微生物學試驗講義

1、微生物學實驗講義實驗四顯微測微技術及細菌運動性觀察一、目的要求1 . 了解測微尺的構造和使用，學會測量微生物細胞大小的方法。2 .學習懸滴法觀察細菌運動性技術二、實驗原理（一）顯微測微技術微生物細胞的大小是微生物基本的形態(tài)特征，也是分類鑒定的依據之一。其大小的測量需在顯微鏡下用目鏡測微尺來進行， 但由于測量的是放大后的圖像， 故目鏡測微尺 在不同放大倍率下每格實際代表的長度也隨之變化，因此，需用物鏡測微尺來校正在不同放大倍率下目鏡測微尺每格所代表的實際長度。物鏡測微尺是中央刻有精確刻度的載玻片，一般是將1 mm等分為100格，每格長0.01 mm,即10 pm,它不直接用于測量細胞大小，而是用

2、于校正目鏡測微尺的每格 的相對長度。目鏡測微尺是一個可放人接目鏡的直徑均為1.75 mm的圓形玻片，其中央有精確的等分刻度（有50格和100格兩種）測量時，需將其放人接目鏡中的隔板上， 用以測量經顯微鏡放大后的細胞物象。（二）細菌運動性在顯微鏡下觀察細菌的運動性， 也可以初步判斷細菌是否有鞭毛。 通常使用壓滴法 或懸滴法觀察細菌的運動性。觀察時，要適當減弱光線，增加反差，如果光線很強，細 菌和周圍的液體就難以辨別。三、實驗器材1 .活材料：培養(yǎng)12-16h的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母2 .試劑：香柏油、二甲苯、凡士林等。3 .器材：目鏡測微尺，物鏡測微尺、凹載玻片、蓋玻片、銀子、接種環(huán)

3、、滴管、擦鏡 紙、顯微鏡。四、操作步驟 (-)顯微測微技術1 .裝目鏡測微尺： 取出接目鏡，把目鏡上的透鏡旋下，將目鏡測微尺刻度朝下放在目 鏡鏡筒內的隔板上，然后旋上目鏡透鏡，再將目鏡插人鏡筒內。2 .校正目鏡測微尺(1)將物鏡測微尺刻度面朝上放在顯微鏡載物臺上(2)先用低倍鏡觀察，將鏡臺測微尺有刻度的部分移至視野中央，調節(jié)焦距，當清晰地看到鏡臺測微尺的刻度后，轉動目鏡使目鏡測微尺刻度與物鏡測微尺的刻度平行。利用移動器移動物鏡測微尺，使兩尺的第一條刻度線相重合，再向右尋找另外兩條重合的 刻度線，分別數出兩重合線之間物鏡測微尺和目鏡測微尺所占的格數，由下列公式算出目鏡測微尺每格所代表的長度。目鏡

4、測微尺每格長度=(兩測微尺重合線間鏡臺測微尺格數10) /兩測微尺重合 線間目鏡測微尺格數用同樣的方法換成高倍鏡進行校正，記錄并計算在每種倍率下目鏡測微尺每一格所 代表的長度。酵母細胞大小的測定目鏡測微尺校正完畢后，取下鏡臺測微尺，換上酵母水浸片，在不同倍率下測量菌體的長度和寬度，記錄測定值，并計算出酵母的長、寬值。(5-10個取平均) (二)懸滴法觀察細菌運動性1 .在潔凈蓋玻片周圍涂少許凡士林。2 .在蓋玻片中央滴一小滴菌液，或用接種環(huán)取 1-2環(huán)菌液置于中央。3 .將凹玻片反轉，使凹窩中心對準蓋玻片上的菌液滴，液滴不得與凹玻片接觸，以接種環(huán)柄輕壓使蓋玻片與凹玻片粘在一起， 液滴處于封閉的

5、小室中，防止液滴干燥和氣流 的影響。4 .小心將凹玻片翻轉過來，使菌滴仍懸浮在蓋玻片下和凹窩中心。5 .先用低倍鏡找到懸滴邊緣，再用高倍鏡觀察。觀察時光線要調得暗一些。用懸滴法分別觀察大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的運動性。 細菌的運動有一定的前進 方向，并可轉彎，極生單鞭毛菌類多為直線運動，周生鞭毛菌類多作波浪式運動。五、注意事項1 .檢查細菌運動的載玻片和蓋玻片都要潔凈無油，否則將影響細菌的運動2 .制水封片時菌液不可加得太多，過多的菌液會在蓋玻片下流動，因而在視野內只見 大量的細菌朝一個方向運動，從而影響了對細菌正常運動的觀察。六、實驗結果1 .報告測微計算過程與結果。2 .描述各菌運動方式。

