翻譯好的羅氏公司Tunel試劑盒操作說明書

1、羅氏Roche公司T u n el試劑盒操作說明書 Insitucelldeathdetectionkit-POD 法一、原理：TUNEL TdT-mediateddUTPnickendlabeling細胞凋亡檢測試劑盒是 用來檢測組織細胞在凋亡早期過程中細胞核DNA的斷裂情況.其原理是熒光素fluorescein標記的dUTP在脫氧核糖核甘酸末端轉(zhuǎn)移 酶TdTEnzyme的作用下,可以連接到凋亡細胞中斷裂 DNA的3' -OH末端,并與連接辣根過氧化酶HRP, horse-radishperoxidase 的熒光素抗體特異性結(jié)合,后者又與HRP底物二氨基聯(lián)苯胺DAB 反響產(chǎn)生很強的顏

2、色反響呈深棕色,特異準確地定位正在凋亡的 細胞,因而在光學顯微鏡下即可觀察凋亡細胞；由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA斷裂,因而沒有3 '-OH形成,很少能夠被 染色.本試劑盒適用于組織樣本石蠟包埋、冰凍和超薄切片和細 胞樣本細胞涂片在單細胞水平上的凋亡原位檢測.還可應(yīng)用于抗 腫瘤藥的藥效評價,以及通過雙色法確定細胞死亡類型和分化階段. 二、器材與試劑器材：光學顯微鏡及其成像系統(tǒng)、小型染色缸、濕盒塑料飯盒與紗 布、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規(guī)格的加樣器及槍頭等； 試劑：試劑盒含：1 號藍蓋EnzymeSolution 酶溶液：TdT10x、2號紫蓋LabelSolution標

3、記液：熒光素標記的 dUTP1x、3號棕瓶Converter-POD標記熒光素抗體的HRP;自備試劑：PBS、雙蒸水、二甲苯、梯度乙醇100、95、90、80、70%、DAB工作液臨用前配制,5 "20X DAB+1"L30%H2O2+94" lPBS、ProteinaseK工作液10-20 區(qū) g/mlin10mMTris/HCl , pH7.4-8或細胞通透液0.1%TritonX-100溶于0.1%檸檬酸鈉,臨用前配制、蘇木素或甲基綠、DNase13000U/ml - 3U/mlin50mMTris-HCl ,pH7.5, 10mMMgCl2, 1mg/ml

4、BSA等.三、實驗步驟操作流程圖：制作石蠟切片一脫蠟、水合一細胞通透一加TUNEL反應(yīng)液一加converter-POD與底物DAB反響顯色一光學顯微鏡計數(shù)并 拍照.具體操作步驟石蠟包埋切片的檢測：1 .用二甲苯浸洗2次,每次5min;2 .用梯度乙醇100、95、90、80、70%各浸洗1次,每次3min;注：上面兩步是針對石蠟切片樣本的處理4 .用ProteinaseK工作液處理組織15-30min在21 - 37 C 溫度、時間、濃度均需摸索如果凋亡細胞染色較弱時,可用高濃度的ProteinaseK 400g/mL處理5分鐘.其它替代方法：石蠟切片的預(yù)處理也可根樨實際情況可采用下述三種替代

5、方法之一,即蛋白酶K處理的步聚改用下述方法,其余步聚均相同：替代方法1:將脫蠟及水合好的切片浸入通透液中8-10min 通透液:0.1%THtonX-100溶于0.1%檸檬酸鈉,需新鮮配制替代方法2:將脫蠟及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10min 胃蛋白酶：0.25%-0.5%溶于 HC1PH2,胰蛋白酶 0.25%-0.5%溶于 0.01NHC1替代方法3:將脫蠟及水合好的切片浸入含200m10.1M的檸檬酸緩沖液PH6的塑料盒中,置于微波爐中350W 低檔處理5min.5 .PBS漂洗2次；6 .制備TUNEL反響混合液：處理組用50區(qū)l1號液+450區(qū)l2號液混勻；而陰性對照

6、組僅加50區(qū)l2號液,陽性對照組先參加100“DNase1,反響在1525cx 10min,后面步 驟同處理組.7 .玻片干后,加50 lTUNEL反響混合液陰性對照組僅加 50履2 號液于標本上,加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反響37c X1h.8 .PBS漂洗3次；9 .可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計數(shù)凋亡細胞激發(fā)光波長為450500nm,檢測波長為515565nm;10 .玻片干后加50屋3號液converter-POD于標本上,加蓋玻片 或封口膜在暗濕盒中反響 37c x 30min.11 .PBS漂洗3次；12 .在組織處加 50100 1DAB 底物,反響 1525c Xl0min;

7、13 .PBS漂洗3次；14 .拍照后再用蘇木素或甲基綠復(fù)染,幾秒后立即用自來水沖洗.梯 度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片.15 .加一滴PBS或甘油在視野下,用光學顯微鏡觀察凋亡細胞共計 200500個細胞并拍照.可結(jié)合凋亡細胞形態(tài)特征來綜合判斷未 染色細胞變小,胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象,晚期出現(xiàn)凋亡小體,貼壁 細胞出現(xiàn)鄒縮、變圓、脫落；而染色細胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化, 核膜裂解,染色質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體對于培養(yǎng)細胞的預(yù)處理：在載玻片上鋪一層薄薄的多聚賴氨酸,枯燥后在去離子水中漂洗,枯燥后4 c保存；適當方法誘導(dǎo)細胞凋亡,同時設(shè)未經(jīng)誘導(dǎo)的對照組,各組離心收集 約1X106個細胞,PBS

