合碳源，就是根據(jù)這個(gè)原理來控制菌體的生長和產(chǎn)物的合成。圖7-8糖對(duì)青霉素生物合成的影響試驗(yàn) 碳源的濃度也有明顯的影響。由于營養(yǎng)過于豐富所引起的菌體異常繁殖，對(duì)菌體的代謝、產(chǎn)物的合成及氧的傳遞都會(huì)產(chǎn)生不良的影響。若產(chǎn)生阻遏作用的迅速利用的碳源用量過大，則產(chǎn)物的合成會(huì)受到明顯的抑制；反之，僅僅供給維持量的碳源，菌體生長和產(chǎn)物合成就都停止。所以控制合適的碳源濃度是非常重要的。如在產(chǎn)黃青霉Wis54-1255發(fā)酵中，給以維持量的葡萄糖其比消耗速率0.022g(g·h)，菌的比生長速率和青霉素的比生成速率都為零，所以必須供給適量的葡萄糖，方能維持青霉素的合成

11、速率。因此，控制適當(dāng)?shù)奶荚礉舛龋瑢?duì)工業(yè)發(fā)酵是很重要的?？刂铺荚吹臐舛?，可采用經(jīng)驗(yàn)法和動(dòng)力學(xué)法，即在發(fā)酵過程中采用中間補(bǔ)料的方法來控制。這要根據(jù)不同代謝類型來確定補(bǔ)糖時(shí)間、補(bǔ)糖量和補(bǔ)糖方式。動(dòng)力學(xué)方法是要根據(jù)菌體的比生長速率、糖比消耗速率及產(chǎn)物的比生成速率等動(dòng)力學(xué)參數(shù)來控制。氮源對(duì)發(fā)酵的影響及其控制氮源有無機(jī)氮源和有機(jī)氮源兩類。它們對(duì)菌體代謝都能產(chǎn)生明顯的影響，不同的種類和不同的濃度都能影響產(chǎn)物合成的方向和產(chǎn)量。如谷氨酸發(fā)酵，當(dāng)NH4+供應(yīng)不足時(shí)，就促使形成-酮戊二酸；過量的NH4+，反而促使谷氨酸轉(zhuǎn)變成谷氨酰胺。控制適量的NH4+濃度，才能使谷氨酸產(chǎn)量達(dá)到最大。又如在研究螺旋霉素的生物合成中，

12、發(fā)現(xiàn)無機(jī)銨鹽不利于螺旋霉素的合成，而有機(jī)氮源(如魚粉)則有利于其形成。氮源像碳源一樣，也有迅速利用的氮源和緩慢利用的氮源。前者如氨基(或銨)態(tài)氮的氨基酸(或硫酸銨等)和玉米漿等；后者如黃豆餅粉、花生餅粉、棉子餅粉等蛋白質(zhì)。它們各有自己的作用，快速利用的氮源容易被菌體所利用，促進(jìn)菌體生長，但對(duì)某些代謝產(chǎn)物的合成，特別是某些抗生素的合成產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，影響產(chǎn)量。如鏈霉菌的竹桃霉素發(fā)酵中，采用促進(jìn)菌體生長的銨鹽濃度，能刺激菌絲生長，但抗生素產(chǎn)量下降。銨鹽還對(duì)柱晶白霉素、螺旋霉素、泰洛星等的合成產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。緩慢利用的氮源對(duì)延長次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)期、提高產(chǎn)物的產(chǎn)量是有好處的。但一次投入全量，也容易促進(jìn)菌

13、體生長和養(yǎng)分過早耗盡，以致菌體過早衰老而自溶，從而縮短產(chǎn)物的生產(chǎn)期。綜上所述，對(duì)微生物發(fā)酵來說，也要選擇適當(dāng)?shù)牡春蜐舛?。發(fā)酵培養(yǎng)基一般是選用含有快速利用和慢速利用的混合氮源。如氨基酸發(fā)酵用銨鹽(硫酸銨或醋酸銨)和麩皮水解液、玉米漿；鏈霉素發(fā)酵采用硫酸銨和黃豆餅粉。但也有使用單一的銨鹽或有機(jī)氮源(如黃豆餅粉)。它們被利用的情況與快速利用和慢速利用的碳源情況相似。為了調(diào)節(jié)菌體生長和防止菌體衰老自溶，除了基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源外，還要在發(fā)酵過程中補(bǔ)加氮源來控制其濃度。生產(chǎn)上采用的方法有如下幾種。補(bǔ)加有機(jī)氮源根據(jù)產(chǎn)生菌的代謝情況，可在發(fā)酵過程中添加某些具有調(diào)節(jié)生長代謝作用的有機(jī)氮源，如酵母粉、玉米漿、尿

14、素等。如土霉素發(fā)酵中，補(bǔ)加酵母粉，可提高發(fā)酵單位；青霉素發(fā)酵中，后期出現(xiàn)糖利用緩慢、菌濃變稀、pH值下降的現(xiàn)象，補(bǔ)加生理堿性物質(zhì)的尿素就可改善這種狀況并提高發(fā)酵單位；氨基酸發(fā)酵中，也可補(bǔ)加作為氮源和pH值調(diào)節(jié)劑的尿素。補(bǔ)加無機(jī)氮源補(bǔ)加氨水或硫酸銨是工業(yè)上的常用方法。氨水既可作為無機(jī)氮源，又可調(diào)節(jié)pH值。在抗生素發(fā)酵工業(yè)中，通氨是提高發(fā)酵產(chǎn)量的有效措施，如與其他條件相配合，有的抗生素的發(fā)酵單位可提高50左右。但當(dāng)pH值偏高而又需補(bǔ)氮時(shí)，就可補(bǔ)加生理酸性物質(zhì)的硫酸銨，以達(dá)到提高氮含量和調(diào)節(jié)pH值的雙重目的。還可補(bǔ)充其他無機(jī)氮源，但需根據(jù)發(fā)酵控制的要求來選擇。磷酸鹽對(duì)發(fā)酵的影響及其控制磷是微生物菌體