6、|七、思考題1 .為什么更換不同放大倍數的目鏡或物鏡時，必須用鏡臺測微尺重新對目鏡測微尺進 行校正？2 .在不改變目鏡和目鏡測微尺，而改用不同放大倍數的物鏡來測定同一細菌的大小， 測定結果是否相同？為什么？2.實驗五 酯母菌個體、群體形態(tài)觀察，血球板顯微鏡計數技術、目的要求3.學會區(qū)別死活菌的方法。4.了解血球計數板計數的原理，學會測定酵母細胞總數方法。、實驗原理用血球計數板在顯微鏡下直接計數是一種常用的微生物計數方法。血球計數板是塊特制的厚載玻片，具上由四條槽構成三個平臺，中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各刻有一個方格網，每個方格網共分為 9個大方格，中間的大方格即為計數室

7、。計數室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個大方格分成16個中方格,個中方格又分成25個小格（即16X25）,另一種是一個大方格分成 25個中方格，每4、中方格又分為16個小方格（即25X16）,但無論是哪一種規(guī)格的計數板，每一個大方格中的小方格都是400個，每一個大方格邊長為1 mm,則每一個大方格的面積為1 mm2上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.1mm,所以計數室的容積為0.1 mm3計數時，如果使用16>25的計數板，要按對角線方位取左上、左下、右上、右下上述4個中格進行計數（即計數100個小格中的酵母細胞數），如果使用25X16規(guī)格的計數板，則除了計數上述4個中格外，還要計

8、數中央的1個中格，即計數80個小格中白勺酵母細胞數，分別按下述公式計算出酵母細胞數。（1） 16 25格的血球計數板計算公式：1 mL酵母細胞數=A/4 M6X104淅釋倍數（2） 25優(yōu)格的血球計數板計算公式：1mL酵母細胞數=A/5 25 M04淅釋倍數三、實驗器材啤酒酵母菌懸液，顯微鏡，血球計數板，載玻片，蓋玻片，接種環(huán)，呂氏美藍染液。四、操作步驟（一）血球板計數1.菌懸液的制備：為便于計數，對樣品進行適當稀釋，稀釋程度以每小格內含510學會使用顯微鏡觀察酵母菌形態(tài)的方法0 觀察并掌握酵母菌的菌落特征、個體形態(tài)、生長及繁殖方式。個酵母為宜，可采用10倍系列稀釋法。2 .加菌懸液樣品：將清

9、潔干燥的血球計數板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細滴管將搖勻的菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴， 讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動進入計數室，用吸水紙吸去多余水液。3 .顯微鏡計數：加樣后靜止5min,然后將血球計數板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍 鏡找到計數室所在位置，然后換成高倍鏡進行計數，計數時，對位于線上酵母菌，可采 取只記數兩條邊的辦法，當酵母菌芽體達到母細胞大小的二分之一時，可記作兩個細胞。4 .計數完畢，將計數板在水龍頭下沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用 電吹風吹干。（二）死活菌鑒別1.在干凈載玻片中央加一滴呂氏美藍染色液，以無菌操作用接種環(huán)挑取少量酵母菌體 放于美藍液中，混合均勻。

10、2,取一塊蓋玻片，先將一邊與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下（以免產生氣泡），使其蓋在菌液上，將多余菌液用吸水紙吸干。3 .將載片置于載物臺上，先用低倍鏡然后用高倍鏡觀察酵母的形態(tài)和出芽情況，并根 據顏色來區(qū)別死活細胞。4 .染色約0.5 h后再進行觀察，注意死細胞數量是否增加。五、實驗結果1 .結果繪圖說明你所觀察到的酵母形態(tài)特征。2 .報告計數結果。六、思考題根據你的體會，說明用血球計數板計數的誤差主要來自哪些方面？應如何盡量減少 誤差？力求準確？實驗六放線菌個體、群體形態(tài)觀察、目的要求1 .學習并掌握放線菌形態(tài)的顯微鏡觀察方法。2 .觀察放線菌的菌落特征、個體形態(tài)及其抱子的形態(tài)。二、實驗原

