單克隆抗體制備的基本原理

1、單克隆抗體制備的基本原理一、單克隆抗體的概念抗體( antibody )是機體在抗原刺激下產(chǎn)生的能與該抗原特異性結(jié)合的 免疫球蛋白。 常規(guī)的抗體制備是通過動物免疫并采集抗血清的方法產(chǎn)生 的，因而抗血清通常含有針對其他無關(guān)抗原的抗體和血清中其他蛋白質(zhì) 成分。一般的抗原分子大多含有多個不同的抗原決定簇，所以常規(guī)抗體 也是針對多個不同抗原決定簇抗體的混合物。 即使是針對同一抗原決定 簇的常規(guī)血清抗體， 仍是由不同 B 細(xì)胞克隆產(chǎn)生的異質(zhì)的抗體組成。因 而，常規(guī)血清抗體又稱多克隆抗體( polyclonal antibody )，簡稱多 抗。由于常規(guī)抗體的多克隆性質(zhì)， 加之不同批次的抗體制劑質(zhì)量差異很

2、 大，使它在免疫化學(xué)試驗等使用中帶來許多麻煩。因此，制備針對預(yù)定 抗原的特異性均質(zhì)的且能保證無限量供應(yīng)的抗體是免疫化學(xué)家長期夢 寐以求的目標(biāo)。隨著雜交瘤技術(shù)的誕生，這一目標(biāo)得以實現(xiàn)。1975年，Kohler和Milstein 建立了淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，他們把用預(yù)定抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞與能在體外培養(yǎng)中無限制生長的骨髓瘤細(xì)胞 融合，形成 B 細(xì)胞雜交瘤。這種雜交瘤細(xì)胞具有雙親細(xì)胞的特征，既像 骨髓瘤細(xì)胞一樣在體外培養(yǎng)中能無限地快速增殖且永生不死， 又能像脾 淋巴細(xì)胞那樣合成和分泌特異性抗體。 通過克隆化可得到來自單個雜交 瘤細(xì)胞的單克隆系， 即雜交瘤細(xì)胞系， 它所產(chǎn)生的抗體是針對同一抗原 決定簇的

3、高度同質(zhì)的抗體，即所謂單克隆抗體( monoclonal antibody ， McAb，簡稱單抗。與多抗相比，單抗純度高，專一性強、重復(fù)性好、且能持續(xù)地?zé)o限量供 應(yīng)。單抗技術(shù)的問世，不僅帶來了免疫學(xué)領(lǐng)域里的一次 * ，而且它在生 物醫(yī)學(xué)科學(xué)的各個領(lǐng)域獲得極廣泛的應(yīng)用，促進(jìn)了眾多學(xué)科的發(fā)展。德國科學(xué)家柯勒( Georges Ko1er )和英國科學(xué)家米爾斯坦( Cesar Milstein )兩人由此杰出貢獻(xiàn)而榮獲 1984 年度諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎。二、雜交瘤技術(shù)(一)雜交瘤技術(shù)的誕生 淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的誕生是幾十年來免疫學(xué)在理論和技術(shù)兩方面發(fā) 展的必然結(jié)果，抗體生成的克隆選擇學(xué)說、抗體基

4、因的研究、抗體結(jié)構(gòu) 與生物合成以及其多樣性產(chǎn)生機制的揭示等， 為雜交瘤技術(shù)提供了必要 理論基礎(chǔ)，同時，骨髓瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)、細(xì)胞融合與雜交細(xì)胞的篩選 等提供了技術(shù)貯備。1975年8月7日，Kohler和Milstein 在英國自 然雜志上發(fā)表了題為“分泌具有預(yù)定特異性抗體的融合細(xì)胞的持續(xù)培 養(yǎng)”( Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity )的著名論文。他們大膽地把以前不同骨髓瘤 細(xì)胞之間的融合延伸為將喪失合成次黃嘌呤- 鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hypoxanthine guan

