出口禽肉中乙胺嘧啶殘留量檢驗(yàn)方法編制說明

1、?進(jìn)生口禽肉組織和內(nèi)臟甲乙胺喀陡殘留量檢測(cè)方法-HPLC-MS/MS 法?編制說明一、任務(wù)來源本標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)國(guó)家認(rèn)監(jiān)委下達(dá)的方案編號(hào)為“2021B797r?進(jìn)出口禽肉組織和內(nèi)臟中乙胺喀咤殘留量本測(cè)方法一LC-MS/MS法?制標(biāo)任務(wù)編寫.根據(jù)檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T0001-1995?出口商品中農(nóng)藥、獸藥殘留量及生物毒素生物學(xué)檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)編寫的根本規(guī)定?以下簡(jiǎn)稱?根本規(guī)定?的要求進(jìn)行起草制定的.二、編制依據(jù)1 .目的和意義乙胺喀咤Pyrimethamine 又叫達(dá)拉匹林、 息瘧定、2,4-二氨基-6-乙基-5-對(duì)氯苯基喀咤; 6-乙基-5-4-氯苯基-2,4-喀咤二胺、Daraprim等,分子式為

2、 Ci2H13CIN4 分子量：248.7114 分子結(jié)構(gòu)式如圖1,是一種白色結(jié)晶性粉末,無臭、無味,在冷水中不溶,再熱水、乙醇、 乙醛和氯仿中微溶,在稀礦酸中溶解.圖1乙胺喀咤分子結(jié)構(gòu)式乙胺喀咤是一種廣譜抗菌獸藥,主要用于防治雞的球蟲病1,特別是對(duì)瘧原蟲的治療 有較好效果,用于抗瘧疾、惡性瘧疾急性發(fā)作及弓形蟲病,但是乙胺喀咤的副作用較大,安 全范圍較小,使用過量可以損壞畜禽的生殖系統(tǒng),且不易恢復(fù).2004年9月,黑龍江雙山一種雞場(chǎng)連續(xù)用乙胺喀咤飼喂蛋種雞5天,結(jié)果在種蛋孵化時(shí)出現(xiàn)了全部死胚現(xiàn)象.乙胺喀咤為人工合成的非唾咻類病因性防瘧藥,由于對(duì)骨髓和腸粘膜等生長(zhǎng)迅速的組織作用明顯,故易致血液系

3、統(tǒng)和胃腸道病癥.其作用機(jī)理是乙胺喀咤是二氫葉酸復(fù)原酶抑制劑,可使二氫葉酸不能復(fù)原成四氫葉酸,干擾咻吟和喀咤核甘酸的合成,從而殺死敏感的瘧原蟲和弓形蟲.它通過抑制宿主和蟲體的葉酸合成而發(fā)揮作用,能引起葉酸吸收和利用的障礙,葉酸缺乏那么會(huì)引起貧血、白細(xì)胞降低和血小板減少等副作用.在 DNA合成過程中,由 脫氧尿喀咤轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵倏鍟r(shí)所需的甲基是由亞甲基四氫葉酸提供的.因此,任何原因引起的葉酸缺乏都能影響上述生化過程,結(jié)果影響DNA的合成,進(jìn)而影響胚胎發(fā)育.人類假設(shè)長(zhǎng)期誤食乙胺喀咤殘留的禽類可致葉酸缺乏而影響消化道粘膜及骨髓等細(xì)胞的增殖功能,引起惡心、嘔吐、腹痛及腹瀉, 較嚴(yán)重者出現(xiàn)巨幼細(xì)胞性貧血或白

