醫(yī)學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)實驗指導(dǎo)

1、 醫(yī)學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)實驗 實驗?zāi)康暮鸵笠?、實驗前?wù)必做好預(yù)習(xí)，明確實驗?zāi)康?、?nèi)容及理論依據(jù)等，避免或減少錯誤的發(fā)生，以保證實驗在預(yù)期內(nèi)完成。二、實驗操作嚴(yán)格按要求進行，嚴(yán)防污染和感染。三、對示教實驗聯(lián)系理論認(rèn)真觀察。對光鏡下標(biāo)本不得擅自挪動視野，其他示教標(biāo)本看后必放回原處。對錄像教學(xué)應(yīng)作重點、簡要的筆記。四、客觀真實地記錄實驗結(jié)果并進行分析，若與理論不符，要加以分析討論，找出原因，必要時重復(fù)實驗。五、在規(guī)定時間內(nèi)完成實驗報告，報告要求字跡清楚，說明問題簡單扼要。 實驗室規(guī)則1. 非實驗必需品禁止帶入實驗室。2. 穿白大衣，按規(guī)定就坐。3. 實驗室應(yīng)保持安靜和良好的秩序，不得高聲談笑、亂動物

2、品或隨便走動。4. 實驗室內(nèi)嚴(yán)禁吸煙、進食、飲水或用嘴濕潤鉛筆和標(biāo)簽等，也不要用手搔抓撫摸機體。5. 實驗時若不慎發(fā)生皮膚創(chuàng)傷，或病原菌污染衣物、卓（地）面等事故，應(yīng)立即報告指導(dǎo)老師，進行緊急處理。6. 實驗所用的玻片、試管、吸管等，用后應(yīng)隨即投放盛有消毒劑的指定容器內(nèi)，不得放在桌上，也不可在水池中沖洗。7. 每次實驗完畢，按實驗要求應(yīng)及時清理實驗物品，清掃衛(wèi)生；離開實驗室時，消毒洗手后離開實驗室；對白大衣經(jīng)常清洗消毒。 油鏡的使用和維護目的：掌握油鏡的使用與維護，熟悉油鏡的使用原理。材料：顯微鏡，拭鏡紙，液體石蠟油，二甲苯原理：油鏡的透鏡極小，工作焦距最短，光線通過玻璃和空氣，由于介質(zhì)密度不

3、同發(fā)生折射，射入鏡筒的光線極少，視野暗，物象不清晰。如在玻片與鏡頭（透鏡）之間加上折光率和玻片（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515）就可減少光線的折射，加強視野的亮度，獲得清晰的物象。步驟：顯微鏡油鏡的使用和維護1.將顯微鏡平穩(wěn)地安放在實驗臺適宜處。識別油鏡頭：標(biāo)有100×、OIL、HI等字樣。2. 打開電源，用低倍鏡對光，打開光圈，調(diào)節(jié)聚光鏡的位置，使視野光線充足。3. 標(biāo)本上加鏡油一滴，轉(zhuǎn)動粗螺旋，使油鏡頭緩緩下降，用眼從側(cè)面觀察，直到油鏡頭浸入油中接近玻片為止。 4. 從目鏡觀察，同時徐徐轉(zhuǎn)動粗螺旋提升，見模糊物象后再用細(xì)螺旋調(diào)節(jié)，直到見到清晰物象為止。5. 觀察完畢，

4、粗螺旋提高鏡頭，取下標(biāo)本片，油鏡頭使用后立即用擦鏡紙擦凈鏡頭上的油。如油已干，可在擦鏡紙上滴少許二甲苯擦拭，并立即用另一擦鏡紙擦去二甲苯，因二甲苯能溶解鏡頭上的固定膠以致使鏡頭脫落。6.將鏡頭轉(zhuǎn)呈“八”字，調(diào)低聚光器，對號送入柜子內(nèi)存放。 革蘭染色目的：掌握革蘭染色的原理及操作。材料：干凈玻片，接種環(huán)，葡萄球菌和大腸桿菌18-24h培養(yǎng)后的混合菌液，酒精燈，一套革蘭染液原理：主要為細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異。G+三維肽聚糖結(jié)構(gòu)的交聯(lián)度大，通透性低，脂質(zhì)少或無，酒精作用使孔徑縮?。欢鳪-肽聚糖為二維疏松結(jié)構(gòu)，薄，外膜含大量脂質(zhì)，易被酒精溶解，使細(xì)胞壁通透性增高，結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被酒精溶解而脫色。步驟：1.

