常用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量資料講解

1、常用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量精品資料6種方法測定蛋白質(zhì)含量一、微量凱氏（kjeldahl ）定氮法樣品與濃硫酸共熱。含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨（消化），氨又與硫酸作 用，變成硫酸氨。經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù) 此酸液被中和的程度可計(jì)算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例，其反應(yīng)式如 下：nh2ch2cooh+3h2so42co2+3so2+4h2o+nh3 2nh3+h2so4（nh4）2so4 （2）（nh4）2so4+2naoh2h2o+na2so4+2nh3 反應(yīng)（1）、（2）在凱氏瓶內(nèi)完成，反應(yīng)（3）在凱氏蒸儲(chǔ)裝置中進(jìn)行。為了加速消化，可以加入cuso4作催化劑，k

2、2so4以提高溶液的沸點(diǎn)。收集 氨可用硼酸溶液，滴定則用強(qiáng)酸。實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法這里從略。計(jì)算所得結(jié)果為樣品總氮量，如欲求得 樣品中蛋白含量，應(yīng)將總氮量減去 非蛋白氮即得。如欲進(jìn)一步求得樣品中蛋白質(zhì)的含量，即用樣品中蛋白氮乘以6. 25即得。二、雙縮月尿法（biuret法）（一）實(shí)驗(yàn)原理雙縮月尿（nh3conhconh3）是兩個(gè)分子月尿經(jīng)180c左右加熱，放出一個(gè)分子 氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮月尿與 cuso4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙 縮月尿反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能過一個(gè)中間碳原子 相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮月尿反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而

3、與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍為1-10mg蛋白質(zhì)。干擾這一測定的物質(zhì)主要有：硫酸俊、tris緩沖液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì) 少。主要的缺點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮月尿法常用于需要快速，但并不需要十分 精確的蛋白質(zhì)測定。（二）試劑與器材1 .試劑：僅供學(xué)習(xí)與交流，如有侵權(quán)請聯(lián)系網(wǎng)站刪除謝謝2精品資料（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清清蛋白（bsaj）或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白，配制成10mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，可用 bsa濃度1mg/ml的a280為0.66來校正其純度。如有需要，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法

4、測定蛋白氮含 量，計(jì)算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋 白用h2o或0.9%nacl配制，酪蛋白用 0. 05n naoh配制。（2）雙縮月尿試劑：稱以1.50克硫酸銅（cuso4?5h20和6.0克酒石酸鉀鈉（knac4h4o6?4h20 ,用500毫升水溶解，在攪拌下加入 300毫升10% naoh溶 液，用水稀釋到1升，貯存于塑料瓶中（或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可 長期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。2 .器材：可見光分光光度計(jì)、大試管15支、旋渦混合器等。（三）操作方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：取12支試管分兩組，分別加入0, 0.2, 0.4

5、, 0.6, 0.8, 1.0毫升的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用水補(bǔ)足到 1毫升，然后加入4毫升雙縮月尿試 劑。充分搖勻后，在室溫（2025C）下放置30分鐘，于540nm處進(jìn)行比色 測定。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照液。取兩組測定的平均 值，以蛋白質(zhì)的含量為橫座標(biāo)，光吸收值為縱座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、樣品的測定：取23個(gè)試管，用上述同樣的方法，測定未知樣品的蛋 白質(zhì)濃度。注意樣品濃度不要超過 10mg/mlo三、folin 一酚試劑法（lowry法）（一）實(shí)驗(yàn)原理這種蛋白質(zhì)測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應(yīng)用最廣泛的一種方 法，由于其試劑乙的配制較為困難（現(xiàn)在已可以訂購），近年來逐漸被考

6、馬斯 亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮月尿方法是相同的，只是加入了第二種試 劑，即folin一酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩 種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生 成復(fù)合物。folin一酚試劑中的磷鋁酸鹽一磷鴇酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙 氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鑰蘭和鴇蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色 深度與蛋白的量成正比。folin 一酚試劑法最早由lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測定的基本步驟。以后在 生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。這個(gè)測定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮月尿法靈 敏得多，缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長，要精確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不

7、是嚴(yán)格的直 線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。對雙縮月尿反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣 僅供學(xué)習(xí)與交流，如有侵權(quán)請聯(lián)系網(wǎng)站刪除 謝謝3精品資料 容易干擾lowry反應(yīng)。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸 俊、tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素(0.5%),硫酸納(1%),硝酸納(1%),三氯乙酸(0.5%),乙醇(5%),乙醴(5%),丙酮(0.5%)等溶液對顯色無影響，但這些物質(zhì)濃度 高時(shí)，必須作校正曲線。含硫酸俊的溶液，只須加濃碳酸鈉一氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后會(huì)色淺，則必須提高碳酸鈉一氫氧化鈉溶液的濃度12倍。進(jìn)行測定時(shí)，加f