5、osine phosphoribosyl transferase， HGPR)T 的骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合。 融合由仙臺病 毒介導(dǎo)，雜交細(xì)胞通過在含有次黃嘌吟(hypoxanthine , H)、氨基喋 吟(ami nopterin , A)和胸腺嘧啶核苷 (thymidi ne , T)的培養(yǎng)基(HAT 中生長進(jìn)行選擇。 在融合后的細(xì)胞群體里，盡管未融合的正常脾細(xì)胞和相互融合的脾細(xì)胞是HGPRT,但不能連續(xù)培養(yǎng)，只能在培養(yǎng)基中存活幾 天，而未融合的HGPRT骨髓瘤細(xì)胞和相互融合的 HGPRT骨髓瘤細(xì)胞不 能在HAT培養(yǎng)基中存活，只有骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞

6、因 得到分別來自親本脾細(xì)胞的 HGPR和口親本骨髓瘤細(xì)胞的連續(xù)繼代特性， 而在HAT培養(yǎng)基中存活下來。實驗的結(jié)果完全像起始設(shè)計的那樣，最終得到了很多分泌抗綿羊紅細(xì)胞抗體的克隆化雜交瘤細(xì)胞系。 用這些細(xì)胞 系注射小鼠后能形成腫瘤，即所謂雜交瘤。生長雜交瘤的小鼠血清和腹 水中含有大量同質(zhì)的抗體，即單克隆抗體。這一技術(shù)建立后不久， 在融合劑和所用的骨髓瘤細(xì)胞系等方面即得到改 進(jìn)。最早仙臺病毒被用做融合劑，后來發(fā)現(xiàn)聚乙二醇（ PEG的融合效 果更好，且避免了病毒的污染問題，從而得到廣泛的應(yīng)用。隨后建立的 骨髓瘤細(xì)胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NS0/1都是既不合成輕鏈 又不合成重

7、鏈的變種，所以由它們產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞系，只分泌一種針 對預(yù)定的抗原的抗體分子，克服了骨髓瘤細(xì)胞M0PC-2等的不足。再后來又建立了大鼠、 人和雞等用于細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞系， 但其基本原 理和方法是一樣的。（二）雜交瘤技術(shù)的基本原理 細(xì)胞融合是一個隨機的物理過程。 在小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞混合 細(xì)胞懸中，經(jīng)融合后細(xì)胞將以多種形式出現(xiàn)， 如融合的脾細(xì)胞和瘤細(xì)胞、 融合的脾細(xì)胞和脾細(xì)胞、融合的瘤細(xì)胞和瘤細(xì)胞、未融合的脾細(xì)胞、未 融合的瘤細(xì)胞以及細(xì)胞的多聚體形式等。 正常的脾細(xì)胞在培養(yǎng)基中存活 僅57天，無需特別篩選，細(xì)胞的多聚體形式也容易死去。而未融合 的瘤細(xì)胞則需進(jìn)行特別的篩選去除。在細(xì)胞融

8、合后，要從上述五種細(xì)胞 中篩選出雜交瘤細(xì)胞，一般使用 HAT培養(yǎng)進(jìn)行篩選，HAT培養(yǎng)基中含有 次黃嘌吟(H)、氨基喋吟(A)和胸腺嘧啶(T)三種成分。細(xì)胞的DNA合成 有內(nèi)源性途徑 (主要途徑 )和外源性途徑 (旁路途徑 )兩種方式。 內(nèi)源性途 徑就是利用谷氨酰胺或單磷酸尿苷酸在二氫葉酸還原酶的催化下來合 成DNA而外源性途徑則是利用次黃嘌吟或胸腺嘧啶在次嘌吟鳥嘌吟磷 酸核糖轉(zhuǎn)移酶 (Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase, HGPRT或胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK) 的催化下來補救合成 DNAHAT培養(yǎng)基中氯基喋