15、生長繁殖所必需的成分，也是合成代謝產(chǎn)物所必需的。微生物生長良好所允許的磷酸鹽濃度為0.32300mmolL，但對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成良好所允許的最高平均濃度僅為1.0mmolL，提高到10mmolL，就明顯地抑制其合成。相比之下，菌體生長所允許的濃度比次級(jí)代謝產(chǎn)物合成所允許的濃度就大得多，兩者平均相差幾十倍至幾百倍。因此控制磷酸鹽濃度對(duì)微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)酵來說是非常重要的。磷酸鹽濃度調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物合成機(jī)制，對(duì)于初級(jí)代謝產(chǎn)物合成的影響，往往是通過促進(jìn)菌體生長而間接產(chǎn)生的，對(duì)于次級(jí)代謝產(chǎn)物來說，機(jī)制就比較復(fù)雜。磷酸鹽濃度的控制，一般是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中采用適當(dāng)?shù)臐舛取?duì)于初級(jí)代謝來說，要求不如次級(jí)代謝那么

16、嚴(yán)格。對(duì)抗生素發(fā)酵來說，常常是采用生長亞適量(對(duì)菌體生長不是最適合但又不影響生長的量)的磷酸鹽濃度。其最適濃度取決于菌種特性、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基組成和來源等因素，即使同一種抗生素發(fā)酵，不同地區(qū)不同工廠所用的磷酸鹽濃度也不一致，甚至相差很大。因此磷酸鹽的最適濃度，必須結(jié)合當(dāng)?shù)氐木唧w條件和使用的原材料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)確定。培養(yǎng)基中的磷含量，還可能因配制方法和滅菌條件不同，引起含量的變化。據(jù)報(bào)道，利用金霉素鏈霉菌949(S.aureofaciens949)進(jìn)行四環(huán)素發(fā)酵，菌體生長最適的磷濃度為6570gmL，而四環(huán)素合成最適磷濃度為2530gmL。青霉素發(fā)酵，以用0.01的磷酸二氫鉀為好。在發(fā)酵過程中，有時(shí)發(fā)

17、現(xiàn)代謝緩慢的情況，還可補(bǔ)加磷酸鹽。在四環(huán)素發(fā)酵中，間歇、微量添加磷酸二氫鉀，有利于提高四環(huán)素的產(chǎn)量。除上述主要基質(zhì)外，還有其他培養(yǎng)基成分影響發(fā)酵。如Cu2+，在以醋酸為碳源的培養(yǎng)基中，能促進(jìn)谷氨酸產(chǎn)量的提高；Mn2+對(duì)芽孢桿菌合成桿菌肽等次級(jí)代謝產(chǎn)物具有特殊的作用，必須使用其足夠的濃度才能促進(jìn)桿菌肽的合成等。總之，發(fā)酵過程中，控制基質(zhì)的種類及其用量是非常重要的，是發(fā)酵能否成功的關(guān)鍵，必須根據(jù)產(chǎn)生菌的特性和各個(gè)產(chǎn)物合成的要求，進(jìn)行深入細(xì)致的研究，方能取得良好的結(jié)果。第六節(jié)CO2和呼吸商 二氧化碳(CO2)是微生物的代謝產(chǎn)物，同時(shí)，它也是合成產(chǎn)物所需的一種基質(zhì)。對(duì)微生物生長和發(fā)酵具有刺激作用，它是

18、細(xì)胞代謝的可貴指標(biāo)。有人把細(xì)胞量與累積尾氣CO2生成關(guān)聯(lián)，把CO2生成作為一種手段，通過碳質(zhì)量平衡來估算菌體生長速率和細(xì)胞量。溶解在發(fā)酵液中的CO2對(duì)氨基酸、抗生素等微生物發(fā)酵具有抑制和刺激作用，對(duì)許多產(chǎn)物的生產(chǎn)菌亦有影響。一、CO2對(duì)菌體生長和產(chǎn)物形成的影響 CO2對(duì)菌體的生長有直接作用，引起碳水化合物的代謝及微生物的呼吸速率下降。大量實(shí)驗(yàn)表明，CO2對(duì)生產(chǎn)過程具有抑制作用。當(dāng)CO2分壓為0.008MPa時(shí)，青霉素合成速度降低40；發(fā)酵液中溶解CO2濃度為1.6×10-2molL時(shí)，會(huì)嚴(yán)重抑制酵母生長。當(dāng)進(jìn)氣口CO2含量占混合氣體體積的80時(shí)，酵母活力只達(dá)到對(duì)照組的80。一般以1L

19、(L·min)的空氣流量通氣發(fā)酵，發(fā)酵液中溶解CO2只達(dá)到抑制水平的10。當(dāng)微生物生長受到抑制時(shí)，也阻礙了基質(zhì)的異化（或分解代謝）和ATP的生成量，由此而影響產(chǎn)物的合成。在氨基糖苷類抗生素紫蘇霉素(sisomycin)生產(chǎn)中，在300L發(fā)酵罐于空氣進(jìn)口通以1CO2，發(fā)現(xiàn)微生物對(duì)基質(zhì)的代謝極慢，菌絲增長速度降低，紫蘇霉素的產(chǎn)量比對(duì)照組降低33。通入2CO2，紫蘇霉素的產(chǎn)量比對(duì)比照組降低85，CO2的含量超過3，則不產(chǎn)生紫蘇霉素。CO2會(huì)影響產(chǎn)黃青霉菌(penicilliumchrysogenum)的形態(tài)。研究者將產(chǎn)黃青霉菌接種到溶解不同CO2濃度的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)菌絲形態(tài)發(fā)生變化。CO2

20、分壓08時(shí)，菌絲主要是絲狀；CO2分壓1522，則膨脹，粗短的菌絲占優(yōu)勢；CO2為0.008MPa時(shí)，則出現(xiàn)球狀或酵母狀細(xì)胞，致使青霉素合成受阻，其比生成速率降低40左右。CO2對(duì)細(xì)胞作用機(jī)制是怎樣的呢？CO2及HCO3-都會(huì)影響細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，它們分別作用于細(xì)胞膜的不同位點(diǎn)。CO2主要作用在細(xì)胞膜的脂肪核心部位。HCO3-則影響磷脂，親水頭部帶電荷表面及細(xì)胞膜表面的蛋白質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞膜的脂質(zhì)相中CO2濃度達(dá)臨界值時(shí)，使膜的流動(dòng)性及表面電荷密度發(fā)生變化，這將導(dǎo)致許多基質(zhì)的膜運(yùn)輸受阻，影響細(xì)胞膜的運(yùn)輸效率，使細(xì)胞處于“麻醉”狀態(tài)，細(xì)胞生長受到抑制，形態(tài)發(fā)生改變。CO2對(duì)發(fā)酵的影響很難進(jìn)行估算和優(yōu)化，估計(jì)