8、olin 一酚試劑時(shí)要特別小心，因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性 ph條件 下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在 ph=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)folin 一酚試劑加到堿 性的銅一蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鋁酸 一磷鴇酸試劑被破壞 之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。此法可檢測的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5mg。通常測定范圍是20250mg。(二)試劑與器材1試劑(1)試劑甲：(a) 10克 na2co3, 2克 naoh和 0.25克酒石酸鉀鈉 (knac4h4o6?4h20 。 溶解于500毫升蒸儲(chǔ)水中。(b) 0.5克硫酸銅(cuso4?5h2o溶解于100毫升蒸儲(chǔ)水中，每次使用前， 將

9、50份(a)與1份(b)混合，即為試劑甲。(2)試劑乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克鴇酸鈉(na2wo4?2h2。，25克鋁酸鈉(na2moo4?2h2o及700毫升蒸儲(chǔ)水，再加 50毫 升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流 10小時(shí)， 回流結(jié)束時(shí)，加入150克硫酸鋰(li2s。4) , 50毫升蒸儲(chǔ)水及數(shù)滴液體澳，開 口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過量的澳。冷卻后溶液呈黃色(如仍呈綠色，須 再重復(fù)滴加液體澳的步驟)。稀釋至 1升，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保 存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)naoh滴定，酚吹作指示劑，然后適當(dāng)稀釋，約加水 1倍，使 最終的酸濃度為1n左右。(3

10、)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：精確稱取結(jié)晶牛血清清蛋白或g一球蛋白，溶于蒸 儲(chǔ)水，濃度為250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用 0.9%nacl 溶液。2.器材(1)可見光分光光度計(jì)(2)旋渦混合器(3)秒表僅供學(xué)習(xí)與交流，如有侵權(quán)請聯(lián)系網(wǎng)站刪除謝謝4精品資料（4）試管16支（三）操作方法1 .標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其 余試管分成兩組，分別加入 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0毫升標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶 液（濃度為250mg/ml）。用水補(bǔ)足到1.0毫升，然后每支試管加入5毫升試劑 甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫（2025C）

11、放置10分鐘。再逐管加入 0.5毫升試劑乙（folin一酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則 會(huì)使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照，于700nm處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫 座標(biāo)，吸光度值為縱座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意：因lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必須精確控制 時(shí)間，即第1支試管加入5毫升試劑甲后，開始計(jì)時(shí)，1分鐘后，第2支試管加 入5毫升試劑甲，2分鐘后加第3支試管，余此類推。全部試管加完試劑甲后若 已超過10分鐘，則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙，1分鐘后第2支試 管加入0.5毫升試劑乙

12、，2分鐘后加第3支試管，余此類推。待最后一支試管加 完試劑后，再放置30分鐘，然后開始測定光吸收。每分鐘測一個(gè)樣品。進(jìn)行多試管操作時(shí)，為了防止出錯(cuò)，每位學(xué)生都必須在實(shí)驗(yàn)記錄本上預(yù)先 畫好下面的表格。表中是每個(gè)試管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上 至下的順序，逐管加入。最下面兩排是計(jì)算出的每管中蛋白質(zhì)的量（微克）和 測得的吸光度值。folin一酚試劑法實(shí)驗(yàn)表管號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0（250mg/ml）未知蛋白質(zhì)0.2 0.4 0.6（約 250mg/ml）蒸儲(chǔ)水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2

13、 0 0.8 0.6 0.4試齊 I甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0試齊 I乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5每管中蛋白質(zhì)的量（mg）吸光度值（a7002 .樣品的測定：取1毫升樣品溶液（其中約含蛋白質(zhì)20250微克），按上 述方法進(jìn)行操作，取1毫升蒸儲(chǔ)水代替樣品作為空白對照。通常樣品的測定也僅供學(xué)習(xí)與交流，如有侵權(quán)請聯(lián)系網(wǎng)站刪除 謝謝5精品資料 可與標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定放在一起，同時(shí)進(jìn)行。即在標(biāo)準(zhǔn)曲線測定的各試管后面， 再增加3個(gè)試管。如上表中的8、9、10試管。根據(jù)所測樣品的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查

14、出相應(yīng)的蛋白質(zhì)量，從而計(jì)算 出樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度。注意:由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨 不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測定法通常只適用于測定蛋白質(zhì)的相對濃度（相 對于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）。四、改良的簡易folin 一酚試劑法（一）試劑1.試劑甲：堿性銅試劑溶液中，含 0.5n naoh 10%na2co& 0.1%酒石酸鉀 和0.05%硫酸銅，配制時(shí)注意硫酸銅用少量蒸儲(chǔ)水溶解后，最后加入。 2.試劑 乙：與前面的基本法相同。臨用時(shí)加蒸儲(chǔ)水稀釋 8倍。3.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：同基本法。（二）操作步驟測定標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品溶液的操作方法與基本法相同。只是試劑甲改為 1毫 開，室

