細(xì)胞毒性試驗(yàn)總結(jié)

1、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)總結(jié)一、抗HBV藥物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)背景知識(shí)1二、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)方案確實(shí)立3三、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定后的局部數(shù)據(jù)4四、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)5五、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)SOP6一目的6二適用范圍6三責(zé)任人6四規(guī)程61.試驗(yàn)準(zhǔn)備72.試驗(yàn)操作83.數(shù)據(jù)處理和分析8六、總結(jié)9一、抗HBV藥物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)背景知識(shí)細(xì)胞毒性是化學(xué)物質(zhì)藥物作用于細(xì)胞根本結(jié)構(gòu)和/或生理過程,如細(xì)胞膜或細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu),細(xì)胞的新陳代謝過程,細(xì)胞組分或產(chǎn)物的合成、降解或釋放,離子調(diào)控及細(xì)胞分裂等過程,導(dǎo)致細(xì)胞存活、增殖和/或功能的紊亂,所引發(fā)的不良反響.按作用機(jī)制可分3種類型：根本細(xì)胞毒性,涉及一種或多種上述結(jié)構(gòu)或功能的改變,作用于

2、所有類型的細(xì)胞；選擇細(xì)胞毒性,存在于某些分化細(xì)胞上,主要通過化學(xué)物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化,與特殊受體結(jié)合或特殊的攝入機(jī)制所引發(fā)；細(xì)胞特殊功能毒性,對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能損傷稍微,但對(duì)整個(gè)機(jī)體損傷非常嚴(yán)重.類似毒性作用可通過細(xì)胞因子、激素和遞質(zhì)的合成、釋放、結(jié)合和降解影響細(xì)胞與細(xì)胞間的交流或特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)過程而實(shí)現(xiàn).毒性作用也可能來自化學(xué)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞外過程的干擾,任何一種非動(dòng)物檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)多種因素都應(yīng)加以考慮.1983年Ekwall提出根本細(xì)胞功能的概念,即多數(shù)化學(xué)物質(zhì)毒性作用是對(duì)細(xì)胞功能的非特異性損傷,卻可引起器官功能的特異性改變甚至機(jī)體死亡.有研究顯示化學(xué)物質(zhì)體外細(xì)胞毒性與其引起的動(dòng)物死亡率及人體死亡的血藥濃度之間

3、都存在良好的相關(guān)性.化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生的損傷和死亡,最終可表現(xiàn)為細(xì)胞水平上的改變,由此推測(cè)體外細(xì)胞毒性可以預(yù)測(cè)體內(nèi)急性毒性.體外方法有助于預(yù)測(cè)化學(xué)物質(zhì)急性暴露引發(fā)的全身和局部影響,并評(píng)估體內(nèi)毒性濃度.目前較為理想的抗HBV藥物有拉米夫定3TC、恩替卡韋ETV等.3TC是核昔左旋對(duì)味體,早期用于艾滋病的治療.拉米夫定體外能才制艾滋病毒1、2型及乙型肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄酶,在人淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞內(nèi)抑制艾滋病毒逆轉(zhuǎn)錄酶活性,在HBV-DNA轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞內(nèi)有抑制HBV-DNA復(fù)制,在HBV感染黑猩猩體內(nèi)有抑制病毒作用.拉米夫定作用原理是藥物進(jìn)入細(xì)胞器,為細(xì)胞脫氧胞喀咤激酶和細(xì)胞激酶磷酸化為活性5-三磷酸拉米夫

4、定,競爭性抑制依賴于病毒DNA和RNA逆轉(zhuǎn)錄酶.恩替卡韋ETV為環(huán)氧羥碳脫氧鳥昔,具有較強(qiáng)的抗HBV作用,也可抑制拉米夫定引起的YMDD變異病毒株感染.在體外應(yīng)用HBVDNA轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞作藥敏試驗(yàn),結(jié)果該藥抗HBV作用最強(qiáng).恩替卡韋？拉米夫定？泛昔洛韋抑制HBV的半數(shù)有效濃度EC50分別為0.00375mol/L0.116科mol/L文獻(xiàn)報(bào)道多在幾nM到幾個(gè)眼,范圍較寬、100科mol/L在土撥鼠肝炎病毒W(wǎng)HV感染的土撥鼠動(dòng)物模型,口服恩替卡韋0.1mg/kg.d共12周,血清WHV轉(zhuǎn)陰.以后,每周口服0.1mg/kg,血清WHV仍維持陰性.因此3TC和ETV常被用作抗HBV藥物篩選時(shí)