9、吟是二氫葉酸還原酶的抑制劑 ，能有效地阻斷 DNA合成的內(nèi)源性途徑。B淋巴細(xì)胞具有HGPRTT這兩種酶，因此在內(nèi) 源性途徑被阻斷后仍能利用 HAT培養(yǎng)基中的次黃嘌吟和胸腺嘧啶來合成 DNA可在HAT培養(yǎng)基中存活，但B淋巴細(xì)胞是正常細(xì)胞，故不能長期 存活。雜交瘤技術(shù)中所使用和 SP2/0-Ag14骨髓瘤細(xì)胞為HGPRT的 TK- 缺陷型，缺乏HGPR酶和TK酶在內(nèi)源性途徑被阻斷后不能進(jìn)行 DNA的 外源性合成，故不能在HAT培養(yǎng)基中存活。雜交瘤細(xì)胞由于繼承了 B淋 巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的雙重特性， 能夠合成HGPR酶和TK酶，故在HAT 養(yǎng)基中能長期存活。因此將融合后的混合細(xì)胞在 HAT培養(yǎng)基中培

10、養(yǎng)兩周 后，只有雜交瘤細(xì)胞能存活下來，成為制造單克隆抗體的細(xì)胞源。三、單克隆抗體制備的方法與步驟 （一）單抗制備的基本流程單克隆抗體制備的主要步驟有：正常小鼠免疫處理；用物理、化學(xué)和生物方法促使細(xì)胞融合；雜交瘤細(xì)胞的篩選與培養(yǎng)；單克隆抗體 的提純。（二）單克隆抗體制備的基本方法抗原提純與動物免疫 對抗原的要求是純度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。 如為細(xì)胞 抗原，可取1X 107個細(xì)胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐劑 并經(jīng)充分乳化，如為聚丙烯酰胺電泳純化的抗原， 可將抗原所在的電泳 條帶切下，研磨后直接用以動物免疫。選擇與所用骨髓瘤細(xì)胞同源的 BALB/C健康小鼠，鼠齡在812周，雌

11、 雄不限。為避免小鼠反應(yīng)而不佳或免疫過程中死亡，可同時免疫 34 只小鼠。免疫過程和方法與多克隆抗血清制備基本相同，因動物、抗原形式、免 疫途徑不同而異，以獲得高效價抗體為最終目的。免疫間隔一般23周。一般被免疫動物的血清抗體效價越高，融合后細(xì)胞產(chǎn)生高效價特異 抗體的可能性越大，而且單克隆抗體的質(zhì)量（如抗體的濃度和親和力） 也與免疫過程中小鼠血清抗體的效價和親和力密切相關(guān)。末次免疫后 3 4 天，分離脾細(xì)胞融合。骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備選擇瘤細(xì)胞株的最重要的一點是與待融合的B細(xì)胞同源。如待融合的是脾細(xì)胞，各種骨髓瘤細(xì)胞株均可應(yīng)用，但應(yīng)用最多的是 Sp2/0 細(xì)胞株。 該細(xì)胞株生長及融合效率均

12、佳，此外，該細(xì)胞株本身不分泌任何免疫球 蛋白重鏈或輕鏈。細(xì)胞的最高生長刻度為9X 105/ml，倍增時間通常為1015h。融合細(xì)胞應(yīng)選擇處于對數(shù)生長期、細(xì)胞形態(tài)和活性佳的細(xì)胞 (活性應(yīng)大于 95)。骨髓瘤細(xì)胞株在融合前應(yīng)先用含 8- 氮鳥嘌呤的 培養(yǎng)基作適應(yīng)培養(yǎng)，在細(xì)胞融合的前一天用新鮮培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為 2105/ml ，次日一般即為對數(shù)生長期細(xì)胞。在體外培養(yǎng)條件下，細(xì)胞的生長依賴適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度，因而，在培養(yǎng)融 合細(xì)胞或細(xì)胞克隆化培養(yǎng)時，還需加入其他飼養(yǎng)細(xì)胞( feedercell )。 常用的飼養(yǎng)細(xì)胞為小鼠的腹腔細(xì)胞， 制備方法為用冷凍果糖液注入小鼠 腹腔，輕揉腹部數(shù)次，吸出后的液體中即含