15、溫放置10分鐘后，試劑乙改為4毫升。在55。叵溫水浴中保溫5分鐘。 用流動(dòng)水冷卻后，在660nm下測定其吸光度值。改良的快速簡易法，可獲得與folin一酚試劑法（即lowry基本法）相接近 的結(jié)果。五、考馬斯亮蘭法（bradford 法）（一）實(shí)驗(yàn)原理雙縮法（biuret法）和folin 一酚試劑J法（lowry法）的明顯缺點(diǎn)和許多限 制，促使科學(xué)家們?nèi)ふ腋玫牡鞍踪|(zhì)溶液測定的方法。1976年由bradford建立的考馬斯亮蘭法（bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與 染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu) 點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋

16、白質(zhì)測定法。考馬斯亮蘭g-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收 峰的位置（lmax）,由465nm變?yōu)?95nm,溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。 經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族 氨基酸殘基相結(jié)合。僅供學(xué)習(xí)與交流，如有侵權(quán)請聯(lián)系網(wǎng)站刪除謝謝6精品資料在595nm下測定的吸光度值A(chǔ)595,與蛋白質(zhì)濃度成正比。bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是：(1)靈敏度高，據(jù)估計(jì)比lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達(dá) 1mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)染料復(fù)合 物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比lowry法要

17、大的多。(2)測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測定，只需要 5 分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因 而完全不用像lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。(3)干擾物質(zhì)少。如干擾lowry法的k+、na+、mg2+離子、tris緩沖液、 糖和蔗糖、甘油、琉基乙醇、edta等均不干擾此測定法。此法的缺點(diǎn)是：(1)由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此 bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用 g一球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏

18、差。(2)仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、tritonx-100、十二烷基硫酸鈉(sds)和0.1n的naoh。(如同0.1n的酸干擾lowary法 一樣)。(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。(二)試劑與器材1 .試劑：(1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用g一球蛋白或牛血清清蛋白(bsa),配制成 1.0mg/ml和0.1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。(2)考馬斯亮蘭g250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭g250,溶于 50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀釋至1升。2 .器材：(1)可見

19、光分光光度計(jì)(2)旋渦混合器(3)試管16支(三)操作方法1 .標(biāo)準(zhǔn)方法(1)取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分為兩組按 表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液給各試僅供學(xué)習(xí)與交流，如有侵權(quán)請聯(lián)系網(wǎng)站刪除謝謝7精品資料 管分別加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml,然后用無離子水補(bǔ)充到 0.1ml。最后各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭g250試劑，每加完一管，立 即在旋渦混合器上混合(注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除)。未知樣品的加樣量見下表中的第 8、9、10管。(2)加完試劑2-5分鐘后，即可

20、開始用比色皿，在分光光度計(jì)上測定各樣 品在595nm處的光吸收值a595,空白對照為第1號(hào)試管，即0.1mlh2o力口 5.0mlg250 試劑。注意：不可使用石英比色皿(因不易洗去染色)，可用塑料或玻璃比色 皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙 醇或丙酮長時(shí)間浸泡?？捡R斯亮蘭法實(shí)驗(yàn)表管號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10(1.0mg/ml)未知蛋白質(zhì)0.02 0.04 0.06(約 1.0mg/ml)蒸儲(chǔ)水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08

21、0.06 0.04考馬斯亮藍(lán)g 250 試齊1J 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0每管中的蛋白質(zhì)量(mg)光吸收值(a595)(3)用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量(mg)為橫座標(biāo)，用吸光度值a595為縱座標(biāo)，作 圖，即得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測出的未知樣品的a595值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的a595約為0.50。2 .微量法當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)濃度較稀時(shí)(10100mg/ml),可將取樣量(包括補(bǔ)加的 水)加大到0.5ml或1.0ml,空白對照則分別為0.5ml或1.0ml h2o,考馬斯亮藍(lán)g 250試劑仍加5.0m

22、l,同時(shí)作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定 595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的a595約為0.29。六、紫外吸收法蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共腕雙鍵，使 蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在 280nm處，其吸光度(即光密度僅供學(xué)習(xí)與交流，如有侵權(quán)請聯(lián)系網(wǎng)站刪除 謝謝8精品資料值）與蛋白質(zhì)含量成正比。止匕外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系， 可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定。紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃 度的鹽，例如生化制備中常用的（nh4） 2so4