11、理放線菌一般由分枝狀菌絲組成，它的菌絲可分為基內菌絲（營養(yǎng)菌絲）、氣生菌絲或抱子絲三種。放線菌生長到一定階段， 大部分氣生菌絲分化成抱子絲，通過橫割分列的 方式產生成串的分生抱子。抱子絲形態(tài)多樣，有直、波曲、鉤狀、螺旋狀、輪生等多種 形態(tài)。抱子也有球形、橢圓形、桿狀和瓜子狀等等。它們的形態(tài)構造都是放線菌分類鑒 定的重要依據。放線菌的菌落早期絨狀同細菌菌落月牙狀相似，后期形成抱子菌落呈粉狀、干燥， 有各種顏色呈同心圓放射狀。三、實驗材料1 .菌種。2 .培養(yǎng)基o3 .器皿：培養(yǎng)皿，載玻片、蓋玻片、無菌滴管、銀子、接種環(huán)、小刀（或刀片）水浴鍋,顯微鏡，超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱。四、操作步驟（一）插片

12、培養(yǎng)法1 .取融化并保溫在50c的高氏1號培養(yǎng)基15-20ml,倒入9厘米的無菌皿中，冷凝成 平板。2 .用接種環(huán)取放線菌抱子于無菌水中，制成抱子懸液。3 .用無菌吸管吸抱子懸液1滴于平板上，用無菌刮鏟涂抹均勻4 .取無菌蓋玻片，傾斜的插入培養(yǎng)基中，每皿插入5-8片。5 .將平板倒置在28-30 C溫箱中，培養(yǎng)3-4 d。6 .取插片一張，用擦片紙擦去玻片一面的放線菌，微熱固定。7 .在蓋玻片上，滴加石炭酸復紅染色 1 min ,水洗風干。8 .鏡檢。取干凈載玻片一張，將染色的蓋玻片面向下放在載玻片上。在油鏡下觀察放線菌的菌絲（包括基內菌絲和氣生菌絲 卜抱子絲（有直形、波狀菜、螺旋狀等）和抱子

13、形。（二）印片法1.制備菌懸液和平板培養(yǎng)基同（一）。2,取菌懸液一環(huán)，在平板培養(yǎng)基上劃線 6-7次，置于28-30 C的溫箱中培養(yǎng)3 &3 .取生長好的放線菌的培養(yǎng)皿，用接種針將菌苔和培養(yǎng)基切割成小方塊，并用針穿過 培養(yǎng)基挑起。4,取一張干凈載玻片，通過燈焰稍微加熱，然后用針將菌苔表面輕輕地在玻片的不同 部位壓幾次，在壓菌苔時應避免和玻片摩擦攪亂印痕，影響觀察。5 .將印片在燈焰上加熱固定，用石炭酸復紅染色1min,水洗，風干。6 .鏡檢。先用低倍鏡觀察，找到印痕，更換高倍鏡觀察，再用油鏡觀察放線菌的菌絲 體、抱子絲及抱子的形態(tài)，并繪圖。五、實驗結果繪圖描述放線菌形態(tài)六、思考題鏡檢時，

14、你如何區(qū)分放線菌的基內菌絲和氣生菌絲？實驗七霉菌個體、群體形態(tài)觀察一、目的要求掌握觀察霉菌形態(tài)的基本方法，并觀察其形態(tài)特征。二、實驗原理霉菌可產生復雜分枝的菌絲體，分基內菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲生長到一定階段 分化產生繁殖菌絲，由繁殖菌絲產生抱子。霉菌菌絲體 （尤其是繁殖菌絲）及抱子的形態(tài) 特征是識別不同種類霉菌的重要依據。霉菌菌絲和抱子的寬度通常比細菌和放線菌粗得 多（約為3-10Nm）,常是細菌菌體寬度的幾倍至幾十倍，因此，用低倍顯微鏡即可觀察。 觀察霉菌的形態(tài)有多種方法，常用的有下列三種：直接制片觀察法：是將培養(yǎng)物置于乳酸石炭酸棉藍染色液中，制成霉菌制片鏡檢。 此染色液制成的霉菌標本片具