5、 細(xì)菌標(biāo)本的制作（1）涂片：無菌操作。取一接種環(huán)混合細(xì)菌懸液，涂布成直徑約1cm的涂片，涂片應(yīng)薄而均勻。（2）干燥：涂片最好在室溫中自然干燥。必要時可將標(biāo)本面向上，放在酒精燈上方微火處干燥。（3）固定：標(biāo)本面向上，在酒精燈火焰外焰按鐘擺的速度來回通過3次，放置待冷后染色。固定的目的是殺死細(xì)菌，使細(xì)菌與玻片黏附較牢固。菌體蛋白質(zhì)變性后，提高與染料的親和力。2. 革蘭染色 （1）初染：滴加結(jié)晶紫染液1-2滴于涂片上，1min鐘后用自來水緩緩沖洗。（2）媒染：滴加碘液1-2滴，1min后用自來水緩緩沖洗。（3）脫色：加95%酒精數(shù)滴，擺動玻片使酒精與細(xì)菌充分接觸，約20-30s后，立即用自來水緩緩沖

6、洗。（4）復(fù)染：滴加稀釋碳酸品紅液，30-60s后，自來水緩緩沖洗。用吸水紙吸干后，用油鏡觀察。鏡檢后，載片放入消毒缸。 細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)的觀察目的：觀察并掌握細(xì)菌的形態(tài)及特殊結(jié)構(gòu)。材料：細(xì)菌鞭毛、芽孢、莢膜的標(biāo)本片；革蘭陽性菌、革蘭陰性菌染色標(biāo)本片示教：革蘭陽性菌：葡萄球菌，紫色革蘭陰性菌：大腸桿菌，紅色細(xì)菌鞭毛細(xì)菌芽孢細(xì)菌莢膜 細(xì)菌的分布目的：了解細(xì)菌在自然界中的分布情況。材料： 普通瓊脂平板培養(yǎng)基、血平板、鑷子、無菌棉拭子、革蘭染液。操作步驟：1.空氣中細(xì)菌的檢查（1）采用沉降法：取普通瓊脂平板培養(yǎng)基1只，任意置一處，啟蓋約15分鐘，再蓋上，37培養(yǎng)24小時，觀察有無細(xì)菌生長。 （2）結(jié)果判

7、定：培養(yǎng)基表面可見多種大小、形態(tài)不一的菌落。2. 皮膚表面細(xì)茵檢查(1)采用涂抹法: 先在平板底面用記號筆分成兩區(qū)，作標(biāo)記，將未消毒的手指在平板的12處表面輕輕涂抹劃線，然后用碘酒、乙醇擦拭手指皮膚，用消毒后的手指在平板另一12處進行涂抹，操作完畢，置37培養(yǎng)24小時后，取出觀察結(jié)果。(2)結(jié)果判定：培養(yǎng)基表面有幾種大小及形態(tài)不同的菌落生長，注意比較消毒前后細(xì)菌的生長情況。 3.咽喉部細(xì)茵檢查(1)用無菌棉拭子在咽喉部涂抹后，涂在血平板上，并劃線分離，37oC培養(yǎng)24小時后觀察結(jié)果。注意觀察平板上菌落種類以及是否有溶血現(xiàn)象，并可挑取菌落進行革蘭染色檢查。口腔微生物檢查也可用無菌牙簽直接挑取少量

8、牙垢，制成涂片，進行革蘭染色檢查。(2)結(jié)果判定：血平板表面有大小和形態(tài)不同的菌落，有的菌落周圍可見溶血環(huán)。牙垢涂片鏡檢可見革蘭陽性菌和革蘭陰性菌。 紫外線殺菌實驗?zāi)康模赫莆兆贤饩€殺菌的原理，熟悉紫外線殺菌實驗的操作。材料：大腸桿菌，瓊脂平板，無菌回形狀紙片，接種環(huán)，鑷子，紫外燈.原理：紫外線波長范圍為240280nm,最適的波長為260nm，這與DNA吸收光譜范圍相一致。其殺菌原理是紫外線易被核蛋白吸收，使DNA的同一條螺旋體上相鄰的堿基形成胸腺嘧啶二聚體，從而干攏DNA的復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)菌死亡或變異。紫外線特點：紫外線的穿透能力弱，不能通過普通玻璃、塵埃。步驟：1.平板密集劃線接種。2.在平板

