大豆β-伴大豆球蛋白α’-亞基基因RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)調(diào)控的研究

1、大豆B -伴大豆球蛋白a '-亞基基因RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建及表 達(dá)調(diào)控的研究大豆蛋白是人和動(dòng)物的主要的植物蛋白來(lái)源,約占大豆種子的40%,其中含 有90%的貯藏蛋白,7s蛋白和11s蛋白是大豆貯藏蛋白的主要成分,研究說(shuō)明,調(diào)節(jié)二者比例可以改善大豆蛋白加工適應(yīng)性,提升11s蛋白含量降低7s蛋白的含量 可以 改善大豆蛋白的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì).7s蛋白中的主要成分為B -伴大豆球蛋白,它是 大豆中引 起嬰兒和幼齡動(dòng)物消化道過(guò)敏反響的主要大豆抗原蛋白.a ' a和B是B -伴大豆球蛋白的三個(gè)主要亞基,這三個(gè)亞基均被證實(shí)是潛 在的食 物致敏因子.p-伴大豆球蛋白擁有較好的熱穩(wěn)定性,通過(guò)常規(guī)的加熱

2、處理 對(duì)其抗原活 性的降低效果非常有限,因此,通過(guò)育種手段降低B -伴大豆球蛋白含 量是目前降低其 活性的主要途徑.到目前為止,人們已經(jīng)得到了一系列經(jīng)自然變異或人工誘變產(chǎn)生的具有 p-伴大 豆球蛋白不同亞基缺失表現(xiàn)的育種材料,并對(duì)其分子根底進(jìn)行了深入研究. 但是,通 過(guò)基因工程手段以到達(dá)降低B -伴大豆球蛋白各亞基含量的研究還鮮見 報(bào)道.故本研究根據(jù)RNA干擾技術(shù)原理,克隆了 B -伴大豆球蛋白a'-亞基基因的 核心 保守序列中一段400bp大小的片段,采用基因工程手段,分別構(gòu)建了以抗除草劑 Bar基因和耐鹽堿BADH基由于篩選標(biāo)記的a'-亞基基因ihp-RNAi高效表 達(dá)載體

3、 p3301-PFNZ和p3301-PFNZ-BADH 兩個(gè)單價(jià)表達(dá)載體及以 Bar基由于篩選 標(biāo)記的 雙價(jià)表達(dá)載體p3301- a' +BO通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和花粉管通道法將兩個(gè)單價(jià)表達(dá)載體導(dǎo)入大豆,經(jīng)過(guò)抗性篩選,并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR僉測(cè)Southern blo集交,RT- PCR和ELISA檢測(cè),以期應(yīng)用RNAF擾技術(shù)對(duì)B -伴大豆球蛋白a '-亞基基因的表達(dá)調(diào)控加以研究,為應(yīng)用基因工程技術(shù)進(jìn)行大豆品質(zhì)改良奠定了根主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：分別克隆了構(gòu)成ihp-RNAi表達(dá)載體結(jié)構(gòu)的4個(gè)片段：種子特異性啟動(dòng)子7ap, a'-亞基基因正義和反義片段及功能性間隔序列intro

4、n-s.以植物表達(dá)載體pCAMBIA330為根底,經(jīng)雙幅切連接的方法依次連入 種子特異性啟動(dòng)子 7ap、a'-亞基基因反義片段,功能性間隔序列intron-s和a'-亞基基因正義片段,構(gòu)成 以植物表達(dá)載體pCAMBIA330體身帶有的抗除草劑 Bar基由于篩選標(biāo)記的ihp-RNAi 表達(dá)載體 p3301-PFNZ.克隆耐鹽堿基因BADH利用Xhol I單幅切替換了表達(dá)載體p3301-PFNZ中的 抗 除草劑基因Bar,并通過(guò)EcoR I單幅切鑒定方向后,構(gòu)建了以BAD!基由于篩選 標(biāo)記 的平安型植物表達(dá)載體p3301-PFNZ-BADH將已克隆好的p-伴大豆球蛋白B -亞基基

5、因的正義片段和反義片段分別插入到啟動(dòng)子7 a p下游和終止子nos上游,并通過(guò)幅切鑒定其插入方向,構(gòu)建成B -伴大豆球蛋白a'-亞基和B -亞基的雙價(jià)ihp- RNAi 表達(dá)載體p3301- a' +BO采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將兩個(gè)單價(jià)表達(dá)載體導(dǎo)入受體大豆,經(jīng)抗性篩選和PCR初步 檢測(cè)得到耐鹽堿的T0代“吉農(nóng)27轉(zhuǎn)基因大豆15株,抗草錢瞬T0代“吉農(nóng)28轉(zhuǎn) 基因大豆10株,轉(zhuǎn)化率為2.1%.采用花粉管通道法將兩個(gè)單價(jià)表達(dá)載體 導(dǎo)入受體大 豆,共獲得780粒轉(zhuǎn)化籽粒,其中轉(zhuǎn)p3301-PFNZ-BAD 籽粒：“吉農(nóng) 27"125粒“吉新豆1號(hào) 112?！巴ㄞr(nóng)13143粒；轉(zhuǎn)p

6、3301-PFNZ籽粒：“吉 農(nóng)27123 粒,“吉新豆1號(hào) 131粒,“通農(nóng)13146粒.經(jīng)抗性篩選并PCF檢測(cè),從獲得的幼苗中初步篩選出耐鹽堿陽(yáng)性植株“吉農(nóng)27"10株,吉新豆1號(hào) 7株,“通農(nóng)13"5株；抗草鏤瞬陽(yáng)性植株： “吉農(nóng)27"8株, “吉新豆1號(hào) 6株,“通農(nóng)13"5株；平均轉(zhuǎn)化率為3.2% o對(duì)轉(zhuǎn)基因后代進(jìn) 行PCF檢測(cè),獲得農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化的T1代陽(yáng)性植株45株,其中耐鹽堿“吉農(nóng) 27 T1 代陽(yáng)性植株25株,抗草鏤瞬“吉農(nóng)28 T1代陽(yáng)性植株20株.為了進(jìn)一步鑒定表達(dá)載體的T-DNA區(qū)是否整合到大豆基因組中,隨機(jī)分別抽 取吉農(nóng)27和吉農(nóng)28的T1代陽(yáng)性植株提取基因組,以BADH/Bar為探針進(jìn)行Southern 雜交檢測(cè),結(jié)果陽(yáng)性植株均出現(xiàn)雜交信號(hào),非轉(zhuǎn)基因植株沒(méi)有出現(xiàn)雜交 信號(hào),由此證 明兩個(gè)單價(jià)表達(dá)載體的 T-DNA區(qū)已整合到大豆基因組中.對(duì)經(jīng)過(guò) Southern雜交分析 為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行 RT-PCR僉測(cè),結(jié)果說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株 的a'亞基基因?nRNA 量明顯低于非轉(zhuǎn)基因植株,說(shuō)明RNA干擾機(jī)制在轉(zhuǎn)錄后 水平發(fā)揮了作用