15、特點是：（a）細胞不變形；（b）具有殺菌防腐作用，且不易 干燥，能保持較長時間；（c）溶液本身呈藍色，有一定染色效果。載玻片培養(yǎng)觀察法：此法是接種霉菌抱子于載玻片上的適宜培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后用顯 微鏡觀察。這種方法可觀察霉菌自然生長狀態(tài)下的形態(tài)。玻璃紙培養(yǎng)觀察法：為了得到清晰、完整、保持自然狀態(tài)的霉菌形態(tài)還可利用玻璃 紙透析培養(yǎng)法進行觀察。此法是利用玻璃紙的半透膜特性及透光性，將霉菌生長在覆蓋于瓊脂培養(yǎng)基表面的玻璃紙上，然后將長菌的玻璃紙剪取一小片， 貼放在載玻片上用顯 微鏡觀察。三、實驗器材曲霉（Aspergillus sp.）,青霉（Penicillium sp.）,根霉（Rhizopus s

16、p.）,孚L酸石 炭酸棉藍染色液，查氏培養(yǎng)基平板，無菌吸管，載玻片，蓋玻片，解剖針，銀子，濾紙 等。四、操作步驟（一）一般觀察法于潔凈載玻片上，滴一滴乳酸石炭酸棉藍染色液，用解剖針從霉菌菌落的邊緣處取 小量帶有抱子的菌絲置染色液中，再細心地將菌絲挑散開，然后小心地蓋上蓋玻片，注意不要產生氣泡。置顯微鏡下先用低倍鏡觀察，必要時再換高倍鏡。（二）載玻片觀察法1 .將略小于培養(yǎng)皿底內徑的濾紙放入皿內，再放上U形玻棒，具上放一潔凈的載玻片，然后將二個蓋玻片分別斜立在載玻片的兩端，蓋上皿蓋，把數套（根據需要而定）如此 裝置的培養(yǎng)皿疊起，包扎好，用 1.05 kg/cm2, 121.3 C滅菌20min或

17、干熱滅菌，備用。2 .將6-7 ml滅菌的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基倒入直徑為 9cm的滅菌平皿中，待凝固后, 無菌解剖刀切成0.5-1 cm2的瓊脂塊，用刀尖鏟起瓊脂塊放在已滅菌的培養(yǎng)皿內的載玻 片上，每片上放置2塊。3 .用滅菌的尖細接種針或裝有柄的縫衣針，取（肉眼方能看見的）一點霉菌抱子，輕輕點在瓊脂塊的邊緣上，用無菌銀子夾著立在載玻片旁的蓋玻片蓋在瓊脂塊上，再蓋上4 .在培養(yǎng)首喬皿的濾紙上，加無菌的20%甘油數毫升，至濾紙濕潤即可停加。將培養(yǎng)皿置 28 一定時間后，取出載玻片置顯微鏡下觀察。五、實驗結果繪圖說明你所觀察到的霉菌形態(tài)特征。六、思考題比較四種霉菌形態(tài)上的異同。10實驗八培養(yǎng)基的配制

18、及濕熱滅菌；玻璃器皿的干熱滅菌、目的要求1 .明確培養(yǎng)基配制的原理，掌握制備培養(yǎng)的基本技術。2.學習并掌握微生物實驗室常用的兩種滅菌方法濕熱滅菌法和干熱滅菌法、實驗原理人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產物的混合營養(yǎng)基質稱為培養(yǎng)基。和適基含有微生物所需的6大營養(yǎng)要素（水分、碳源、氮源、能源、礦質元素和生長素宜的pH、滲透壓及氧化還原電位等。設計和制作培研究微生物生命活動規(guī)律和利用微生物進行工業(yè)發(fā)酵生產必須的重要基礎工作。培成分與配比合適與否，對微生物生長發(fā)育、物質代謝、發(fā)酵產物積累和生產工藝都有很大影響。良好的培養(yǎng)基能充 分發(fā)揮菌種的生物合成能力，以達到最佳的生產效果；相反，若培養(yǎng)基成分、

19、配比或原 料不合適，菌種的生長繁殖及發(fā)酵效果就差。不同微生物的營養(yǎng)要求雖具有一定共性, 但也存在許多差別。只有根據微生物的營養(yǎng)理論，結合研究對象的特殊營養(yǎng)要求、代謝 特點及培養(yǎng)目的，才能設計或選擇出適宜的培養(yǎng)基。在實驗室中配制的適合微生物生長繁殖或累積代謝產物的任何營養(yǎng)基質，都叫做培 養(yǎng)基（Media）。由于各類微生物對營養(yǎng)的要求不同，培養(yǎng)目的和檢測需要不同，因而培劃分為若干類型。養(yǎng)基的種類很多。我們可根據某種標準，將種類繁多的培在微生物實驗室中常用滅菌消毒方法有:2 .干熱滅菌法：火焰滅菌（灼燒滅菌）、干熱滅菌3 .濕熱滅菌：巴氏消毒、煮沸消毒、高壓蒸汽滅菌、間歇加熱滅菌、實罐滅菌。4 .過