9、上貼無菌回形紙片。3.UV照射30min（打開平板蓋子）。4.取出回形紙，將回形紙放入消毒缸中。5.37培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。 培養(yǎng)基配制目的：掌握細(xì)菌生長的營養(yǎng)成分。熟悉培養(yǎng)基的配制。材料：培養(yǎng)基配制的原材料示教：培養(yǎng)基配制過程。 細(xì)菌代謝產(chǎn)物觀察和生長現(xiàn)象目的：掌握細(xì)菌代謝產(chǎn)物的檢測和結(jié)果的判斷。熟悉細(xì)菌在各種培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象。材料：各種生化管，大腸桿菌、傷寒桿菌、產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌等。原理：不同菌的酶系統(tǒng)不同，對底物的代謝產(chǎn)物也不同，用生化的實驗方法可將產(chǎn)物檢測出來，從而對細(xì)菌鑒定。步驟：一、細(xì)菌代謝產(chǎn)物觀察1. 糖發(fā)酵實驗 將大腸桿菌、傷寒桿菌分別接種在葡萄糖發(fā)酵管內(nèi)，37培養(yǎng)18-

10、24h進行觀察。培養(yǎng)基中指示劑為溴甲酚紫。如能分解葡萄糖，則產(chǎn)酸，培養(yǎng)基由原來的紫色變?yōu)辄S色，記錄符合為“+”。如同時還產(chǎn)生氣體，則其中倒置的小管中有氣泡出現(xiàn)，記錄符合為“”。如能分解乳糖，則產(chǎn)酸，培養(yǎng)基由原來的紫色變?yōu)辄S色，記錄符合為“+”。如同時還產(chǎn)生氣體，則其中倒置的小管中有氣泡出現(xiàn)，記錄符合為“”。如培養(yǎng)基未變色，仍為紫色，則表明細(xì)菌不能分解乳糖不能分解乳糖。記錄符合“-”。2.枸櫞酸鹽利用實驗該培養(yǎng)基中提供的唯一碳源是枸櫞酸鈉。指示劑是澳麝香草酚蘭。分別接種大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌，37培養(yǎng)24h進行觀察.若斜面有菌落出現(xiàn)，培養(yǎng)基由原來的綠色變?yōu)樯钐m色，表明細(xì)菌能利用枸櫞酸鈉，記錄符合“+

11、”，反之“-”。3.靛基質(zhì)吲哚產(chǎn)生實驗?zāi)墚a(chǎn)生色氨酸酶的細(xì)菌，可分解蛋白胨水培養(yǎng)基中的色氨酸，產(chǎn)生靛基質(zhì)。將大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌分別接種在蛋白胨水培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)48h后，每管各加吲哚試劑（對二甲基氨基苯甲醛）3-4滴，若出現(xiàn)紅色化合物-玫瑰色吲哚，表明靛基質(zhì)產(chǎn)生陽性“+”；反之為陰性：“-”。4. 硫化氫產(chǎn)生實驗有的細(xì)菌能分解含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸）產(chǎn)生硫化氫。將大腸桿菌和變形桿菌分別接種在這樣的培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)18-24h。若培養(yǎng)基中出現(xiàn)黑色沉淀物即為陽性“+”，表明產(chǎn)生的硫化氫與培養(yǎng)基中的鉛鹽(或鐵鹽)結(jié)合，生成黑色的硫化鉛（或硫化鐵）。二、細(xì)菌生長現(xiàn)象1、在液體培養(yǎng)基上生長情況

12、(1)表面生長：液體清晰，細(xì)菌生長在液面形成菌膜。如枯草桿菌。 (2)混濁生長：液體均勻混濁，或有少量沉淀。如大腸埃希菌。 (3)沉淀生長：液體清晰，細(xì)菌生長在管底，形成沉淀。如鏈球菌。2、在固體培養(yǎng)基上的生長情況 (1)菌苔：在瓊脂斜面培養(yǎng)基上長成菌苔。(2)菌落：在平板上形成肉眼可見的細(xì)菌集團，稱為菌落。觀察時要注意菌落的大小、形狀、表面形狀、邊緣是否整齊、透明度、顏色等，可作為鑒別細(xì)菌的依據(jù)之一。(3)色素：水溶性色素和脂溶性色素。3、在半固體培養(yǎng)基上的生長情況 有鞭毛的細(xì)菌，由于能運動，在半固體培養(yǎng)基內(nèi)沿穿刺線彌漫性生長，使穿刺線變得模糊不清。無鞭毛的細(xì)菌，因為不能運動，接種生仍沒穿刺