5、的陽性對(duì)照藥,用來評(píng)價(jià)篩選系統(tǒng)的正常與否.3TCETV通常的做法是：將不同濃度的3TC參加到培養(yǎng)的細(xì)胞中,作用一定時(shí)間后檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的毒性.檢測(cè)方法有MTT法、XTT法、熒光檢測(cè)法等.其中MTT法和XTT法原理相同,由于其方法簡單快速,不需特殊的儀器設(shè)備,因此得到了廣泛應(yīng)用.MTT法是二十世紀(jì)八十年代開展起來的一種快速、簡便的測(cè)試方法,目前已被廣泛用于藥物體外篩選實(shí)驗(yàn).MTT法是一種檢測(cè)細(xì)胞活性的方法.與以往細(xì)胞水平研究中檢測(cè)細(xì)胞活性的兩種常規(guī)方法-細(xì)胞計(jì)數(shù)法和同位素?fù)饺敕ㄏ啾?MTT法具有操作簡便、快速、準(zhǔn)確、廉價(jià)及不使用同位素等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的諸多領(lǐng)域.同時(shí),MTT法也是FD

6、A及我國藥品審批部門推薦的檢測(cè)方法之一.其根本原理如下：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠復(fù)原黃色的澳化3-4,5-二甲基曝陛-2-2,5-二苯基四氮陛3-4,5-dimethylthiazol-2yl-2,5-diphenylterazoliumbromide,MTT為藍(lán)紫色的不溶于水的甲月贊formazan,甲月贊的生成量在通常情況下與活細(xì)胞數(shù)成正比.由于甲月費(fèi)的多少可通過酶標(biāo)儀測(cè)定其在570nm處的吸光度OD值而得知,因此可根據(jù)OD值推測(cè)出活細(xì)胞的數(shù)目,從而了解藥物抑制或殺傷細(xì)胞的水平.目前已有MTT的升級(jí)替代產(chǎn)品,如XTT、MTS、WST-8等,三種方法的比擬見下表.盡管CCK-8方法簡

7、便、準(zhǔn)確、靈敏度高,但比MTT的價(jià)格要貴不少,所以一般來說,還是MTT法用的多.三種方法的比擬MTT法XTT法CCK-8法WST-8法甲月贊水溶性難溶性水溶性水溶性檢測(cè)波長490nm450nm450nm性狀粉末2瓶溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后使用現(xiàn)配現(xiàn)用毋需頂制使用有機(jī)溶劑DMS誠其它溶劑一一方便性+檢測(cè)速度+重復(fù)性+穩(wěn)定性+工作量-對(duì)細(xì)胞毒性-對(duì)人體毒性一-二、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)方案確實(shí)立在確定MTT法作為細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的方法之后,我們對(duì)實(shí)驗(yàn)中可能涉及的各個(gè)參數(shù)進(jìn)行了摸索和優(yōu)化.最初,由于一切都是未知,因此常常幾個(gè)參數(shù)一起調(diào)整,使得各個(gè)參數(shù)對(duì)結(jié)果的影響不是很清楚,走了一些彎路.后期逐漸摸清了參數(shù)對(duì)

8、結(jié)果影響的權(quán)重,實(shí)驗(yàn)方案逐步確立.考慮的實(shí)驗(yàn)參數(shù)有：細(xì)胞批次、細(xì)胞密度、孵育時(shí)間、加藥次數(shù)、MTT量、MTT孵育時(shí)間、DMSO溶解時(shí)間振蕩時(shí)間等.parameterCC50celldensity2000/well,5000/well,10000/well,40000/wellseedingtime1d/2dincubationtime7d/10dFBS10%,2%,0.5%volume100山150d,180d經(jīng)過實(shí)驗(yàn),最終將實(shí)驗(yàn)參數(shù)確定如下:parameterCC50celldensity5000/wellseedingtime1dincubationtime7dFBS2%volume180

9、4其中,孵育時(shí)間采用7天,主要是希望縮短篩選周期,10天也取得了較好的結(jié)果.培養(yǎng)基體積對(duì)結(jié)果影響不大.采用180M主要是和DNA增殖抑制實(shí)驗(yàn)保持一致.三、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定后的局部數(shù)據(jù)在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)方案穩(wěn)定之后,在各孔吸光度的標(biāo)準(zhǔn)差、 變異系數(shù)和各孔抑制率的標(biāo)準(zhǔn)差都可以限制在很低的水平,說明該實(shí)驗(yàn)方案是穩(wěn)定的,具有良好的重現(xiàn)性.典型3TC的CC50實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Date:09/07/07compound:ETVcelldensity:5x103incubationtime:7drugadding:2times2%FBS180ul1#plateCC50=40.4uMConc.(uM)value1va

10、lue2value3MeanSTDEV%CV%Viability%STDEV20020.2150.0178.01911.6410.1601000.3690.0215.73620.0110.493500.8580.0252.91146.5292.720251.2270.13510.96766.5409.9491.4800.0674.50480.2780.3201.6200.0684.17987.8340.0511.7400.0522.98994.3420.05701.8440.0422.251100.0000.000典型ETV的CC50實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) | |ririrBHi-iair|nBRriBrr

