標(biāo)準(zhǔn)溶液配制范例

1、實(shí)驗(yàn)一硫酸銅標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作一、目的與要求1、掌握分光光度比色法的基本原理和應(yīng)用；2、熟悉標(biāo)準(zhǔn)曲線的意義及掌握制作方法；3、了解光譜光度法技術(shù)的具體內(nèi)容及應(yīng)用；4、了解回歸分析法。二、原理光電比色法是根據(jù)溶液顏色深淺的比較來測(cè)定物質(zhì)含量的一種方法。因此，在原理上應(yīng)用了有色溶液對(duì)光吸收的物理定律即Lambert-Beer定律。常用的光電比色法：1 .標(biāo)準(zhǔn)曲線法：分析大批樣品時(shí)，采用此法比較方便，但需要事先制作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線 （或稱工作曲線），以供一段時(shí)間使用。配制一系列濃度由小到大的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在溶液吸收最大的波長(zhǎng)下，測(cè)出它們的吸光度。 在標(biāo)準(zhǔn)溶液的一定濃度范圍內(nèi)，溶液的濃度與其吸光度之間呈直線關(guān)系，

2、即被測(cè)物質(zhì)對(duì)光的吸收符合Lambert-Beer定律，則必然會(huì)得到一條通過原點(diǎn)白直線，即標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1）。以各標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度（A）為縱坐標(biāo)，在方格坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，測(cè)出的數(shù)據(jù)至少要有三個(gè)落在直線上，這樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線方可使用。比色測(cè)定待測(cè)樣品時(shí)， 操作條件應(yīng)與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)相同。 測(cè)出吸光度后，從標(biāo)準(zhǔn)曲線 上可以直接查出它的濃度，并計(jì)算出待測(cè)物質(zhì)以后只要測(cè)定條件不變， 將測(cè)出的樣品溶液吸 光訂值代入該回歸方程式，則可計(jì)算出樣品溶液的濃度。2 .標(biāo)準(zhǔn)管法（即標(biāo)準(zhǔn)比較法）：在相同的條件下，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)樣樣品溶液的有 色溶液，并測(cè)定它們的吸光度。由兩者

3、吸光度的比較，可以求出待測(cè)樣品溶液的濃度。待測(cè)樣品溶液的吸待測(cè)樣品溶液的濃度=X標(biāo)準(zhǔn)溶液的光度、標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度濃度3 .標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)法（即計(jì)算因數(shù)法）：此法較上兩法更為簡(jiǎn)單。將多次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光 度算出平均值后，按下式求出標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)系數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)液濃度=標(biāo)準(zhǔn)液吸光度4 .回歸分析法：將制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的各種標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的數(shù)值，與其相應(yīng)的吸光度值,用數(shù)理統(tǒng)計(jì)中的回歸分析法求出一個(gè)回歸方程式。以后只要測(cè)定條件不變，將測(cè)出的樣品溶液吸光度值代入該回歸方程式，則可計(jì)算出樣品溶液的濃度。三、操作與計(jì)算1 .硫酸銅貯備標(biāo)準(zhǔn)液的配制 （含銅量20000科g/ml ）:精確稱取 CuSO -5HO ,置于100

4、ml 燒杯中，用L硫酸溶解后，移入 500ml容量瓶中，用少量L硫酸沖洗燒杯3次，洗液一并轉(zhuǎn) 入容量瓶中，用L硫酸稀釋至刻度，將該液放置陰涼處，如發(fā)現(xiàn)沉淀混濁，應(yīng)重新配制。2 .應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)液的配制：用 5ml移液管，按下表要求，將硫酸銅貯備標(biāo)準(zhǔn)液用L硫酸在中號(hào)試管內(nèi)稀釋，搖勻，置陰涼處備用。用口應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)液濃度L硫酸（g/ml ）（20000 科 g/ ml, ml）（ml）110002200033000440003 .繪制硫酸銅標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別從編號(hào)試管中，吸取硫酸銅應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)液，加到光徑1cm的比色杯中。用分光光度計(jì)，以 L硫酸作空白調(diào)零點(diǎn)，在 690nm波長(zhǎng)處，測(cè)定1-4號(hào)試管中 溶液的吸光度（