20、濾除菌5 .放射線滅菌其中，干熱天菌、高壓蒸汽滅菌方法主要是通過升溫使蛋白質變性從而達到殺死微 生物的效果PH三、實驗器材 1.器材：試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、11試紙、牛皮紙、記號筆、麻純、吸管、培養(yǎng)皿、電烘箱、銀子等2.試劑：牛肉膏、蛋白陳、NaCl、瓊脂等。四、操作步驟（一）培養(yǎng)及的配制稱量一溶化一調pH過濾一分裝一加塞一包扎一火菌一無菌檢查。1 .按照培的配方，稱取各種原料，依次加入使其溶解，最后補足所需水分。對蛋白陳、肉膏等物質，需加熱溶解，加熱過程所蒸發(fā)的水分，應在全部原料溶解后加水補足。配制固體培養(yǎng)基時，先將上述已配好的液體培養(yǎng)基煮沸，再將稱

21、好的瓊脂加入，繼續(xù)加熱至完全融化。并不斷攪拌，以免瓊脂糊底燒焦。2 .調節(jié)pH值。用pH試紙（或pH電位計、氫離子濃度比色計）測試培養(yǎng)基的pH '值,如不符合需要，可用10%HCl或10%NaOH進行調節(jié)，直到調節(jié)到配方要求的 pH值為止。3 .過濾用濾紙、紗布或棉花趁熱將已配好的培養(yǎng)基過濾。用紗布過濾時，最好折疊成六層,用濾紙過濾時，可將濾紙折疊成瓦棱形，鋪在漏斗上過濾。4 .分裝已過濾的培應進行分裝。如果要制作斜面培分裝于試分裝于錐形瓶內。管中。如果要制作平板培養(yǎng)基或液體、半固體培養(yǎng)基，則須將培分裝時，一手捏松彈簧夾，使培養(yǎng)基流出，另一只手握住幾支試管或錐形瓶，依次接取培養(yǎng)基。分裝

22、時，注意不要使培粘附管口或瓶口，以免浸濕棉塞引起雜菌污染。裝入試管的培量，視試管和錐形瓶的大小及需要而定。一般制作斜面培時，每只>22015M50毫米的試管，約裝34m1（1/41/3試管高度），如制作深層培養(yǎng)基，每只20 毫米的試管約裝1215ml。每只錐形瓶裝入的培養(yǎng)基，一般以其容積的一半為宜。5 .加棉塞。分裝完畢后，需要用棉塞堵住管口或瓶口。堵棉塞的主要目的是過濾空氣，避免彳染。棉塞應采用普通新鮮、干燥的棉花制作，不要用脫脂棉，以免因脫脂棉吸水使棉塞 無法使用。制作棉塞時，要根據棉塞大小將棉花鋪展成適當厚度， 揪取手掌心大小一塊, 鋪在左手拇指與食指圈成的圓孔中， 用右手食指插入

23、棉花中部，同時左手食指與姆指稍 稍緊握，就會形成1個長棒形的棉塞。棉塞作成后，應迅速塞入管口或瓶口中，棉塞應 緊貼內壁不留縫隙，以防空氣中微生物沿皺折侵入。棉塞不要過緊過松，塞好后，以手12 提棉塞、管、瓶不下落為合適。棉塞的 2/3應在管內或瓶內，上端露出少許棉花便于拔 取。塞好棉塞的試管和錐形瓶應蓋上厚紙用純捆札，準備滅菌。6 .制作斜面培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)基培養(yǎng)基滅菌后，如制作斜面培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)基， 須趁培養(yǎng)基未凝固時進行。 （1） 制作斜面培養(yǎng)基。在實驗臺上放 1支長0.51米左右的木條，厚度為1厘米左右。將 試管頭部枕在木條上，使管內培養(yǎng)基自然傾斜，凝固后即成斜面培養(yǎng)基。（2）制作平板