21、在大規(guī)模發(fā)酵中CO2的作用將成為突出的問題。因發(fā)酵罐中CO2的分壓是液體深度的函數(shù)，10m深的發(fā)酵罐在0.101MPa氣壓下操作，底部CO2分壓是頂部CO2分壓的2倍。為了排除CO2的影響，必須考慮CO2在培養(yǎng)液中的溶解度、溫度及通氣情況。CO2溶解度大，對(duì)菌生長不利。二、CO2的釋放率 分析尾氣中CO2的含量，記錄培養(yǎng)基體積及通氣量的變化，用計(jì)算機(jī)計(jì)算CO2的積累量，與培養(yǎng)基培養(yǎng)菌體的干重比較，得出對(duì)數(shù)期菌體生長速率與CO2釋放率成正比關(guān)系(一般空氣進(jìn)口O2占20.85、CO2占0.03、惰性氣體79.12)。如果連續(xù)測得排氣氧和CO2濃度，可計(jì)算出整個(gè)發(fā)酵過程中CO2的釋放率(Carbon

22、dioxidereleaseratio，簡稱CRR)。式中二氧化碳比釋放率，mmolCO2(g干菌體·h)；c(X)發(fā)酵液中菌體的濃度，g干菌體L。三、呼吸商與發(fā)酵的關(guān)系 發(fā)酵過程中菌的耗氧速率OUR可通過熱磁氧分析儀或質(zhì)譜儀測量進(jìn)氣和排氣中的氧含量計(jì)算而得，并最終計(jì)算出呼吸商RQ。 RQ可以反映菌的代謝情況，酵母發(fā)酵，RQ=1，糖有氧代謝，僅生成菌體，無產(chǎn)物形成；RQ>1.1，糖經(jīng)EMP生成乙醇。不同基質(zhì)，菌的RQ不同。E.coli以延胡索酸為基質(zhì)，RQ=1.44；以丙酮酸為基質(zhì)，RQ=1.26；以琥珀酸為基質(zhì)，RQ=1.12；以乳酸、葡萄糖為基質(zhì)，RQ分別為1.02和1.0

23、0。在抗生素發(fā)酵中，由于存在菌體生長、維持及產(chǎn)物形成的不同階段，其RQ值也不一樣。青霉素發(fā)酵的理論呼吸商：菌體生長0.909，菌體維持1，青霉素合成4。從上述情況看，發(fā)酵早期，主要是菌生長，RQ<1；過渡期菌體維持其生命活動(dòng)，產(chǎn)物逐漸形成，基質(zhì)葡萄糖的代謝不僅僅用于菌體生長，RQ比生長期略有增加。產(chǎn)物形成對(duì)RQ的影響較為明顯，如產(chǎn)物還原性比基質(zhì)大，RQ增加；產(chǎn)物氧化性比基質(zhì)大，RQ就減少。其偏離程度決定于每單位菌體利用基質(zhì)所形成的產(chǎn)物量。實(shí)際生產(chǎn)中測定的RQ值明顯低于理論值，說明發(fā)酵過程中存在著不完全氧化的中間代謝物和除葡萄糖以外的其他碳源。如發(fā)酵過程中加入消泡劑，由于它具有不飽和性和還

24、原性，使RQ值低于葡萄糖為惟一碳源時(shí)RQ值。如試驗(yàn)結(jié)果表明，青霉素發(fā)酵中，RQ為0.50.7之間，且隨葡萄糖與消泡劑加入量之比而波動(dòng)。RQ是碳-能源代謝情況的指示值。在碳-能源限制及供氧充分的情況下，碳-能源趨向于完全氧化，RQ應(yīng)達(dá)到完全氧化的理論值，見表7-1。如果碳-能源過量及供氧不足，可能出現(xiàn)碳-能源不完全氧化的情況，從而造成RQ異常。表7-1一些碳-能源基質(zhì)的理論呼吸商四、CO2濃度的控制 CO2在發(fā)酵液中的濃度變化不像溶氧那樣，沒有一定的規(guī)律。它的大小受到許多因素的影響，如菌體的呼吸強(qiáng)度、發(fā)酵液流變學(xué)特性、通氣攪拌程度和外界壓力大小等因素。設(shè)備規(guī)模大小也有影響，由于CO2的溶解度隨壓

25、力增加而增大，大發(fā)酵罐中的發(fā)酵液的靜壓可達(dá)0.1MPa以上，又處在正壓發(fā)酵，致使罐底部壓強(qiáng)可達(dá)0.15MPa。因此CO2濃度增大，如不提高攪拌轉(zhuǎn)數(shù)，CO2就不易排出，在罐底形成碳酸，進(jìn)而影響菌體的呼吸和產(chǎn)物的合成。為了控制CO2的不良影響，必須考慮CO2在培養(yǎng)液中的溶解度、溫度和通氣情況。在發(fā)酵過程中，如遇到泡沫上升而引起“逃液”時(shí)，采用增加罐壓的方法來消泡。但這樣會(huì)增加CO2的溶解度，對(duì)菌體生長是不利的。CO2濃度的控制應(yīng)隨它對(duì)發(fā)酵的影響而定。如果CO2對(duì)產(chǎn)物合成有抑制作用，則應(yīng)設(shè)法降低其濃度；若有促進(jìn)作用，則應(yīng)提高其濃度。通氣和攪拌速率的大小，不但能調(diào)節(jié)發(fā)酵液中的溶解氧，還能調(diào)節(jié)CO2的溶

26、解度，在發(fā)酵罐中不斷通入空氣，既可保持溶氧在臨界點(diǎn)以上，又可隨廢氣排出所產(chǎn)生的CO2，使之低于能產(chǎn)生抑制作用的濃度。因而通氣攪拌也是控制CO2濃度的一種方法，降低通氣量和攪拌速率，有利于增加CO2在發(fā)酵液中的濃度；反之就會(huì)減小CO2濃度。在3m3發(fā)酵罐中進(jìn)行四環(huán)素發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵40h以前，通氣量減小到75m3h，攪拌為80rmin，以此來提高CO2的濃度；40h以后，通氣量和攪拌分別提高到110m3h和140rmin，以降低CO2濃度，使四環(huán)素產(chǎn)量提高2530。CO2形成的碳酸，還可用堿來中和，但不能用CaCO3。罐壓的調(diào)節(jié)，也影響CO2的濃度，對(duì)菌體代謝和其他參數(shù)也產(chǎn)生影響。CO2的產(chǎn)生與補(bǔ)