5、A）;每一溶液重復(fù)測(cè) 3次，取其平均值，以各試管濃度為橫坐標(biāo)，各試管溶 液的吸光值為縱坐標(biāo)，用坐標(biāo)紙繪制出硫酸銅標(biāo)準(zhǔn)曲線。4 .未知硫酸銅溶液濃度的計(jì)算：取未知硫酸銅溶液加入比色杯中（若過濃可稀釋5-10倍），用分光光度計(jì)，在 690nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以此吸光度值可在硫酸銅標(biāo)準(zhǔn)曲線上查 出未知硫酸銅溶液的濃度。思考題：1 .標(biāo)準(zhǔn)曲線是如何設(shè)計(jì)的，有何臨床意義2 .未知硫酸銅溶液的濃度是如何求出的3 .何謂回歸分析法（庫(kù)熱西玉努斯）附：光譜光度法分析技術(shù)利用各種化學(xué)物質(zhì)所具有的發(fā)射、吸收或散射光譜譜系（帶、線）的特征，來確定該物質(zhì)的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和含量的技術(shù)稱為光譜光度分析技術(shù)。光譜光度分析技術(shù)

6、包括發(fā)射光譜分析、吸收光譜分析和散射光譜分析三大類，與其對(duì)應(yīng)的儀器列表如下（表 1）:表1光譜光度分析與其對(duì)應(yīng)的儀器光譜分析類型對(duì)應(yīng)儀器名稱1、各種攝譜儀發(fā)射光譜2、火焰光度法3、原子熒光光譜儀4、熒光比色計(jì)1、各種光電比色計(jì)吸收光譜2、各種可見光區(qū)及紫外光區(qū)分光光度計(jì)3、各種紅外光區(qū)分光光度計(jì)4、原子吸收分光光度計(jì)1、各種濁度計(jì)散射光譜2、各種乳光計(jì)3、各種生物光度計(jì)生物體內(nèi)有許多物質(zhì)成分含量甚微，不能用重量分析法或溶量分析法去測(cè)定，而常用比色法來測(cè)定，該法靈敏、迅速、準(zhǔn)確，是當(dāng)前常用的一種定量分析法。一、比色法原理在原理上應(yīng)用了有色溶透過光的強(qiáng)度就會(huì)減弱。透過光的減弱也越比色法是根據(jù)溶液顏

7、色深淺的比較來測(cè)定物質(zhì)含量的一種方法， 液對(duì)光吸收的物理定律一一Lambert-Beer定律。Lambert 定律：一束單色光線通過一有色溶液后， 由于溶液吸收了一部分光能, 若溶液的濃度不變，溶液的厚度越大（即在溶液中所經(jīng)過的途徑越長(zhǎng)） 顯著。若|0=光線通過溶液前的強(qiáng)度（入射光強(qiáng)度）I =光線通過溶液后的強(qiáng)度（透過光強(qiáng)度）b=溶液的厚度則常數(shù)K1的數(shù)值隨光線的波長(zhǎng)和溶液的性質(zhì)而改變。三國(guó)一 _Lo圖Lambert定律適用于一切溶液（圖2）。Beer氏定律:一束單色光線通過一有色溶液后，透過光線強(qiáng)度就會(huì)減弱。 若溶液的厚度不變， 則溶液的濃度越大，透過光線強(qiáng)度減弱就越顯著。若C咻液的濃度Be

8、er氏定律并非適用于一切溶液，有的溶液若濃度改變，溶質(zhì)的解離或聚合的程度也隨著改變。若兩種溶液是由同一種物質(zhì)配成，則ki= k2,合并及式：則得下式:式中 可用T表示，T稱為透光度。設(shè)A或OD稱為吸光度（或稱光密度或稱光密度），則有LogT=A （ODA=KCb依照式，以相同方法配制含有同一種物質(zhì)的兩種不同濃度的溶液，設(shè)標(biāo)準(zhǔn)液濃度為C,厚度為b i,未知液濃度為 G,厚度為b2,可以寫出以下兩式：標(biāo)準(zhǔn)液Ai=KCbi未知液A2=KaC2b2因溶液由同一物質(zhì)配成，所以K="。在比色時(shí)，溶液厚度是固定的（用同一規(guī)格比色杯，一般厚度為1cm）, bi=b2,用式除以式則得：未知液吸光度X

