三葉因子2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建

1、三葉因子2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建 作者：張紹榮，楊曉強(qiáng)，邢銳，宋于剛，陳學(xué)清【關(guān)鍵詞】 胃潰瘍 Construction of eukaryotic expression vector of human TFF2 gene【Abstract】 AIM: To construct a eukaryotic expression vector of human TFF2 gene. METHODS: We assembled a TFF2 gene in pfu mix reaction system and cloned it to pGMT easy vector. The positive

2、colonies were first confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing and then were inserted to eukaryotic expression vector pcDNA3.1 and verified by enzyme digestion and sequencing. RESULTS: After TA colon of synthetic TFF2, the positive colonies were finally verified by sequencing, which we

3、re totally in line with the designed coding sequence of TFF2 gene. CONCLUSION: Eukaryotic expression vector of human TFF2 gene has been successfully constructed, which provides a basis for further investigation of gastric ulcer.【Keywords】 eukaryotic expression vector； TFF2 gene; gastric ulcer【摘要】 目的

4、：構(gòu)建TFF2pcDNA3.1真核表達(dá)載體. 方法：應(yīng)用體外基因拼裝方法合成TFF2，然后TA克隆于pGMT easy載體中. 陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序鑒定. 再經(jīng)雙酶切消化后，插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1上，經(jīng)酶切鑒定與測(cè)序證實(shí). 結(jié)果：合成的TFF2經(jīng)TA克隆后，篩選得到的陽(yáng)性克隆,經(jīng)測(cè)序鑒定，與設(shè)計(jì)的TFF2基因序列完全一致. 經(jīng)酶切連接并成功插入pcDNA3.1上. 結(jié)論：成功構(gòu)建了TFF2基因的真核表達(dá)載體,為以后的胃潰瘍研究奠定了基礎(chǔ).【關(guān)鍵詞】 真核表達(dá)載體； TFF2基因;胃潰瘍0引言某些生長(zhǎng)因子的缺乏或者減少是消化性潰瘍難以治愈的原因之一. 三葉因子2（Trefoil factor

5、 2, TFF2）在生理?xiàng)l件時(shí)能保持胃黏膜完整與穩(wěn)定，在急性損傷時(shí)分泌增多，在消化性潰瘍中有特異表達(dá)，提示其在維持胃腸道黏膜的完整性和促進(jìn)快速修復(fù)過(guò)程中起重要作用,在消化性潰瘍的治療中有一定的應(yīng)用前景. 我們用體外基因拼裝技術(shù)合成TFF2，并構(gòu)建該基因的真核表達(dá)載體.1材料和方法1.1材料Taq酶.PCR凝膠回收試驗(yàn)盒和限制性?xún)?nèi)切酶為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品. 所有寡核苷酸和PCR引物片段均由上海博亞生物有限公司合成. pGEMT easy試劑盒購(gòu)自Promega公司. 1 kb DNA ladder， Maker III，pfu PCR Master mix購(gòu)自北京天為時(shí)代生物公司. pcDNA

6、3.1 為我研究所保存. 其他試劑均為化學(xué)分析純.1.2方法根據(jù)已知人的TFF2基因的蛋白序列（GeneBank登錄號(hào)：NP_005414）來(lái)設(shè)計(jì)合成TFF2表達(dá)cDNA序列. 我們還在TFF2的信號(hào)肽和成熟TFF2之前，插入一段cmyc的標(biāo)記(tag)，形成cmycTFF2. 為便于進(jìn)一步的亞克隆，在cmycTFF2的氨基端添加BamH I酶切位點(diǎn)，在羧基端（即終止密碼子之后）添加EcoR I和Xba I酶切位點(diǎn). cmycTFF2最終設(shè)計(jì)序列約450 bp. 然后，按每40 bp的核苷酸的長(zhǎng)度設(shè)計(jì)22條引物，參考有關(guān)文獻(xiàn)1進(jìn)行. 產(chǎn)物經(jīng)電泳后，切取所需條帶用PCR凝膠回收試驗(yàn)盒進(jìn)一步純化.