27、料工藝控制密切相關(guān)，如在青霉素發(fā)酵中，補(bǔ)糖會(huì)增加CO2的濃度和降低培養(yǎng)液的pH值。因?yàn)檠a(bǔ)加的糖用于菌體生長、菌體維持和青霉素合成三方面，它們都產(chǎn)生CO2，使CO2量增加。溶解的CO2和代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸，又使培養(yǎng)液pH值下降。因此，補(bǔ)糖、CO2、pH值三者具有相關(guān)性，被用于青霉素補(bǔ)料工藝的控制參數(shù)，其中排氣中的CO2量的變化比pH值變化更為敏感，所以，采用測定CRR作為控制補(bǔ)糖速率參數(shù)。第七節(jié)補(bǔ)料的控制 補(bǔ)料分批發(fā)酵(fed-batchculture，簡稱FBC)，又稱半連續(xù)培養(yǎng)或半連續(xù)發(fā)酵，是指在分批發(fā)酵過程中，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加一種或多種成分的新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法，是分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵之間的一

28、種過渡培養(yǎng)方式，是一種控制發(fā)酵的好方法，現(xiàn)已廣泛用于發(fā)酵工業(yè)。同傳統(tǒng)的分批發(fā)酵相比，F(xiàn)BC具有以下的優(yōu)點(diǎn)：可以解除底物抑制、產(chǎn)物反饋抑制和分解代謝物的阻遏；可以避免在分批發(fā)酵中因一次投料過多造成細(xì)胞大量生長所引起的一切影響，改善發(fā)酵液流變學(xué)的性質(zhì)；可用作為控制細(xì)胞質(zhì)量的手段，以提高發(fā)芽孢子的比例；可作為理論研究的手段，為自動(dòng)控制和最優(yōu)控制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。同連續(xù)發(fā)酵相比，F(xiàn)BC不需要嚴(yán)格的無菌條件，產(chǎn)生菌也不會(huì)產(chǎn)生老化和變異等問題，適用范圍也比連續(xù)發(fā)酵廣泛。由于FBC有這些優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛地用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)和研究中。如已應(yīng)用于酶類、抗生素類、激素藥物類、氨基酸和維生素等十余類幾十種工業(yè)產(chǎn)品中。一

29、、FBC的作用 FBC的操作比較簡單，效果也是比較明顯的。但是這種控制方法是建立在什么理論基礎(chǔ)上，對(duì)微生物的生理和產(chǎn)物的合成又能產(chǎn)生什么作用，我們應(yīng)該有個(gè)基本了解。已有研究結(jié)果表明，F(xiàn)BC對(duì)微生物發(fā)酵有下列幾個(gè)基本作用?？梢钥刂埔种菩缘孜锏臐舛仍谠S多發(fā)酵過程中，微生物的生長是受到基質(zhì)濃度的影響。要想得到高密度的生物量，需要投入幾倍的基質(zhì)。按monod方程，當(dāng)營養(yǎng)底物濃度增加到一定量時(shí)，生長就顯示飽和型動(dòng)力學(xué)，再增加底物濃度，就可能產(chǎn)生一種基質(zhì)抑制區(qū)，停滯期延長，菌體比生長速率減小，菌濃下降等。所以高濃度營養(yǎng)物對(duì)大多數(shù)微生物生長是不利的。抑制微生物生長有多種原因：有的基質(zhì)過濃使?jié)B透壓過高，細(xì)胞因

30、脫水而死亡；高濃度基質(zhì)能使微生物細(xì)胞熱致死(themaldeath)，如乙醇濃度達(dá)10時(shí)，就可使酵母細(xì)胞熱致死；有的是因某種或某些基質(zhì)對(duì)代謝關(guān)鍵酶或細(xì)胞組分產(chǎn)生抑制作用，如高濃度苯酚(35)可凝固蛋白；高濃度基質(zhì)還會(huì)改變菌體的生化代謝而影響生長等。在微生物發(fā)酵中，有的基質(zhì)又是合成產(chǎn)物必需的前體物質(zhì)，濃度過高，就會(huì)影響菌體代謝或產(chǎn)生毒性，使產(chǎn)物產(chǎn)量降低。如苯乙酸、丙醇(或丙酸)分別是青霉素、紅霉素的前體物質(zhì)，濃度過大，就會(huì)產(chǎn)生毒性，使抗生素產(chǎn)量減少。有的是受底物溶解度小的限制，達(dá)不到應(yīng)有的濃度而影響轉(zhuǎn)化率。如甾類化合物轉(zhuǎn)化中，因它們的溶解度小，使基質(zhì)的濃度低，造成轉(zhuǎn)化率不高。為了在分批發(fā)酵中，獲

31、得高濃度菌體或產(chǎn)物，必須在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中防止有過高濃度的基質(zhì)或抑制性底物，采用FBC方式，就可以控制適當(dāng)?shù)幕|(zhì)濃度，解除其抑制作用，又可得到高濃度的產(chǎn)物。 可以解除或減弱分解代謝物的阻遏在微生物合成初級(jí)或次級(jí)代謝產(chǎn)物中，有些合成酶受到迅速利用的碳源或氮源的阻遏，特別是葡萄糖，它能夠阻抑多種酶或產(chǎn)物的合成，如纖維素酶、赤霉素、青霉素等。已知這種阻遏作用不是葡萄糖的直接作用，而是由葡萄糖的分解代謝產(chǎn)物所引起的。通過補(bǔ)料來限制基質(zhì)葡萄糖的濃度，就可解除酶或其產(chǎn)物的阻遏，提高產(chǎn)物產(chǎn)量。如緩慢流加葡萄糖，纖維素酶的產(chǎn)量幾乎增加200倍；將葡萄糖濃度控制在0.02水平，赤霉素濃度可達(dá)905mgL；采用滴加葡