4、細(xì)胞減少.孕婦誤食可透過血胎屏障并可進(jìn)入乳汁,引進(jìn)胎兒畸形和干擾葉酸代謝.假設(shè)超大劑量服用可引起驚厥、抽搐等 不良反響,甚至死亡.因此,有效限制禽類組織及內(nèi)臟中乙胺喀咤殘留量,對(duì)于保證食品安 全具有至關(guān)重要的作用.日本食品化學(xué)研究基金會(huì)規(guī)定豬和雞的組織及內(nèi)臟中乙胺喀咤的最大殘留限量 (MRLs)為0.05mg/kg.我國(guó)早在上個(gè)世紀(jì)末就制定了乙胺喀咤殘留檢測(cè)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN0690-1997-?出口禽肉中乙胺喀咤殘留量檢測(cè)方法?,該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定出口禽肉中乙胺喀咤的檢測(cè)為0.02 mg/kg.標(biāo)準(zhǔn)采用乙睛-三氯甲胺混合溶液進(jìn)行提取,再用正己烷進(jìn)行凈化,最后 利用高效液相色譜法進(jìn)行定量檢測(cè).該方法方法雖

5、然能根本滿足進(jìn)出口檢驗(yàn)的快速定量,但在定性方面還存在不可防止的缺陷.為了與國(guó)際方法接軌,打破出口國(guó)的技術(shù)壁壘,有必要及時(shí)建立進(jìn)更靈敏、 快捷、準(zhǔn)確的出口禽肉組織和內(nèi)臟中乙胺喀咤殘留檢測(cè)的分析方法,及以便對(duì)進(jìn)出口食品中出口禽肉組織和內(nèi)臟中乙胺喀咤的殘留進(jìn)行監(jiān)控.目前,國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)上報(bào)道的乙胺喀咤檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法,還未見使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)乙胺喀咤檢測(cè)的報(bào)道.錢桂平等1采用高效液相色譜法檢測(cè)魚肉中乙胺喀咤,方法的回收率在 75.9%90.2%,穩(wěn)定在75%85%.李佐卿等3檢測(cè)水產(chǎn)品中乙胺喀咤,樣品以乙睛、二氯甲烷、乙酸乙酯以體積比 2: l: l為提取劑,經(jīng) 脫脂

6、、凈化、濃縮,用流動(dòng)相溶解,用高效液相色譜法紫外檢測(cè)器測(cè)定,回收率 78.9%,檢 出限50g/kg.吳小平等4建立了鰻酬血漿與肌肉中乙胺喀咤檢測(cè)方法,回收率均達(dá)80%以上,最低檢測(cè)限可分別達(dá) 0. 005 g/g和0. 005 g/g.高效液相色譜法方法重現(xiàn)性好, 回收率高,但較費(fèi)時(shí),更重要的是該方法適合用于定量分析,但不適于定性.孫保國(guó)等5采用了毛細(xì)管電泳的方法測(cè)定雞肉中的乙胺喀咤殘留量,別離效率高,簡(jiǎn)便快速,但檢測(cè)限量?jī)H為0.1 mg/kg,顯然不能滿足進(jìn)出口檢疫的要求.因此,建立新的定量定性檢測(cè)方法十 分必要.國(guó)外有少量關(guān)于高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)乙胺喀咤的報(bào)道,例如 ：Segur

7、a等6采 用LC-MS/MS的方法對(duì)城市污水中抗生素進(jìn)行測(cè)定時(shí),采用乙胺喀咤作為代理標(biāo)樣,通過 單級(jí)反響監(jiān)測(cè)模式(SRM)對(duì)乙胺喀咤及其他抗生素進(jìn)行了分析,其中乙胺喀咤離子對(duì)為 249.10/177.07,CE設(shè)定為40V.Kristin 7利用LC-MS/MS對(duì)抗瘧藥進(jìn)行了高通量掃描,同樣 采用了 SRM的監(jiān)測(cè)模式,其中乙胺喀咤監(jiān)測(cè)離子對(duì)為249.3/233.1 , CE設(shè)定為2.85V.以上文獻(xiàn)均采用SRM模式,為更準(zhǔn)確的定性分析,進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)多采用多反響監(jiān)測(cè)模式 (MRM ).本方法采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS ),對(duì)檢測(cè)對(duì)象如雞肉、雞肝、雞腎等禽類組織和內(nèi)臟同時(shí)進(jìn)