13、生長，穿刺線與周圍界限清楚。 高壓蒸汽滅菌目的：掌握高壓蒸汽滅菌的原理及應(yīng)用范圍，了解高壓蒸汽滅菌的操作。材料：高壓蒸汽滅菌器。原理：高壓蒸氣滅菌器是一種堅固密閉的蒸鍋，鍋蓋上裝有壓力計、安全閥及排氣孔等。鍋蓋密閉旋緊后由鍋底加熱，因蒸氣不能外溢，可使鍋內(nèi)壓力逐漸增高，從而提高了鍋內(nèi)水的沸點和蒸氣的溫度。由于高壓蒸氣的溫度較高，放出潛熱多，熱力穿透能力較強，故其滅菌效能最好。凡能耐熱和耐潮濕的物品如培養(yǎng)基、生理鹽水、紗布、玻璃器材等都可以應(yīng)用此法消毒滅菌。講解（示教）高壓蒸汽滅菌器的主要構(gòu)件：一個能密閉的耐高壓的雙層金屬圓筒，蒸汽壓力計，安全閥，排氣閥等。步驟：1.先向外筒注入一定量水，需滅菌

14、物品裝入內(nèi)筒，不宜擁擠，以便蒸汽充分回旋。把筒蓋擰緊蓋嚴(yán)，打開排氣閥，開始加熱。2. 水沸騰后，排氣閥打開排出氣體，待排氣孔急促排出蒸汽，表明冷空腔已排盡，關(guān)閉排氣閥，此時筒內(nèi)壓力逐漸上升。3. 待壓力達到所需值時，適時調(diào)節(jié)熱源，使維持一定時間。一般為15磅，溫度121.3，維持15-30min。4. 滅菌達到所需時間后，關(guān)閉熱源，自然降壓（溫），待壓力表指針降至“0”時，方可開蓋取物。注意事項：1.器內(nèi)的水量適當(dāng)。2.放入的物品不擁擠。3.排盡冷空氣。4. 待壓力表指針降至“0”時，方可開蓋。 凝集實驗（玻片法）目的：掌握抗原抗體反應(yīng)的基本原理和特異性，熟悉凝集反應(yīng)的操作。材料：傷寒桿菌AF

15、群O多價血清、志賀氏痢疾多價血清、生理鹽水、未知菌、玻片。原理：顆粒性抗原（凝集原）與相應(yīng)的抗體（凝集素）直接結(jié)合，在一定的條件下形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象。如紅細(xì)胞ABO血型的測定，測定細(xì)菌的細(xì)菌凝集實驗。步驟：1.取清潔載物玻片一張，用蠟筆劃為三格，并注明號碼。于第一格和第二格內(nèi)各加約30ul傷寒桿菌AF群O多價血清及志賀氏痢疾多價血清，第三格內(nèi)滴加約30ul生理鹽水。2. 用接種環(huán)挑取待檢菌種少許，分別均勻地涂抹于1、2、3格內(nèi)的液體中。接種環(huán)每次使用前后均需經(jīng)酒精燈火焰燒灼滅菌。3. 輕輕搖動玻片，數(shù)分鐘后用肉眼觀察結(jié)果，出現(xiàn)灰白色凝集顆粒者即為陽性反應(yīng)；仍為均勻混懸液者為陰性反應(yīng)。如結(jié)果

16、不夠清晰，可將玻片放于低倍顯微鏡下觀察。 沉淀反應(yīng)（雙擴散）目的：掌握抗原抗體反應(yīng)的基本原理和特異性，熟悉沉淀反應(yīng)的操作。材料：干凈玻片，玻璃蠟筆、打孔器、微量加樣器、正常人血清IgG、羊抗人IgG原理：將抗原與抗體分別加到電解質(zhì)凝膠板相鄰的兩孔中，抗原與抗體雙方自由擴散，在最適當(dāng)比例處形成抗原抗體復(fù)合物（沉淀線）。步驟：1.制板：取干凈玻片一片，用蠟筆分為三格，用吸管將45ml加熱溶化的1.5%食鹽瓊脂充盈中格，制備瓊脂板。2. 打孔：待瓊脂板凝固后，用打孔器打孔?？组g距約為5mm。3. 封底：將打好孔的瓊脂板凝板過火焰三次。4. 加樣：用微量加樣器在三孔中加入生理鹽水，正常人血清IgG和馬