32、萄糖的技術(shù)，可明顯提高青霉素的發(fā)酵單位等。這都是利用發(fā)酵技術(shù)解決分解代謝物阻遏的實(shí)際應(yīng)用。在植物細(xì)胞培養(yǎng)中，也采用該技術(shù)來提高產(chǎn)量?？梢允拱l(fā)酵過程最佳化分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究，闡明了各個(gè)參數(shù)之間的相互關(guān)系。利用FBC技術(shù)，就可以使菌種保持在最大生產(chǎn)力的狀態(tài)。隨著FBC補(bǔ)料方式的不斷改進(jìn)，為發(fā)酵過程的優(yōu)化和反饋控制奠定了基礎(chǔ)。隨著計(jì)算機(jī)、傳感器等的發(fā)展和應(yīng)用，已有可能用離線方式計(jì)算或用模擬復(fù)雜的數(shù)學(xué)模型在線方式實(shí)現(xiàn)最優(yōu)化控制。二、補(bǔ)料的方式及控制 補(bǔ)料方式有很多種情況，有連續(xù)流加、不連續(xù)流加或多周期流加。每次流加又可分為快速流加、恒速流加、指數(shù)速率流加和變速流加。從補(bǔ)加培養(yǎng)基的成分來分，又可分為單

33、組分補(bǔ)料和多組分補(bǔ)料。流加操作控制系統(tǒng)又分為有反饋控制和無反饋控制兩類。這兩類的數(shù)學(xué)模型在理論上沒有什么差別。反饋控制系統(tǒng)是由傳感器、控制器和驅(qū)動(dòng)器三個(gè)單元所組成。根據(jù)控制依據(jù)的指標(biāo)不同，又分為直接方法和間接方法。 間接方法是以溶氧、pH值、呼吸商、排氣中CO2分壓及代謝產(chǎn)物濃度等作為控制參數(shù)。對(duì)間接方法來說，選擇與過程直接相關(guān)的可檢參數(shù)作為控制指標(biāo)，是研究的關(guān)鍵。這就需要詳盡考查分批發(fā)酵的代謝曲線和動(dòng)力學(xué)特性，獲得各個(gè)參數(shù)之間的有意義的相互關(guān)系，來確定控制參數(shù)。對(duì)于通氣發(fā)酵，利用排氣中CO2含量作為FBC反饋控制參數(shù)是較為常用的間接方法。如控制青霉素生產(chǎn)所用的葡萄糖流加的質(zhì)量平衡法，就是利用

34、CO2的反饋控制。它是依靠精確測量CO2的釋放率CRR和葡萄糖的流動(dòng)速度，達(dá)到控制菌體的比生長速率和菌濃。pH值也已用作糖的流加控制的參數(shù)。由于長期缺乏可靠的適時(shí)測定手段，無法控制適時(shí)補(bǔ)料，所以直接法一直沒有用于發(fā)酵控制。目前出現(xiàn)了各種類型生物傳感器，可供底物和產(chǎn)物的在線分析。但其應(yīng)用仍然存在一些問題(如耐熱性差)，尚待解決。隨著一系列技術(shù)障礙的克服，該法將會(huì)得到迅速普及。反饋控制的FBC，常常是依據(jù)個(gè)別指標(biāo)來進(jìn)行，在許多情況下，并不能奏效，尚需進(jìn)行多因子分析。為了改善發(fā)酵培養(yǎng)基的營養(yǎng)條件和去除部分發(fā)酵產(chǎn)物，F(xiàn)BC還可采用“放料和補(bǔ)料”(withdrawandfill)方法，也就是說，發(fā)酵一定

35、時(shí)間，產(chǎn)生了代謝產(chǎn)物后，定時(shí)放出一部分發(fā)酵液(可供提煉)，同時(shí)補(bǔ)充一部分新鮮營養(yǎng)液，并重復(fù)進(jìn)行。這樣就可以維持一定的菌體生長速率，延長發(fā)酵產(chǎn)物生產(chǎn)期，有利于提高產(chǎn)物產(chǎn)量，又可降低成本。所以這也是另一個(gè)提高產(chǎn)量的FBC方法，但要注意染菌等問題。第八節(jié)泡沫對(duì)發(fā)酵的影響及其控制一、泡沫的形成及其對(duì)發(fā)酵的影響 在大多數(shù)微生物發(fā)酵過程中，由于培養(yǎng)基中有蛋白類表面活性劑（具有較高的表面張力）存在，在通氣條件下，培養(yǎng)液中就形成了泡沫。泡沫是氣體被分散在少量液體中的膠體體系，氣液之間被一層液膜隔開，彼此不相連通。形成的泡沫有兩種類型：一種是發(fā)酵液液面上的泡沫，氣相所占的比例特別大，與液體有較明顯的界限，如發(fā)酵

36、前期的泡沫；另一種是發(fā)酵液中的泡沫，又稱流態(tài)泡沫(fluidfoam)，分散在發(fā)酵液中，比較穩(wěn)定，與液體之間無明顯的界限。發(fā)酵過程產(chǎn)生少量的泡沫是正常的。泡沫的多少一方面與發(fā)酵罐攪拌、通風(fēng)有關(guān)；另一方面，與培養(yǎng)基性質(zhì)有關(guān)。蛋白質(zhì)原料如蛋白胨、玉米漿、黃豆粉、酵母粉等是主要的發(fā)泡劑。糊精含量多也引起泡沫的形成。發(fā)酵過程中，泡沫的形成有一定的規(guī)律性。發(fā)酵時(shí)起泡的方式被認(rèn)為有五種：整個(gè)發(fā)酵過程中，泡沫保持恒定的水平；發(fā)酵早期，起泡后穩(wěn)定地下降，以后保持恒定；發(fā)酵前期，泡沫稍微降低后又開始回升；發(fā)酵開始起泡能力低，以后上升；以上類型的綜合方式。這些方式的出現(xiàn)是與基質(zhì)的種類、通氣攪拌強(qiáng)度和滅菌條件等因素