24、培養(yǎng)基。將剛剛滅過菌的盛有培養(yǎng)基的錐形瓶和培養(yǎng)皿放在實驗臺上，點 燃酒精燈，右手托起錐形瓶瓶底，左手拔下棉塞，將瓶口在酒精燈上稍加灼燒，左手打 開培養(yǎng)皿蓋，右手迅速將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿約倒入10ml,以鋪滿皿底為度。鋪放培養(yǎng)基后放置15min左右，待培養(yǎng)基凝固后，再 5個培養(yǎng)皿一疊，倒置過來，平 放在恒溫箱里，24h后檢查，如培養(yǎng)基末長雜菌，即可用來培養(yǎng)微生物。（二）干熱滅菌裝入待滅菌物品一升溫一恒溫一降溫一開箱取物。用干熱空氣滅菌的方法。常用的 設備是電熱干燥箱。其法是先將洗凈并晾干的玻璃器皿用包裝紙包裝好，置于干燥箱中（注意需滅菌的物品不要靠箱壁附近，不要過擠 ）。打開電源開關，調節(jié)

25、升溫旋鈕，使其 緩慢升溫至60-70C時，開動鼓風開關，鼓風 5-10min,以促使器皿上及干燥箱空間的 水氣排除。繼續(xù)轉動升溫旋鈕，使溫度升至160-170C,維持2h0控制溫度的方法是當箱內溫度升至160c時，應將溫度調節(jié)旋鈕緩慢地反方向轉動，當干燥箱上的指示燈紅 燈熄滅，綠燈亮時，再緩慢地來回轉動溫度調節(jié)旋鈕，使紅燈剛亮，綠燈剛滅處為止。 這樣，可繼續(xù)升溫約5-10C,即可將溫度控制在165-170Co紅燈是加熱升溫的信號， 綠燈是切斷加熱電源的信號。滅菌時間到了以后，將溫度調節(jié)旋鈕按反時針方向轉動至 “0”點。關閉電源開關，待其冷卻至 50c以下，方可取出滅菌器皿。絕對不可在高溫 時打

26、開箱門。另外，干熱滅菌時，定要專人看管，切勿同時干其他它事情，以免發(fā)生事 故。（三）高壓蒸汽滅菌加水一裝物品一加蓋一加熱一排冷空氣一加壓一恒壓一降壓回零一排汽一取物一 無菌檢查。在一個大氣壓下，蒸汽的溫度只能達到100C,當加壓時，隨壓力的增高溫度也上升到100c以上，根據這一原理設計了高壓滅菌罐。這是一個密閉的耐高壓高溫的金屬 容器，具有嚴密的蓋，容器內的蒸汽不能漏出。由于連續(xù)加熱，蒸汽不斷增加，因而滅13菌器內的壓力逐漸增大，同時也使容器內的溫度隨壓力而升高。使用高壓滅菌器進行滅菌時，當壓力上升到 2或3磅/英寸2（不得超過5磅/英寸2） 時，須緩緩打開氣門，排除器內的冷空氣，然后再關上氣

27、門，使器內的壓力再度升高。按規(guī)定要求進行滅菌。若冷空氣排不干凈時，則壓力雖達規(guī)定數字，而其內溫度卻實際 不足，會影響滅菌的效果。各種培養(yǎng)基、溶液、玻璃器皿、金屬器械、工作服、橡膠用品等均可用高壓滅菌器 滅菌。通常用15磅/英寸2（1.02公斤/厘米2）的壓力，在121.3C溫度下經15-20min 可殺死所有微生物及其芽抱，達到滅菌目的。被滅菌物品的容量過大時，可相應的延長 滅菌時間。五、實驗結果寫出你所用過的3-5種消毒滅菌方法。六、思考題1 .高壓蒸汽滅菌之前，為什么要將鍋內冷空氣排盡？滅菌完畢后，為什么待壓力降至 “0”才能打開排氣閥，開蓋取物？2 .在使用高壓蒸汽滅菌鍋時，如何杜絕一切

28、不安全的因素？14實驗九 微生物的分離和純化一、目的要求1 .學習但平板的方法。2 , 了解微生物分離和純化的原理。3,掌握常用的分離純化微生物的方法。二、實驗原理從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與 純化。本實驗采用平板分離法：該方法操作簡便，普遍用于微生物的分離與純化，具包 括兩個方面：1 .選擇適合于待分離微生物的生長條件，如營養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求，或 加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長， 而抑制其他微生物生長的環(huán)境，從而淘汰 些不需要的微生物。2 .微生物在固體培養(yǎng)基生長形成的單個菌落可以是一個細胞繁殖而成的集合體，因此 可通過挑取單菌落而