11、BHi-iair|nBRriBr1 1H H|aiviBBriiiaiviBBriiiinania|inania|r ri i32541262505121QZ4204-64091519216334327003TC3TCuMuM四、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)細(xì)胞毒性進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)白指標(biāo)初步定為以下7個(gè)：1 .OD平均值：反映復(fù)孔間OD值的平均水平,OD值越大,細(xì)胞數(shù)越多.2 .復(fù)孔OD值間的標(biāo)準(zhǔn)差STDEV:反映各復(fù)孔OD值之間的離散情況.標(biāo)準(zhǔn)差越大,說明復(fù)孔間不平行性越大,操作誤差越大.3 .復(fù)孔OD值間的變異系數(shù)CV:也是反映復(fù)孔間OD值離散情況的指標(biāo).由于OD值間的標(biāo)準(zhǔn)差STDEV的單位和O

12、D的單位是一致的,不能表達(dá)離散的權(quán)重,因此引入變異系數(shù)CV.這一指標(biāo)以百分比的形式表現(xiàn)OD值的離散情況,形象、直觀.4 .存活率%Viability：計(jì)算各藥物濃度下細(xì)胞的存活率可以反映細(xì)胞存活情況,該值越大,說明藥物的細(xì)胞毒性作用越小.5 .存活率的標(biāo)準(zhǔn)差STDEV:該值反映如以每個(gè)復(fù)孔均作為單獨(dú)的實(shí)驗(yàn),那么同批的復(fù)孔可以看作數(shù)批實(shí)驗(yàn),此時(shí)存活率的分布情況.該指標(biāo)越大,說明復(fù)孔間越不平行.6 .存活率的變異系數(shù)CV:該指標(biāo)反映各復(fù)孔間存活率的離散情況,該值越大,說Date:09/07/07compound:3TCcelldensity:5x103incubationtime:7drugadd

13、ing:2times2%FBS180ul2#plateCC50=2130uMConc.(uM)value1value2value3MeanSTDEV%CV%Viability%STDEV80000.2090.03918.81511.7961.9024000720.0193.23832.3351.73920000.8420.0505.99447.5984.99010001.3070.0151.11173.8843.0565001.5880.0342.16689.7684.9662501.6480.0090.52993.1602.7951251.7100.0613.57196.6460.24101

14、.7690.0170.934100.0000.000compound3TCcelldenscompound3TCcelldensity5x103ity5x103Incubationlimlime7druge7drugaddin*addin*timestimes2%2%FBSFBSrate=iCC50=2i30uMrate=iCC50=2i30uM川SO明說明每一列細(xì)胞孔即一系列稀釋單孔間不平行性越大.7 .半數(shù)致細(xì)胞毒性濃度concentrationofcytotoxicity50%,0050:指對(duì)半數(shù)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用所需濃度.該指標(biāo)可用來反映實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)是否正常工作及評(píng)價(jià)未知藥物對(duì)細(xì)胞的毒性.五

15、、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)SOP化合物抗HBV活性細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程MTT法一目的使實(shí)驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)化,保證正常工作的進(jìn)行.二適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)適用于MTT法檢測(cè)抗HBV藥物細(xì)胞毒性的操作及計(jì)算0050o三責(zé)任人分子生物學(xué)組操作人員對(duì)本規(guī)程負(fù)責(zé).四規(guī)程術(shù)語：0050concentrationofcytotoxicity50%:半數(shù)細(xì)胞毒性濃度,指對(duì)半數(shù)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用所需濃度.在本實(shí)驗(yàn)中,指致50%細(xì)胞死亡所需的藥物濃度.本實(shí)驗(yàn)旨在通過MTT法檢測(cè)未知化合物對(duì)轉(zhuǎn)染了HBV基因組的細(xì)胞系HepG的細(xì)胞毒性.背景知識(shí)：MTT法是二十世紀(jì)八十年代開展起來的一種快速、簡便的測(cè)試方法,目前已被廣泛用于藥物體外篩選實(shí)驗(yàn)

16、.其根本原理如下：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠復(fù)原黃色的澳化3-4,5-二甲基曝口坐-2-2,5-二苯基四氮口坐3-4,5-dimethylthiazol-2yl-2,5-diphenylterazoliumbromide,MTT為藍(lán)紫色的不溶于水的甲月贊formazan,甲月贊的生成量在通常情況下與活細(xì)胞數(shù)成正比.由于甲月費(fèi)的多少可通過酶標(biāo)儀測(cè)定其在570nm處的吸光度OD值而得知,因此可根據(jù)OD值推測(cè)出活細(xì)胞的數(shù)目,了解藥物抑制或殺傷細(xì)胞的水平.MTT法是一種檢測(cè)細(xì)胞活性的方法.與以往細(xì)胞水平研究中檢測(cè)細(xì)胞活性的兩種常規(guī)方法-細(xì)胞計(jì)數(shù)法和同位素?fù)饺敕ㄏ啾?MTT法具有操作簡便、快速、準(zhǔn)