8、行定性和定量分析,檢測(cè)限量到達(dá)1.0科g/kg.2 .方法概述稱取2.00g樣品于50mL具塞離心管,參加 0.5mL硫酸鈉水溶液和 10mL乙睛-三氯甲烷 10+1混合液,放入均質(zhì)器中震蕩提取20min后,6000r/min離心5min ,移取上清液至另一只50mL離心管,再向原離心管中參加10mL乙睛-三氯甲烷10+1混合液,振蕩提取20min , 6000r/min離心5min ,合并兩次上清液于40 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后待用.3 .1.2凈化向2.11殘?jiān)幸来螀⒓?2mL2%硫酸鈉水溶液和 5mL正己烷,渦旋 2min使殘?jiān)芙? 3000r/min離心5min棄去正己烷層后,參加 5mL

9、乙睛-三氯甲烷1+2混合液,渦旋2min , 3000r/min離心5min后將下層有機(jī)相移入試管中,用氮?dú)鉂饪s儀于40c吹至近干后,用乙睛溶解定容至1.0mL,過0.45 m膜,于進(jìn)樣瓶中待測(cè).2.2液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件a 色譜柱：ZORBAX SB-C18 規(guī)格 4.6*150mm*5 m;進(jìn)樣量：10 科 L ,流速：0.8mL/min液相梯度洗脫條件見表1:表1液相色譜梯度洗脫程序時(shí)間流速0.1% 甲酸甲醇%minmL/minA (%)B (%)0.00.880201.00.880201.50.810905.00.810905.10.8802012.00.88020b質(zhì)譜條件：采用電

10、噴霧離子源ESI,通過正離子多反響監(jiān)控掃描模式；離子源電壓：5.5kV;離子源溫度：500C； N2作為霧化氣、氣簾氣和輔助氣,其中霧化氣為 7psi,氣 簾氣為9psi,輔助氣流速為 7L/min.MRM監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碰撞電壓DP、去簇電壓CE及駐留時(shí)間Dwell time 如表2所示：表2質(zhì)譜參數(shù)表Precursor ionProduct ionsDP(V)CE(V)Dwell time(ms)233.111038100249.2177.111040100198.111054100注： Precursor ion ： 母離子；Product ions : 子離子2.3定性定量方法的選擇我們用

11、HPLC-MS-MS在MRM方式下對(duì)乙胺喀咤的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè),得到目標(biāo)物的子離子如圖2, 249.2/233,1、249.2/177,1、249.2/198.1.根據(jù)大量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),說明樣品峰面 積與樣品含量一一對(duì)應(yīng).因此采用峰面積和對(duì)乙胺喀咤進(jìn)行定量.圖2乙胺喀咤標(biāo)準(zhǔn)品在 C18色譜柱上選擇離子色譜圖3.方法的優(yōu)化3.1 液相條件的優(yōu)化選用0.1%的甲酸水A和甲醇B作為流動(dòng)相,A:B的比例分別為4: 6; 3: 7和1:9.乙胺喀咤標(biāo)準(zhǔn)品1 g/kg的色譜圖如圖3,圖4,圖5.根據(jù)色譜圖中標(biāo)準(zhǔn)品的峰型, 流動(dòng)相比例A: B為1: 9時(shí)乙胺喀咤標(biāo)準(zhǔn)品的圖譜的峰型比擬好.圖3 流動(dòng)相比例 A:

12、B為4: 6時(shí)乙胺喀咤標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖圖4流動(dòng)相比例A: B為3: 7時(shí)乙胺喀咤標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖圖5 流動(dòng)相比例 A: B為1 : 9時(shí)乙胺喀咤標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖又由于流動(dòng)相比例 A： B為1： 9時(shí),出峰時(shí)間為1.41min左右,出峰時(shí)間過早,將流動(dòng)相設(shè)置梯度,如表1,得到梯度流動(dòng)相下乙胺喀咤標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖,如圖6,時(shí)間在4.24min左右,出峰時(shí)間比擬適宜,總的檢測(cè)時(shí)間為15min,再將檢測(cè)時(shí)間優(yōu)化至 12min.圖6梯度流動(dòng)相下乙胺喀咤標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖 15min12min)圖7梯度流動(dòng)相下乙胺喀咤標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化選用電噴霧離子源正離子化方式.選用針泵流動(dòng)注射1mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液,全