37、有關(guān)，其中基質(zhì)中的有機(jī)氮源(如黃豆餅粉等)是起泡的主要因素。當(dāng)發(fā)酵感染雜菌和噬菌體時(shí)，泡沫異常多。起泡會(huì)帶來許多不利因素，如發(fā)酵罐的裝料系數(shù)減少、液相體積氧傳遞系數(shù)減小等。泡沫過多時(shí)，影響更為嚴(yán)重，造成大量逃液，發(fā)酵液從排氣管路或軸封逃出而增加染菌機(jī)會(huì)等，嚴(yán)重時(shí)通氣攪拌也無法進(jìn)行，菌體呼吸受到阻礙，導(dǎo)致代謝異?；蚓w自溶。所以，控制泡沫乃是保證正常發(fā)酵的基本條件。二、泡沫的消除 泡沫的控制，可以采用三種途徑：調(diào)整培養(yǎng)基中的成分(如少加或緩加易起泡的原材料)或改變某些物理化學(xué)參數(shù)(如pH值、溫度、通氣和攪拌)或者改變發(fā)酵工藝(如采用分次投料)來控制，以減少泡沫形成的機(jī)會(huì)。但這些方法的效果有一定的

38、限度；采用機(jī)械消泡或消泡劑消泡這兩種方法來消除已形成的泡沫；還可以采用菌種選育的方法，篩選不產(chǎn)生流態(tài)泡沫的菌種，來消除起泡的內(nèi)在因素，如用雜交方法選育出不產(chǎn)生流態(tài)泡沫的土霉素生產(chǎn)菌株。對(duì)于已形成的泡沫，工業(yè)上可以采用機(jī)械消泡和化學(xué)消泡劑消泡或兩者同時(shí)使用消泡。機(jī)械消泡這是一種物理消泡的方法，利用機(jī)械強(qiáng)烈振動(dòng)或壓力變化而使泡沫破裂。有罐內(nèi)消泡和罐外消泡兩種方法。前者是靠罐內(nèi)消泡漿轉(zhuǎn)動(dòng)打碎泡沫；后者是將泡沫引到罐外，通過噴嘴的加速作用或利用離心力來消除泡沫。該法的優(yōu)點(diǎn)是：節(jié)省輔料，減少染菌機(jī)會(huì)。但消泡效果不理想，僅可作為消泡的輔助方法。消泡劑消泡這是利用外界加入消泡劑，使泡沫破裂的方法。消泡劑都是

39、表面活性劑，具有較低的表面張力，或者是降低泡沫液膜的機(jī)械強(qiáng)度，或者是降低液膜的表面黏度，或者兼有兩者的作用，達(dá)到破裂泡沫的目的。如聚氧乙烯氧丙烯甘油(GPE)的表面張力僅為3.3×10-2Nm，而青霉素發(fā)酵液的表面張力為(6.06.8)×10-2Nm。作為生物工業(yè)理想的消泡劑，應(yīng)具備下列條件：應(yīng)該在氣-液界面上具有足夠大的鋪展系數(shù)，才能迅速發(fā)揮消泡作用。這就要求消泡劑有一定的親水性；應(yīng)該在低濃度時(shí)具有消泡活性；應(yīng)該具有持久的消泡或抑泡性能，以防止形成新的泡沫；應(yīng)該對(duì)微生物、人類和動(dòng)物無毒性；應(yīng)該對(duì)產(chǎn)物的提取不產(chǎn)生任何影響；不會(huì)在使用、運(yùn)輸中引起任何危害；來源方便，成本低；應(yīng)

40、該對(duì)氧傳遞不產(chǎn)生影響；能耐高溫滅菌。常用的消泡劑主要有天然油脂類，高碳醇、脂肪酸和酯類，聚醚類及硅酮類等4大類。其中以天然油酯類和聚醚類在生物發(fā)酵中最為常用。天然油脂類中有豆油、玉米油、棉籽油、菜籽油和豬油等。此類油不僅用作消泡劑，還可作為碳源和發(fā)酵控制的手段，它們的消泡能力和對(duì)產(chǎn)物合成的影響各不相同。例如：土霉素發(fā)酵，豆油、玉米油較好，而亞麻油則會(huì)產(chǎn)生不良的作用。此類油的質(zhì)量還會(huì)影響消泡效果，碘價(jià)(表示油分子結(jié)構(gòu)中含有不飽和鍵的多少)或酸價(jià)高的油脂，消泡能力差并產(chǎn)生不良的影響。所以，要控制此類油的質(zhì)量，并要進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)檢驗(yàn)。此類油的新鮮程度也有影響，油越新鮮，所含的天然抗氧化劑越多，形成過氧

41、化物的機(jī)會(huì)少，酸價(jià)也低，消泡能力強(qiáng)，副作用也小。植物油與鐵離子接觸能與氧形成過氧化物，對(duì)四環(huán)素、卡那霉素的合成不利，故要注意此類油的貯存保管。聚醚類消泡劑的品種很多。它們是氧化丙烯或氧化丙烯和環(huán)氧乙烷與甘油聚合而成的聚合物。氧化丙烯與甘油聚合而成的，叫聚氧丙烯甘油(簡稱GP型)；氧化丙烯、環(huán)氧乙烷與甘油聚合而成的叫做聚氧乙烯氧丙烯甘油(簡稱GPE型)，又稱泡敵。它們的分子結(jié)構(gòu)式如下： GP的親水性差，在發(fā)泡介質(zhì)中的溶解度小，所以，用于稀薄發(fā)酵液中要比用于黏稠發(fā)酵液中的效果好。其抑泡性能比消泡性能好，適宜用于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以抑制泡沫的產(chǎn)生。如用于鏈霉素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，抑泡效果明顯，可全部代替食用

42、油，也未發(fā)現(xiàn)不良影響，消泡效力一般相當(dāng)于豆油的6080倍。GPE的親水性好，在發(fā)泡介質(zhì)中易鋪展，消泡能力強(qiáng)，作用又快，而溶解度相應(yīng)也大，所以消泡活性維持時(shí)間短，因此，用于黏稠發(fā)酵液的效果比用于稀薄的好。GPE用于四環(huán)類抗生素發(fā)酵中，消泡效果很好，用量為0.030.035，消泡能力一般相當(dāng)于豆油的1020倍。其他的消泡劑，如：聚乙二醇等高碳醇消泡劑多適用于霉菌發(fā)酵，硅酮類較適用于微堿性的細(xì)菌發(fā)酵。所以，應(yīng)結(jié)合具體產(chǎn)品發(fā)酵，試驗(yàn)上述各種消泡劑的消泡效果，以獲得良好的消泡作用。消泡劑多數(shù)是溶解度小、分散性不十分好的高(大)分子化合物，所以在使用時(shí)，要考慮如何降低它的黏度和提高它的分散性，來增強(qiáng)它們的