9、標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液 濃標(biāo)準(zhǔn)液吸光度求C2,則有：C =例：血糖測(cè)定實(shí)驗(yàn)中,x Ci =管用血量為，求i00ml血液中葡萄糖的毫克數(shù)標(biāo)準(zhǔn)液ml,操作中用了葡萄糖iml,測(cè)定測(cè)定管吸光血糖mg%標(biāo)準(zhǔn)管吸光數(shù)據(jù)度度x標(biāo)準(zhǔn)液實(shí)際含量x擴(kuò)大 100ml血所需xi00二、吸光度的測(cè)定當(dāng)一定波長(zhǎng)的光線透過溶液后，照射到光電池上，光電池可將光能轉(zhuǎn)變成電能， 產(chǎn)生光電流。產(chǎn)生光電流的大小可通過檢流計(jì)指針的偏移距離來表示。在比色計(jì)的刻度盤上， 可以直接讀出吸光度。三、光波波長(zhǎng)與濾光光線的本質(zhì)是電磁波的一種，有與電磁波和X線類同的性質(zhì)。光線有不同的波長(zhǎng)，肉眼可見彩色光稱為可見光， 波長(zhǎng)范圍在400750nm，小于400

10、nm的光線稱為紫外線， 大于750nm的光線稱為紅外線，如表所示（表2）。表2光波波長(zhǎng)與區(qū)帶光波波長(zhǎng)（入）望真空 (cm)100刀h-10-510007h 紫外-52X 1020004 近紫外4 X4000紫4200口. 藍(lán)4800 綠4900卅:黃5300多彳 橙6000紅7000£:近紅外-10-41 (1夕、中紅外-10-310 d多寧遠(yuǎn)紅外-10-2100科測(cè)定溶液介質(zhì)不同， 對(duì)光線有不同的吸收作用。 一種介質(zhì)僅對(duì)某一種波長(zhǎng)的光線具有最 大吸收能力，利用這種特性來測(cè)定該物質(zhì)的濃度最為靈敏。如果溶液中還有其它吸收光能的物質(zhì)存在時(shí)，可選用一定波長(zhǎng)濾光片， 讓這種物質(zhì)對(duì)此波長(zhǎng)吸收能

11、力最小，從而可以減少它的干擾作用。換言之，入射光為單色光為佳。表3濾光片選擇參考表入（nmi）濾光片顏色測(cè)定介質(zhì)顏色400435青紫黃綠435480藍(lán)黃480490藍(lán)綠桔紅490500綠藍(lán)紅500560綠紫560580綠黃藍(lán)紫580595黃藍(lán)595610桔紅藍(lán)綠610750紅綠藍(lán)為達(dá)到入射光為單色光之效果，在儀器制作時(shí)增加了選擇光源、單色器透鏡聚光、棱鏡色散、過狹縫等多個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)，以求達(dá)到其吸光度值與被測(cè)物質(zhì)含量呈正相關(guān)之最大準(zhǔn)確性。以72-1分光光度計(jì)為例介紹其結(jié)構(gòu)組成特點(diǎn)（圖 2-2）1、光源燈 2、透鏡聚光 3、色散棱鏡 4 、準(zhǔn)直鏡 5 和12、保護(hù)玻璃 6 、狹縫7、反射鏡 8、光欄 9 、聚光透鏡 10 、比色杯 11 、光門 12、光電管應(yīng)用電燈（鴇燈）射出的光通過三棱鏡折射到白紙上，色散成紅、橙、黃、綠、蘭、靛、 紫組成的一幅色譜，這就是發(fā)射光譜。不同的光源（如太陽燈、日光燈、氫燈、汞燈以及原 子與分子燃燒時(shí)所發(fā)射的光等）通過三棱鏡所色散出來的色譜是不同的，也就是說，它們有各自獨(dú)特的發(fā)射光譜。 因此，可以通過發(fā)射光譜來鑒別發(fā)光體