13、掃描確定M+H母離子峰,再通過二級(jí)質(zhì)譜,鎖定母離子并將其打碎,通過優(yōu)化質(zhì)譜條件DP 圖8、CE 圖9,將得到二級(jí)質(zhì)譜圖,再經(jīng)過多反響監(jiān)控 MRM,選擇出穩(wěn)定而豐度大的 碎片,與母離子組成離子對(duì)：249.2/233.1、249.2/177.1、249.2/198.1 ,用于定性定量.圖8質(zhì)譜DP優(yōu)化圖9-1質(zhì)譜CE優(yōu)化圖 9-2 質(zhì)譜 CE-233.1圖 9-3 質(zhì)譜 CE-177.1圖 9-4 質(zhì)譜 CE-198.14線性關(guān)系和測(cè)定低限本方法采用外標(biāo)法定量,以基體基質(zhì)為溶劑,乙胺喀咤的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的濃度為2, 10,20, 50, 100g/Lo在本法所確定的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,以濃度

14、為橫坐標(biāo),峰面積之和為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液的工作曲線,得到在C18色譜柱上乙胺喀咤不同基質(zhì)下標(biāo)準(zhǔn)曲線及方程,如圖10、圖11、圖12.圖10.基質(zhì)為雞肉的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=1060X(r=0.9992)圖11.基質(zhì)為雞肝的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=873X(r=0.9999)圖12.基質(zhì)為雞腎的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=943X(r=0.9997)另外,本方法的檢測(cè)低限確定為 1g/kg,滿足進(jìn)出口商品檢測(cè)的需要,如下列圖.圖13.基質(zhì)為雞肉的方法檢測(cè)低限,標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度 1科g/kg圖14.基質(zhì)為雞肝的方法檢測(cè)低限,標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度1科g/kg圖15.基質(zhì)為雞腎的方法檢測(cè)低限,標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度1科g/kg5方法回收率及精密度試驗(yàn)在雞肉

15、、雞肝、雞腎、鴨肉、鴨肝、鴨腎樣品中分別添加高、中、低三個(gè)濃度水平,每 個(gè)水平重復(fù)6個(gè)實(shí)驗(yàn),所得結(jié)果匯總于表 3,所得回收率如下:雞肉添加水平為1.0閔/kg ,乙胺喀咤的回收率為92.4102.1 %.添加水平為10.0閔/kg ,乙胺喀咤的回收率為90,5 97.0 %.添加水平為50.0閔/kg ,乙胺喀咤的回收率為98,2 100.2 %.雞肝添加水平為1.0閔/kg ,乙胺喀咤的回收率為86.993.2 %.添加水平為10.0閔/kg ,乙胺喀咤的回收率為92.599.8 %.添加水平為50.0閔/kg ,乙胺喀咤的回收率為92.8102.5 %.雞腎添加水平為1.0 閔/kg ,乙

16、胺喀咤的回收率為84.493.0 %.添加水平為10.0閔/kg ,乙胺喀咤的回收率為88.894.5 %.添加水平為50.0閔/kg ,乙胺喀咤的回收率為89.7297.8 %.所有實(shí)驗(yàn)變異系數(shù)在1.66%-3.62%之間.其中空白基質(zhì)以及基質(zhì)添加標(biāo)樣的色譜圖見圖16-27 .表3空白樣品添加回收及精密度基質(zhì)雞肉雞肝雞腎添加水平次數(shù)實(shí)測(cè)值聞/kg回收率%實(shí)測(cè)值(mg/kg)回收率%實(shí)測(cè)值(mg/kg)回收率%1.0 g g/kg11.021102.10.86986.90.84484.420.94294.20.90990.90.93093.030.93993.90.89489.40.90590

17、.540.94594.50.87787.70.90690.650.92492.40.93293.20.91591.560.94394.30.92392.30.88488.4平均值0.95295.20.90190.10.89789.7標(biāo)準(zhǔn)偏差0.0343.40.0252.50.0303.0變異系數(shù)%3.622.793.3710.0 g g/kg19.39693.969.10991.19.44894.529.58395.839.82298.29.15591.639.04690.469.45294.59.21992.249.05790.579.24792.59.31393.159.69696.969