23、等和大多數(shù)緩沖液不干擾測定。特 別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測，因?yàn)榇藭r(shí)只需測定蛋白質(zhì)濃度的變 化，而不需知道其絕對值。此法的特點(diǎn)是測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線 法測定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋 白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白 質(zhì)。若樣品中含有喋吟、喀噬及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干 擾。核酸的干擾可以通過查校正表，再進(jìn)行計(jì)算的方法，加以適當(dāng)?shù)男Ｕ?。?是因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過校正，測定的結(jié) 果還是存在一定的誤差。此外，進(jìn)行紫外吸收法測定時(shí)，由于蛋白質(zhì)吸

24、收高峰常因ph的改變而有變化，因此要注意溶液的ph值，測定樣品時(shí)的ph要與測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的ph相一 致。下面介紹四種紫外吸收法：1.280nm的光吸收法因蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具有最大吸收，且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值是最常用的紫外吸收法。測定時(shí)，將待測蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑 （水或緩沖液）作空白對照，在紫外分光度計(jì)上直接讀取280nm的吸光度值a280。蛋白質(zhì)濃度可控制在0.11.0mg/ml左右。通常用1cm光徑的標(biāo)準(zhǔn)石英 比色皿，盛有濃度為1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液時(shí)，a280約

25、為1.0左右。由此可立即 計(jì)算出蛋白質(zhì)的大致濃度。許多蛋白質(zhì)在一定濃度和一定波長下的光吸收值（a1%1cm）有文獻(xiàn)數(shù)據(jù) 可查，根據(jù)此光吸收值可以較準(zhǔn)確地計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。下式列出了蛋白質(zhì)濃度 與（a1%1cm）值（即蛋白質(zhì)溶液濃度為1%,光徑為1cm時(shí)的光吸收值）的關(guān) 系。文獻(xiàn)值a1% 1cm,?W為百分吸收系數(shù)或比吸收系數(shù)。蛋白質(zhì)濃度=（a280 ' 10 ）/ a11cm,280nm （mg/ml）（q 1% 濃度？10mg/ml）例：牛血清清蛋白：a1%1cm=6.3 （280nm）溶菌酶： a1%1cm=22.8 （280nm）僅供學(xué)習(xí)與交流，如有侵權(quán)請聯(lián)系網(wǎng)站刪除 謝謝9精品資

26、料若查不到待測蛋白質(zhì)的a1%1cm值，則可選用一種與待測蛋白質(zhì)的酪氨酸 和色氨酸含量相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行測定。標(biāo)準(zhǔn)蛋 白質(zhì)溶液配制的濃度為1.0mg/ml。常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為牛血清清蛋白（bsa）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：取6支試管，按下表編號(hào)并加入試劑：管號(hào) 1 2 3 4 5 6bsa （1.0mg/ml）0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0h2o 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0a280用第1管為空白對照，各管溶液混勻后在紫外分光光度計(jì)上測定吸光度 a280,以a280為縱座標(biāo)，各管的蛋白質(zhì)濃度或蛋白質(zhì)量（mg）為橫座標(biāo)作 圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)為直線，利用此標(biāo)準(zhǔn)

27、曲線，根據(jù)測出的未知樣品的a280值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量，也可以用2至6管a280值與相應(yīng)的試管中的蛋白質(zhì)濃度計(jì)算出該蛋白質(zhì)的 a1% 1cm,280nm2. 280nm和260nm的吸收差法核酸對紫外光有很強(qiáng)的吸收，在 280nm處的吸收比蛋白質(zhì)強(qiáng)10倍（每 克），但核酸在260nm處的吸收更強(qiáng)，其吸收高峰在 260nm附近。核酸260nm 處的消光系數(shù)是280nm處的2倍，而蛋白質(zhì)則相反，280nm紫外吸收值大于 260nm的吸收值。通常：純蛋白質(zhì)的光吸收比值：a280/a260 ? 1.8純核酸的光吸收比值：a280/a260 ? 0.5含有核酸的蛋白質(zhì)溶液，可分別測定其a28

28、0和a260,由此吸收差值，用下面的經(jīng)驗(yàn)公式，即可算出蛋白質(zhì)的濃度。蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.45 a280 0.74 a260此經(jīng)驗(yàn)公式是通過一系列已知不同濃度比例的蛋白質(zhì)（酵母烯醇化酶）和 核酸（酵母核酸）的混合液所測定的數(shù)據(jù)來建立的。3. 215nm與225nm的吸收差法蛋白質(zhì)的稀溶液由于含量低而不能使用 280nm的光吸收測定時(shí)，可用 215nm與225nm吸收值之差，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法來測定蛋白質(zhì)稀溶液的濃度。用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，配制成 20100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白質(zhì) 溶液，分別測定215nm和225nm的吸光度值，并計(jì)算出吸收差：吸收差 d= a215 a225以吸收差d為縱座標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫座標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。再測出未知 樣品的吸收差，即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。僅供學(xué)習(xí)與交流，如有侵權(quán)請聯(lián)系網(wǎng)站刪除 謝謝10精