29、獲得一種純培養(yǎng)。獲得單個菌落的方法可通過稀釋涂布平板或平板 劃線等計數來完成的。值得指出的是，從微生物群體中經分離生長在平板上的單個菌落 并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結合顯微鏡檢 測個體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)要經過一系列分離與純化過程和多種 特征鑒定才能得到。純培養(yǎng)的確定：1 .確定其菌落觀察特征；2 .結合顯微鏡檢測個體形態(tài)特征的確定。、實驗材料151 .培養(yǎng)基：高氏I號培養(yǎng)基，無氮培養(yǎng)基，豆芽汁培養(yǎng)基，查氏瓊脂培養(yǎng)基2 .試劑：10%酚液，盛9ml無菌水的試管，鏈霉素和土樣3 .儀器或其它用具：無菌玻璃涂棒、無菌吸管、接種環(huán)、無菌培養(yǎng)皿、

30、顯微鏡、涂布四、方法步驟（一）流程：倒平板一制備梯度稀釋液一涂布（或劃線法）一培養(yǎng)一挑單菌落一保存。 平板涂布法1 .倒平板。將培養(yǎng)基加熱溶化待冷至 5560c時，分別倒平板，每種培養(yǎng)基倒 3-5皿 倒平板的方法：右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地撥出，試管或瓶口保持對著火焰；然后左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫， 迅速倒人培養(yǎng)基約15ml,加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部， 然后平置于桌面上，待凝后即為平板。2,制備土壤稀釋液。稱取土樣lg,放入盛10ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中， 振搖約20min ,使土樣與水充分混合，將細胞分

31、散。用一支 lml無菌吸管從中吸取1ml 土壤懸液加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌吸管從此試管中吸取 lml加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成 10-1、10-2、10-3、 10-4、10-5、10-6不同稀釋度的土壤溶液，注意：操作時管尖不能接觸液面，每一個稀 釋度換一支試管。3.涂布。將上述每種培養(yǎng)基的平板底面分別用記號筆寫上10-4、10-5和10-6三種稀 度，然后用無菌吸管分別由10-4、10-5和10-6三管土壤稀釋液中各吸取 0.1或0.2ml, 小心地滴在對應平板培養(yǎng)基表面中央位置,右手拿無菌涂棒平放在平板培養(yǎng)基表面上，將菌懸液先沿同心

32、圓方向輕輕地向外擴展，使之分布均勻。室溫下靜置 5l0min,使 菌液浸入培養(yǎng)基。4 .培養(yǎng)。將培養(yǎng)基平板倒置于28c溫室中培養(yǎng)35d,肉膏蛋白陳平板倒置于37c溫 室中培養(yǎng)23d5 .挑菌落。將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取少許細胞接種到上述三種培養(yǎng)基斜面上， 分別置28c和37c溫室培養(yǎng)。若發(fā)現有雜菌，需再一次進行分離、純化，直到獲得純 培養(yǎng)。16（二）平板劃線分離法名稱、樣品編號和實驗1 .倒平板。按稀釋涂布平板法倒平板，并用記號筆標明培 日期。2 .劃線。在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取上述10-1的土壤懸液一環(huán)在 平板上劃線。劃線的方法很多，但無論采用哪種方法，其目的都是通過

33、劃線將樣品在平 板上進行稀釋，使之形成單個菌落3 .培養(yǎng)4 .挑菌落實驗結果分別記錄并描繪四大類微生物生長情況和培養(yǎng)特征。六、思考題為什么要將培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)?17實驗十 理化因素對微生物的影響；生長譜法測定微生物營養(yǎng)要求一、目的要求1 . 了解常用化學藥品對微生物的作用。2 , 了解紫外線對微生物的作用。3 .學習生長譜法測定微生物營養(yǎng)要求的基本原理和方法。二、實驗原理 1、很多化學試劑有抑制或殺死微生物的作用 （抑菌劑、消毒劑），不同的微生物對不同 的化學消毒劑或抑菌劑的反應不同。止匕外，濃度、作用時間、環(huán)境條件不同，效果也不 相同。有些消毒劑在濃度極低的條件下，反而有刺激微生物的作用。故殺菌劑的濃度及 作用時間的確定是重要的，應試驗確定。2、日光是一種復色光，有殺菌作用，許多微生物在日光的直接照射下易于死亡。紫外 線對微生物也有明顯的致死作用。