43、消泡效果。使用的增效方法有：加載體增效，即用惰性載體(如礦物油、植物油等)使消泡劑溶解分散，達(dá)到增效的目的；消泡劑并用增效，取各種消泡劑的優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行互補(bǔ)，達(dá)到增效，如GP和GPE以l:1混合使用于土霉素發(fā)酵，結(jié)果比單獨(dú)使用GP的效力提高2倍；乳化消泡劑增效，用乳化劑(或分散劑)將消泡劑制成乳劑，以提高分散能力，增強(qiáng)消泡效力，一般只適用于親水性差的消泡劑。如用吐溫80制成的乳劑，用于慶大霉素發(fā)酵，效力提高12倍。在生產(chǎn)過程中，消泡的效果除了與消泡劑種類、性質(zhì)、分子量大小、消泡劑親油親水基等密切關(guān)系外，還和消泡劑使用時(shí)加入方法、使用濃度、溫度等有很大的關(guān)系。消泡劑的選擇和實(shí)際使用還有許多問題，應(yīng)結(jié)合

44、生產(chǎn)實(shí)際加以注意和解決。第九節(jié)發(fā)酵終點(diǎn)的判斷 微生物發(fā)酵終點(diǎn)的判斷，對(duì)提高產(chǎn)物的生產(chǎn)能力和經(jīng)濟(jì)效益是很重要的。生產(chǎn)能力（或稱生產(chǎn)率、產(chǎn)率）是指單位時(shí)間內(nèi)單位罐體積發(fā)酵液的產(chǎn)物積累量而言。式中，生產(chǎn)率單位一般為g(L·h)或kg(m3·h)，產(chǎn)物濃度單位為gL或kgm3，發(fā)酵時(shí)間單位為h。 生產(chǎn)過程不能只單純追求高生產(chǎn)率，而不顧及產(chǎn)品的成本，必須把二者結(jié)合起來，既要有高產(chǎn)量，又要降低成本。發(fā)酵過程中的產(chǎn)物形成，有的是隨菌體的生長而生產(chǎn)，如初級(jí)代謝產(chǎn)物氨基酸等；有的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生與菌體生長無明顯的關(guān)系，生長階段不產(chǎn)生產(chǎn)物，直到穩(wěn)定期，才進(jìn)入產(chǎn)物生產(chǎn)期，如抗生素的合成就是如此。但

45、是無論是初級(jí)代謝產(chǎn)物還是次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)酵，到了衰亡期，菌體的產(chǎn)物分泌能力都要下降，產(chǎn)物的生產(chǎn)率相應(yīng)下降或停止。有的產(chǎn)生菌在衰亡期，營養(yǎng)耗盡，菌體衰老而進(jìn)入自溶，釋放出體內(nèi)的分解酶會(huì)破壞已形成的產(chǎn)物。要確定一個(gè)合理的放罐時(shí)間，需要考慮下列幾個(gè)因素：一、經(jīng)濟(jì)因素 發(fā)酵時(shí)間需要考慮經(jīng)濟(jì)因素，也就是，要以最低的成本來獲得最大生產(chǎn)率的時(shí)間為最適發(fā)酵時(shí)間。在實(shí)際生產(chǎn)中，發(fā)酵周期縮短，設(shè)備的利用率提高。但在生產(chǎn)率較小(或停止)的情況下，單位體積發(fā)酵液的產(chǎn)物產(chǎn)量增長就有限，如果繼續(xù)延長時(shí)間，使平均生產(chǎn)率下降，而動(dòng)力消耗、管理費(fèi)用支出、設(shè)備消耗等費(fèi)用仍在增加，因而產(chǎn)物成本增加。所以，需要從經(jīng)濟(jì)學(xué)觀點(diǎn)確定一個(gè)合理

46、時(shí)間。二、產(chǎn)品質(zhì)量因素 發(fā)酵時(shí)間長短對(duì)后續(xù)工藝和產(chǎn)品質(zhì)量有很大的影響。如果發(fā)酵時(shí)間太短，勢必有過多的尚未代謝的營養(yǎng)物質(zhì)(如可溶性蛋白、脂肪等)殘留在發(fā)酵液中。這些物質(zhì)對(duì)下游操作提取、分離等工序都不利。如果發(fā)酵時(shí)間太長，菌體會(huì)自溶，釋放出菌體蛋白或體內(nèi)的酶，又會(huì)顯著改變發(fā)酵液的性質(zhì)，增加過濾工序的難度，這不僅使過濾時(shí)間延長，甚至使一些不穩(wěn)定的產(chǎn)物遭到破壞。所有這些影響，都可能使產(chǎn)物的質(zhì)量下降，產(chǎn)物中雜質(zhì)含量增加，故要考慮發(fā)酵周期長短對(duì)提取工序的影響。三、特殊因素 在個(gè)別特殊發(fā)酵情況下，還要考慮個(gè)別因素。對(duì)老品種的發(fā)酵來說，放罐時(shí)間都已掌握，在正常情況下，可根據(jù)作業(yè)計(jì)劃，按時(shí)放罐。但在異常情況下，

47、如染菌、代謝異常(糖耗緩慢等)，就應(yīng)根據(jù)不同情況，進(jìn)行適當(dāng)處理。為了能夠得到盡量多的產(chǎn)物，應(yīng)該及時(shí)采取措施(如改變溫度或補(bǔ)充營養(yǎng)等)，并適當(dāng)提前或拖后放罐時(shí)間。合理的放罐時(shí)間是由實(shí)驗(yàn)來確定的，即根據(jù)不同的發(fā)酵時(shí)間所得的產(chǎn)物產(chǎn)量計(jì)算出發(fā)酵罐的生產(chǎn)率和產(chǎn)品成本，采用生產(chǎn)率高而成本又低的時(shí)間，作為放罐時(shí)間。不同的發(fā)酵類型，要求達(dá)到的目標(biāo)不同，因而對(duì)發(fā)酵終點(diǎn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)也應(yīng)有所不同。一般對(duì)發(fā)酵和原材料成本占整個(gè)生產(chǎn)成本主要部分的發(fā)酵產(chǎn)品，主要追求提高生產(chǎn)率、得率(kg產(chǎn)物kg基質(zhì))和發(fā)酵系數(shù)kg產(chǎn)物(罐容m3·發(fā)酵周期h)。下游技術(shù)成本占的比重較大、產(chǎn)品價(jià)格較貴，除了高的生產(chǎn)率和發(fā)酵系數(shù)外，還