17、抗人IgG。每孔加入約10l。注意：加樣時勿使液體溢出和孔內(nèi)出現(xiàn)氣泡。5. 擴散：將瓊脂板放入濕盤內(nèi)，置37溫箱中（均保持水平位置），于24小時后觀察結(jié)果。 ELISA（乙肝病毒表面抗原的檢測）目的：掌握ELISA的原理，用途，熟悉其操作過程。材料：乙肝病毒表面抗原的檢測試劑盒、待檢血清、微量加樣器等。原理：將酶與抗體（或抗原）用交聯(lián)劑結(jié)合起來，此種酶結(jié)合物能與相應(yīng)的抗原（或抗體）發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，形成酶-抗原抗體大分子復(fù)合物，此時再加入酶底物，底物被酶催化生成有色產(chǎn)物，最后借助反應(yīng)體系的顏色變化及呈色深淺來推斷樣品中檢測對象的有無或含量。步驟：1加待檢患者血清：0.05ml /孔，并設(shè)HB

18、sAg陽性對照2孔，HBsAg陰性對照2孔，空白對照1孔。2加HBsHRP：0.05ml /孔，空白對照不加，充分混勻，置37 30min。3洗板：棄去反應(yīng)板孔內(nèi)液體，拍干；用洗滌液注滿各孔，靜置510sec，棄去孔內(nèi)洗滌液，拍干，如此反復(fù)5次，拍干。4加顯色劑：先加顯色劑A，0.05ml /孔；再加顯色劑B，0.05ml /孔；充分混勻，置37 避光15min。5終止反應(yīng)：每孔加終止液0.05ml /孔，混勻。6測定：1）目測法：與陽性和陰性對照比較，觀察顏色深淺作出判斷2）用酶標(biāo)儀讀取各孔OD值。 藥敏實驗(紙片法)目的：掌握紙片法藥敏實驗方法，熟悉微生物培養(yǎng)，了解抗生素對細(xì)菌的作用機制。

19、了解含藥紙片的制備材料：大腸埃希菌，普通瓊脂培養(yǎng)基，無菌鑷子，打孔器(直徑6cm)，抗生素紙片。原理：藥物在瓊脂上擴散，形成濃度涕度，在一定的濃度下，對細(xì)菌抑制或殺死，濃度過低，則不能抑制或殺死。從而形成一定大小的抑菌圈。步驟：1.平板上密集劃線接種。2.貼4-5種含抗生素的紙片于平板上。藥片與平板邊緣相距至少1.5cm，藥片之間相距至少2cm。3. 37培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。測量抑菌圈直徑大小，判斷敏感性。 消毒劑對細(xì)菌的影響目的：掌握含藥紙片的制備。熟悉微生物培養(yǎng)，了解消毒劑對細(xì)菌的作用機制。材料：大腸埃希菌，普通瓊脂培養(yǎng)基，無菌鑷子，打孔器(直徑6cm)，濾紙紙片(直徑約6 mm)，70

20、%酒精，金星消毒水，紫藥水、紅藥水。原理：藥物在瓊脂上擴散，形成濃度涕度，在一定的濃度下，對細(xì)菌抑制或殺死，濃度過低，則不能抑制或殺死。從而形成一定大小的抑菌圈。步驟：1.平板上密集劃線接種細(xì)菌。2. 將無菌干燥的濾紙片放入各種消毒劑中浸濕，在容器邊緣瀝干，即為含藥的濾紙片。3. 將以上含藥濾紙片貼于平板上，每塊貼4種。藥片與平板邊緣相距至少1.5cm，藥片之間相距至少2cm。4. 37培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。測量抑菌圈直徑大小，判斷抑菌效果。 口服藥物的微生物檢查目的：掌握口服藥物的微生物檢查指標(biāo),熟悉其操作過程。一、細(xì)菌總數(shù)檢測材料：待檢中成藥片劑或丸劑，吸管、燒瓶、研缽、普通瓊脂培養(yǎng)基、無

21、菌生理鹽水、試管、平板。步驟：1.稱取一定量待檢藥物置于無菌研缽中，加入無菌生理鹽水研磨，制成均漿，然后移入燒瓶內(nèi)加足生理鹽水，使之濃度成為1：10的均勻懸液。2. 用1ml吸管吸取1：10藥液1ml加入裝有9ml的無菌生理鹽水的試管內(nèi)，得到1：100稀釋液。依次在一排管內(nèi)作10倍遞增稀釋。得到10-1、10-2、10-3、10-4等不同濃度的稀釋液。3. 選擇適宜的幾個稀釋度進行測定 用1ml無菌吸管分別吸取所選濃度的各種稀釋液加入到直接9cm的無菌平板中。每種濃度做3個平板，每個平板中加入1ml的稀釋藥液。將融化并冷卻至50的瓊脂培養(yǎng)基15ml倒入平板中，并立刻轉(zhuǎn)動平板使藥液和培養(yǎng)基充分混