18、.66796.78.87588.869.26892.689.93899.49.33693.4平均值9.34193.49.54095.49.22492.3標(biāo)準(zhǔn)偏差0.2692.70.3273.30.1992.0變異系數(shù)%2.873.422.1550.0 g g/kg149.10298.246.63193.347.86495.7251.246102.546.41892.846.78293.6350.095100.247.89395.847.87595.8449.74999.548.88597.844.83189.7548.92497.949.90699.848.89597.8649.87599.8

19、46.86693.746.79393.6平均值49.83299.747.76795.547.17394.3標(biāo)準(zhǔn)偏差0.8291.651.3972.791.3942.79變異系數(shù)%1.662.932.96圖16雞肉樣品空白圖圖17.雞肉添加標(biāo)樣色譜圖,添加水平 1閔/kg圖18.雞肉添加標(biāo)樣色譜圖,添加水平10聞/kg圖19.雞肉添加標(biāo)樣色譜圖,添加水平50聞/kg圖20,雞肝樣品空白圖圖21,雞肝添加標(biāo)樣色譜圖,添加水平 1閔/kg圖22,雞肝添加標(biāo)樣色譜圖,添加水平10聞/kg圖23,雞肝添加標(biāo)樣色譜圖,添加水平50聞/kg圖24.雞腎樣品空白圖圖25,雞腎添加標(biāo)樣色譜圖,添加水平 1閔/k

20、g圖26,雞腎添加標(biāo)樣色譜圖,添加水平10聞/kg圖27,雞腎添加標(biāo)樣色譜圖,添加水平50聞/kg圖28乙胺喀咤Q1圖圖29乙胺喀咤Q2圖圖30乙胺喀咤標(biāo)樣色譜圖6 .實(shí)驗(yàn)室間測(cè)量方法的準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)協(xié)同研究本檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)五家單位湖北省質(zhì)量監(jiān)督研究員、河南出入境檢驗(yàn)檢疫局、河北出入境檢驗(yàn)檢疫局、貴州出入境檢驗(yàn)檢疫局和黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局分別做三個(gè)水平的添加回收實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果見表2.從表2中的數(shù)據(jù)可以看出,本方法的實(shí)驗(yàn)室間精密度符合SN/T0001-1995 “規(guī)定的相關(guān)要求.表3空白樣品添加回收及實(shí)驗(yàn)室間精密度數(shù)據(jù)協(xié)同實(shí)驗(yàn)室基質(zhì)雞肉雞肝雞腎添加水平(g g/kg)1.010.050.01.

21、010.050.01.010.050.0湖北質(zhì)監(jiān)局研究員測(cè)定結(jié)果(mg/kg)0.8939.32547,5540.8778.78246.7530.8978.85243,6240.9238.86748,1260.9328.54944,8150.9388.65743.8660.9399.52147,2550.9128.93745,1470.9468.96843.552河南局0.9279.12448.3360.8989.27846.8550.8578.84642,7350.9158.84949,2520.8928.46545.9310.8919.43444,6950.9128.79547,3740.

22、9078.48.46.2580.9139.15743.978河北局0.9469.33248.2650.8969.28849.2530.8479.55344,8710.8799.54649.6880.9419.14447,9540.8928.72543.4950.9459.12647,9740.8979.52648,8710.8638.84942,861貴州局0.9388.73548.4350.9728.96847,7550.9258.74545,1740.9889.14550.1570.8389.22446.3370.8458.95242,6620.9178.82347.5530.9128.42647,5240.8649.34842,737黑龍江局0.9609.52546.6790.8548.53145.7280.8438.64742.6490.9549.32149,1520.9579.24047,4570.8928.85543,7150.9139.90548.7590.9368.86248,7720.8768.76843.935平均值(mg/kg)0.9309.19649,5040.9088.94447.0270.8868.95743.637平均回收率()93.091.696.690.889.494.188.689.687.3變異系數(shù)()2.953.732.003