48、要求高的產(chǎn)物濃度。因此，考慮放罐時(shí)間時(shí)，還應(yīng)考慮總生產(chǎn)率(放罐時(shí)產(chǎn)物濃度除以總發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)間)。這里總發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)間包括發(fā)酵周期和輔助操作時(shí)間，因此要提高總生產(chǎn)率，則有必要縮短發(fā)酵周期，這就是要在產(chǎn)物生成速率較低時(shí)放罐。延長發(fā)酵雖然略能提高產(chǎn)物濃度，但生產(chǎn)率下降，且耗電大，成本提高，每噸冷卻水所得到的產(chǎn)物產(chǎn)量下跌。另外，放罐時(shí)間對(duì)下游工序有很大影響。放罐過早，會(huì)殘留過多的養(yǎng)分(如糖、脂肪、可溶性蛋白)對(duì)提取不利(這些物質(zhì)能增加乳化作用，干擾樹脂的交換)；放罐過晚，菌體自溶，會(huì)延長過濾時(shí)間，還會(huì)使產(chǎn)物產(chǎn)量降低(有些抗生素單位下跌)，擾亂提取作業(yè)計(jì)劃。放罐臨近時(shí)，加糖、補(bǔ)料或消泡劑都要慎重，因殘留物對(duì)

49、提取有影響。補(bǔ)料可根據(jù)糖耗速率計(jì)算到放罐時(shí)允許的殘留量來控制。一般判斷放罐的主要指標(biāo)有：產(chǎn)物濃度、氨基氮濃度、菌體形態(tài)、pH值、培養(yǎng)液的外觀、黏度等確定。染菌罐一般過濾速度較慢。放罐時(shí)間可根據(jù)作業(yè)計(jì)劃進(jìn)行，但在異常發(fā)酵時(shí)，就應(yīng)當(dāng)機(jī)立斷，以免倒罐。新品種發(fā)酵，更需摸索合理的放罐時(shí)間。不同發(fā)酵產(chǎn)品，發(fā)酵終點(diǎn)的判斷指標(biāo)略有出入。總之，發(fā)酵終點(diǎn)的判斷需綜合多方面的因素統(tǒng)籌考慮。第十節(jié)發(fā)酵過程檢測與自控 發(fā)酵過程的基本任務(wù)是要對(duì)菌株所具有的內(nèi)在生產(chǎn)能力實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，從而以較低的能量和物料消耗生產(chǎn)更多的發(fā)酵產(chǎn)品。發(fā)酵動(dòng)力學(xué)為這種表達(dá)提供了部分理論依據(jù)，但要在實(shí)際發(fā)酵過程中實(shí)現(xiàn)，還必須解決一些工程學(xué)方面的問

50、題，即發(fā)酵參數(shù)等的檢測與自控問題。檢測和自控技術(shù)在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用相當(dāng)晚，但這種應(yīng)用一經(jīng)確立，就形成了迅速發(fā)展的勢頭，并且在某種程度上超過了其他產(chǎn)業(yè)。電子計(jì)算機(jī)的使用，為這一發(fā)展注入了巨大的活力，使發(fā)酵工業(yè)面臨一場新的變革。然而，由于發(fā)酵過程的反應(yīng)異常復(fù)雜，描述這一反應(yīng)的數(shù)學(xué)模型尚欠完善，并且由于在線檢測過程關(guān)鍵變量傳感器的缺乏，使自控技術(shù)在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用目前仍受到很大的局限，需要各學(xué)科的專家共同作出進(jìn)一步的努力。發(fā)酵過程檢測是為了取得所給定發(fā)酵過程及其菌株的生理生化特征數(shù)據(jù)，以便對(duì)過程實(shí)施有效的控制。檢測的具體目的包括：了解過程變量的變化是否與預(yù)期的目標(biāo)值相符；決定種子罐移種和發(fā)酵罐放罐的

51、時(shí)間；對(duì)不可測變量進(jìn)行間接估計(jì)；對(duì)過程變量按給定值進(jìn)行手動(dòng)控制或自動(dòng)控制；通過過程模型實(shí)施計(jì)算機(jī)控制；收集認(rèn)識(shí)和發(fā)展過程(包括建立數(shù)學(xué)模型)所必需的數(shù)據(jù)。檢測的方法有物理測量(如溫度、壓力、體積、流量等)，物理化學(xué)測量(pH值、溶O2、溶CO2、氧化還原電位、氣相成分等)，化學(xué)測量(基質(zhì)、前體、產(chǎn)物等的濃度)，以及生物學(xué)和生物化學(xué)測量(生物量、細(xì)胞形態(tài)、酶活性、胞內(nèi)成分等)。這些測量可提供反映環(huán)境變化和細(xì)胞代謝生理變化的許多重要信息，作為研究和控制發(fā)酵過程的基礎(chǔ)。它們的測量原理簡述于表7-2中。表7-2發(fā)酵過程變量檢測系統(tǒng)一、發(fā)酵過程對(duì)傳感器的特殊要求 為了適應(yīng)自控的需要，發(fā)酵過程變量變化的信

52、息，應(yīng)盡可能通過安裝在發(fā)酵罐內(nèi)的傳感器檢知，然后由變送器把非電信號(hào)轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)電信號(hào)，讓儀表顯示、記錄或傳送給電子計(jì)算機(jī)處理。用于發(fā)酵過程的傳感器，由于所面臨的過程及其檢測對(duì)象的特殊性，故除了滿足常規(guī)要求，諸如：可靠性、準(zhǔn)確性、精確度、響應(yīng)時(shí)間、分辨能力、靈敏度、測量范圍、特異性、可維修性等，還應(yīng)當(dāng)滿足一些特殊要求。傳感器與發(fā)酵液直接接觸，因而首先面臨一個(gè)滅菌問題。一般要求傳感器能與發(fā)酵液同時(shí)進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，這對(duì)于大部分物理和物理化學(xué)傳感器來說都沒有問題，但有的（如pH值和溶氧）傳感器在滅菌后需要重新校準(zhǔn)。不能耐受蒸汽滅菌的傳感器可在罐外用其他方法滅菌后無菌裝入。其次是在發(fā)酵過程中保持無菌的問題，這就要求與外