17、確、廉價(jià)及不使用同位素等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的諸多領(lǐng)域.同時(shí),MTT法也是FDA及我國藥品審批部門推薦的檢測(cè)方法之一.1.試驗(yàn)準(zhǔn)備1.1.試劑和耗材：1.1.1試劑：胎牛血清FBS;G418;DMEM培養(yǎng)基高糖；0.25%Trypsin-EDTA;磷酸鹽緩沖液無車鎂；DMSO;1.1.2耗材：0.2針頭過濾器有機(jī)相和水相；1ml和10ml注射器；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；移液管5ml、10ml;移液器Tip頭.1.1.3溶液配制：1.1.3.1完全培養(yǎng)基：DMEM和FBS按9：1體積比混和,并添加1/1001/50體積比的hepes和終濃度為380回/ml的G418.維持培養(yǎng)基：DMEM和FBS

18、按49：1體積比混和,并添加1/1001/50體積比的hepe環(huán)口終濃度為3800ml的G418.1.1.3.2磷酸鹽緩沖液無鈣、鎂：8g/LNaCl,0.2g/LKCl,1.44g/LNa2HPO4,0.24g/LKH2P.4,pH7.4,高壓蒸汽滅菌121c20min,4c保存.注意：實(shí)際配制時(shí),有些試劑含多個(gè)分子的水,需將該局部的質(zhì)量算進(jìn)去.1.2.細(xì)胞培養(yǎng)：HepG培養(yǎng)采用完全培養(yǎng)基,于37C,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng).接種時(shí),細(xì)胞密度限制在1X105/ml2X105/ml左右.1.3.細(xì)胞計(jì)數(shù)：見附件?細(xì)胞計(jì)數(shù)?.1.4.細(xì)胞鋪板：細(xì)胞計(jì)數(shù)后,用完全培養(yǎng)基稀釋成M04ml,在5%CO

19、2,37c培養(yǎng)24h備用.注意：在向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種細(xì)胞時(shí),應(yīng)注意每次吸取細(xì)胞懸液前,都應(yīng)輕輕搖勻,盡量減少每次吸取的細(xì)胞數(shù)目的差異.1.5.將藥物用少量DMSO溶解,并用0.2科訂次性針頭過濾器有機(jī)系過濾除菌,此為母液其濃度通常為預(yù)先設(shè)計(jì)的最高待測(cè)濃度的1000倍或以上；然后用維持培養(yǎng)基將母液稀釋到實(shí)驗(yàn)預(yù)先設(shè)計(jì)的最高待測(cè)濃度.如配制的母液體積過小如低于1ml,不便于過濾,可先用完全培養(yǎng)基將其稀釋到最高待測(cè)濃度,再用0.2科廠次性針頭過濾器水系過濾后分裝備用.2.試驗(yàn)操作2.1.藥物稀釋：藥物采用倍比稀釋.可在EP管中稀釋.第一管為最高待測(cè)濃度的藥液.自第二管分別參加一定量的維持培養(yǎng)基,

20、然后從第一管吸取等量的藥液至第二管,吹打混勻后,棄去tip頭并換新tip頭,從第二管吸取等量藥液至第三管,吹打混勻.依此操作直至倒數(shù)第二管.最后一管為維持培養(yǎng)基,不含藥物.2.2.藥物處理：棄去細(xì)胞培養(yǎng)液,注意吸除干凈.然后吸取已稀釋的藥液180出睢IJ對(duì)應(yīng)的細(xì)胞孔中.各濃度組均設(shè)三孔重復(fù),最后一排孔為細(xì)胞對(duì)照.另設(shè)培養(yǎng)基對(duì)照.如圖1.2.3.加藥后在5%CO2,37c細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h;按上述步驟換新鮮含藥培養(yǎng)基,共2次.最后一次換藥后再培養(yǎng)72h,準(zhǔn)備檢測(cè).圖1黃色局部為PBS,無細(xì)胞；綠色為培養(yǎng)基對(duì)照；粉色、藍(lán)色局部為兩種不同的藥物處理,每種藥物設(shè)三個(gè)重復(fù),8個(gè)濃度,紅色局部為細(xì)胞空白對(duì)照.2.4.MTT檢測(cè)： 將MTT母液 5mg/ml,10X用PBS稀釋為1X.去除各孔中的培養(yǎng)液 注意： 盡可能去除干凈！ ,參加1XMTT,200山孔,在37c培養(yǎng)箱孵育1h;去除MTT,向各孔參加DMSO,200山孔,在酶標(biāo)儀上振蕩20min,讀取吸光度值OD570