22、勻。冷卻后的平板翻轉(zhuǎn)，置37培養(yǎng)24-48h,取出計算每一平板中生長的菌落數(shù)，并求得每一稀釋度的3個平板的菌落均數(shù)。4.細(xì)菌總數(shù)報告 選取菌落平均數(shù)值在30-300個之間的平板作為菌落總數(shù)測定范圍。將數(shù)得的菌落均數(shù)乘以相應(yīng)稀釋度即得到每克或每毫升監(jiān)測藥品中的細(xì)菌總數(shù)。 稀釋度的選擇：1.若只有一個稀釋度，菌落均數(shù)在30-300個間，即乘以稀釋倍數(shù)報告（見表中例I）。2.若兩個稀釋度，菌落均數(shù)都在30-300個間，則求出兩者每克或每毫升總均數(shù)之比，若比值小于2應(yīng)報告其均數(shù)，若大于2則報告較多的數(shù)值（見表中例、）。3. 若所有稀釋度菌落均數(shù)多大于300個，取稀釋度最高的菌落均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告（見

23、表中例）。4.若所有稀釋度菌落均數(shù)均少于30個，取稀釋度最低的菌落均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告（見表中例）。5. 若所有稀釋度菌落均數(shù)不在30-300個之間，一個稀釋度大于300個，相鄰另一稀釋度小于30時，則以接近30-300個的菌落均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告（見表中例）。 細(xì)菌計數(shù)結(jié)果及報告方法 菌落均數(shù) 稀釋倍數(shù) 比值 菌落總數(shù) 報告方式 例次 10-1 10-2 10-3 (個/克或ml) (個/克或ml) 1365 164 20 - 16400 16000/1.6×104 2760 295 46 1.6 37750 38000/3.8×104 2890 271 60 2.2 2

24、7100 27000/2.7×104 不可計 4650 513 - 513000 510000/5.1×105 27 11 5 - 270 270/2.7×102 不可計 305 12 - 30500 31000/3.1×104二、霉菌總數(shù)的測定材料：待檢中成藥片劑或丸劑，吸管、燒瓶、研缽、馬丁培養(yǎng)基、無菌生理鹽水、試管、平板。步驟：1.稱取一定量待檢藥物置于無菌研缽中，加入無菌生理鹽水研磨，制成均漿，然后移入燒瓶內(nèi)加足生理鹽水，使之濃度成為1：10的均勻懸液。2. 用1ml吸管吸取1：10藥液1ml加入裝有9ml的無菌生理鹽水的試管內(nèi)，得到1：100稀

25、釋液。依次在一排管內(nèi)作10倍遞增稀釋。得到10-1、10-2、10-3、10-4等不同濃度的稀釋液。3. 取適宜稀釋度的稀釋液各1ml，分別加入無菌平板中，每個稀釋度各做3個平板。4. 將15ml融化并冷卻至50的內(nèi)含4/30000虎紅的馬丁培養(yǎng)基倒入平板中，充分混勻、凝固。5. 將平板倒置，置25-28培養(yǎng)72h。計算平板內(nèi)染成粉紅色的霉菌菌落均數(shù)（如有根霉或毛霉生長，因其能蔓延生長而掩蓋了其他菌落，應(yīng)及時取出計數(shù)以免影響結(jié)果）。6. 真菌的菌落計數(shù)時，先點清每個平板上生長的菌落數(shù)，再求出每一個稀釋度的菌落平均數(shù)。判斷結(jié)果時選取均值在5-50個范圍以內(nèi)的菌落數(shù)乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)后，作為真菌總數(shù)報告。若有兩個稀釋度的菌落均數(shù)皆在5-50個以內(nèi)，或3個稀釋度的菌落均數(shù)皆不在此范圍內(nèi)時，稀釋度的選擇可參照細(xì)菌總數(shù)測定時的稀釋度選擇規(guī)則。即以細(xì)菌菌落均值30-300個相對應(yīng)于真菌菌落均值5-50個作為選擇稀釋度的參考標(biāo)準(zhǔn)。例如兩個稀釋度的真菌菌落均值都在5-50個范圍內(nèi)，稀釋度選擇可參照上面表中的例、例。 外用藥物的微生物學(xué)檢測目的：掌握外