8、洗一次,重懸,加到鋪好的多聚賴氨酸載玻 片上,自然枯燥,使細胞很好的吸附到載玻片上；將吸附細胞的載玻片在4%多聚甲醛中固定25min;PBS浸洗二次,每次5min;將吸附細胞的載玻片在0.2%的TritonX-100中處理5min;PBS浸洗二次,每次5min;后續(xù)操作如同石蠟包埋切片的 6-15四、考前須知1進行PBS清洗時,每次清洗5min.2 .PBS清洗后,為了各種反響的有效進行,請盡量除去PBS溶液后再進行下一步反響.3 .在載玻片上的樣本上加上實驗用反響液后,請蓋上蓋玻片或保鮮 膜,或在濕盒中進行,這樣可以使反響液均勻分布于樣本整體,又可 以預(yù)防反響液枯燥造成實驗失敗.4 .TUN

9、EL反響液臨用前配制,短時間在冰上保存.不宜長期保存, 長期保存會導(dǎo)酶活性的失活.5 .如果20X DAB溶液顏色變深成為紫色,那么不可使用,需重新配制.6 .用甲基綠(MethylGreen)染液(3-5%甲基綠溶于0.1M醋酸巴比妥PH4.0)染色后,請用滅菌蒸儲水清洗多余的甲基綠.然后進行洗凈(100%乙醇)、脫水(二甲苯)透明、封片后通過光學顯微鏡觀察 操作.如果此時使用8090%的乙醇洗凈時,甲基綠比擬容易脫色, 注意快速進行脫水操作.7 .2號液含甲次碎酸鹽和二氯鉆等致癌物,可通過吸入、口服等途 徑進入機體,注意防護.8 .試劑保存；未翻開的試劑盒貯存在-20C (-1525 C)

10、 ; 3號液(converter-POD)液一旦解凍,以后就保存在 4c (28C)下,至 少在6m內(nèi)穩(wěn)定,預(yù)防再次凍存；TUNEL反響液臨用前配好后,放 至冰上直至使用.9 .結(jié)果分析時注意：在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細胞 中可產(chǎn)生大量DNA片斷,從而引起假陽性結(jié)果；而有些類型的凋亡現(xiàn)象可能原因建議非特異性 染色TdT酶的濃度過高用 TdTdilutionbuffer* 作 1 ： 2 1 ： 10 稀釋TdT酶反響時間過長或 TdT酶反響過程中反響液注意限制反響時間,并保證 TdT酶反響液能性細胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不完全,以及細胞外的矩陣成分阻止TdT進入胞內(nèi)反響

11、,進而產(chǎn)生假陰性結(jié)果.滲漏,細胞或組織外表不能保持濕潤.很好地覆蓋樣品.光照紫外線導(dǎo)致包埋試劑的聚合如：甲基丙烯酸 會導(dǎo)致樣本DNA的斷裂嘗試改用其它包埋材料或其它聚合試劑在固定組織時樣本 DNA已斷裂內(nèi)源核酸酶的作 用保證樣品取樣后立即固定或通過肝靜脈灌注 固定使用了不適當?shù)墓潭ㄒ?例如一些酸性固定液采用推薦的固定液固定后某些核酸酶活性依然較高導(dǎo)致DNA斷裂用含有dUTP和dAPT的溶液封閉標記率低如果以乙醇或甲醇固定的樣本那么標記效率較低 因 為在固定時染色質(zhì)未能與蛋白質(zhì)交聯(lián), 而在操作中 喪失用溶于PBSPH7.4中的4%多聚甲醛固定 或福爾馬林或戊二醛固定.固定時間過長,導(dǎo)致交聯(lián)程度過

12、高減少固定時間,或用溶于PBSPH7.4的2%多 聚甲醛固定熒光淬滅Fluorescence在普通光照 10分鐘就會嚴重淬 滅,需注意避光操作促滲條件不佳,以致于試劑不能到達靶分子或濃度 過低1、增加通透劑促滲時間2、增加通透劑的作用溫度15-25 3、優(yōu)化蛋白酶K的作用濃度和作用時間如： 以 400ug/ml 作用 5min4、0.1M的檸檬酸鈉70 c作用30min.熒光背景很高支原體污染請使用支原體染色檢測試劑盒檢測是否為支 原體污染TdT酶的濃度過高或反響時間過長用 TdTdilutionbuffer* 作 1 ： 2 1 ： 10 稀釋或注意限制反響時間紅細胞中血紅蛋白導(dǎo)致的自發(fā)熒光產(chǎn)生嚴重干擾.宜選擇其它細胞凋亡檢測試劑盒.高速分裂和增殖的細胞,有時也會出現(xiàn)細胞核中的 DN幽裂.陽性對照 沒有信號DNaseI的濃度過低1、 冷凍