7、 再用上下游兩末端引物擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)后，加入25 mmol/L濃度的dATP 1 L，72保溫15 min. 取上述PCR終產(chǎn)物約3 L，用pGMT easy試劑盒進(jìn)行TA克隆. 方法按Promega公司提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行. 克隆產(chǎn)物經(jīng)EcoR I酶切鑒定后送博亞生物公司進(jìn)行測(cè)序. 應(yīng)用質(zhì)粒小量提取試劑盒，提取測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和BamH I雙酶切及瓊脂糖凝膠電泳后，以柱式小量切膠回收試劑盒回收400 bp左右大小的電泳條帶，質(zhì)粒pcDNA3.1用相同的酶酶切后用乙醇沉淀法回收大片段，將回收的大小片段按18的分子比用T4連接酶連接，用低溫氯化鈣法轉(zhuǎn)化宿主E. coli DH

8、 5感受態(tài)細(xì)胞涂布于含氨芐青霉素（100 mg/L）的LB培養(yǎng)基上用EcoR I和BamH I酶切鑒定2， 陽(yáng)性克隆送博亞生物公司測(cè)序.2結(jié)果將按TFF2基因設(shè)計(jì)的40 bp的寡核苷酸混合，用pfu Master mix進(jìn)行拼裝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在第1次擴(kuò)增時(shí)，電泳帶呈拖尾狀（smearing），并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有明確的條帶出現(xiàn)，但拼裝的產(chǎn)物經(jīng)稀釋?zhuān)偌尤雰啥说囊镞M(jìn)行第3次擴(kuò)增時(shí)，可以見(jiàn)到所需的420 bp的條帶（圖1）. 在它的前后面有較弱的梯形帶. 為進(jìn)一步得到更純的產(chǎn)物進(jìn)行克隆，我們將產(chǎn)物純化，再用未端引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可見(jiàn)到一條非常清晰的目的基因帶. 為進(jìn)一步克隆，我們將PCR產(chǎn)物在Taq酶存

9、在的條件下，進(jìn)行未端加T. 然后，連接于pGMT easy載體. 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，經(jīng)藍(lán)白斑篩3討論三葉肽是一類(lèi)較新的胃黏膜保護(hù)因子，成熟的TFF2是一個(gè)由106個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，我們利用PCR技術(shù)，在體外成功地拼裝了TFF2基因. 這一技術(shù)是在以往同類(lèi)研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良的. 但與原方法相比，操作更為簡(jiǎn)單、方便和快捷. 我們采用的PCR拼裝系統(tǒng)為pfu Master mix. 這省去了優(yōu)化PCR系統(tǒng)的時(shí)間，并且由于pfu酶復(fù)制的真實(shí)性，可以真實(shí)地保持產(chǎn)物與設(shè)計(jì)的一致性. 在實(shí)驗(yàn)中，我們還采用了TA克隆的技術(shù)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行克隆，而不是如原方法那樣，首先在產(chǎn)物中設(shè)計(jì)好酶切位點(diǎn)，大量擴(kuò)增產(chǎn)物后將產(chǎn)物純化，然后進(jìn)行酶切，再純化后克隆，而是對(duì)產(chǎn)物直接進(jìn)行克隆. 這大大減化了操作步驟并提高了效率. 另外，以前的方法中采用了pfu和Taq酶的復(fù)合物作為拼裝體系，由于Taq酶缺乏糾錯(cuò)能力，有使產(chǎn)物出現(xiàn)突變的可能. 而我們?cè)谶M(jìn)行產(chǎn)物拼裝和擴(kuò)增時(shí)完全用pfu酶，因而，更高地保證了產(chǎn)物拼裝的真實(shí)性. 我們將拼裝的TFF2基因連接于pGMT easy載體，拼裝的TFF2序列與設(shè)計(jì)序列完全一致. 又進(jìn)行雙酶切將TFF2切下來(lái)連接至pcDNA3.1上，經(jīng)轉(zhuǎn)化克隆，得到所需要的帶有TFF2的真核表達(dá)載體. 經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序與設(shè)計(jì)TFF2序列完全一