13、小鼠腹腔細(xì)胞，其中在巨噬 細(xì)胞和其他細(xì)胞。 亦有用小鼠的脾細(xì)胞、 大鼠或豚鼠的腹腔細(xì)胞作為飼 養(yǎng)細(xì)胞的。在制備飼養(yǎng)細(xì)胞時， 切忌針頭刺破動物的消化器官，否則所獲細(xì)胞會有 嚴(yán)重污染。飼養(yǎng)細(xì)胞調(diào)至1X 105/ml，提前一天或當(dāng)天置板孔中培養(yǎng)。細(xì)胞融合細(xì)胞融合是雜交瘤技術(shù)的中心環(huán)節(jié)， 基本步驟是將兩種細(xì)胞混合后加入PEG使細(xì)胞彼此融合。其后吧培養(yǎng)液稀釋 PEG消除PEG勺作用。將融 合后的細(xì)胞適當(dāng)稀釋，分置培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)。 融合過程中有幾個問題應(yīng) 特別注意。細(xì)胞比例：骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的比值可從 1:2到1:10不等，常用1:4的比例。應(yīng)保證兩種細(xì)胞在融合前都具有較高活性。 反應(yīng)時間：在兩種細(xì)胞的

14、混合細(xì)胞懸液中，第 1min 滴加 4.5ml 培養(yǎng)液； 間隔2min滴加5ml培養(yǎng)液，爾后加培養(yǎng)液50ml。培養(yǎng)液的成分：對 融合細(xì)胞，良好的培養(yǎng)液尤其重要，其中的小牛血清、各種離子和營養(yǎng) 成分均需嚴(yán)格配制。如融合效率降低，應(yīng)隨時核查培養(yǎng)基情況。有限稀釋法篩選陽性株一般選用的骨髓瘤細(xì)胞為 HAT敏感細(xì)胞株，所以只有融合的 細(xì)胞才能待續(xù)存活一周以上。融合細(xì)胞呈克隆生長，經(jīng)有限稀釋后（一 般稀釋至 0.8 個細(xì)胞 / 孔），按 Poisson 法計算，應(yīng)有 36的孔為 1 個細(xì)胞/孔。細(xì)胞培養(yǎng)至覆蓋0 %20%孔底時，吸取培養(yǎng)上清用ELISA 檢測抗體含量。首先依抗體的分泌情況篩選出高抗體分泌孔

15、， 將孔中細(xì) 胞再行克隆化，爾后進(jìn)行抗原特異的 ELISA測定，選高分泌特異性細(xì)胞 株擴大培養(yǎng)或凍存。單克隆抗體的制備和凍存篩選出的陽性細(xì)胞株應(yīng)及早進(jìn)行抗體制備， 因為融合細(xì)胞隨培養(yǎng)時間延長，發(fā)生污染、染包體丟失和細(xì)胞死亡的機率增加。抗體制備有兩種方 法。一是增量培養(yǎng)法，即將雜交瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中分離單 克隆抗體。該法需用特殊的儀器設(shè)備，一般應(yīng)用無血清培養(yǎng)基，以利于 單克隆抗體的濃縮和純化。最普遍采用的是小鼠腹腔接種法。選用BALB/c 小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射， 一周后將雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔中去。 通常在接種一周后即有明顯 的腹水產(chǎn)生，每只小鼠可收集

16、 510ml 的腹水，有時甚至超過 40ml。 該法制備的腹水抗體含量高， 每毫升可達(dá)數(shù)毫克甚至數(shù)十毫克水平。此 外，腹水中的雜蛋白也較少， 便于抗體的純化。 接種細(xì)胞的數(shù)量應(yīng)適當(dāng)， 一般為5X 105/鼠，可根據(jù)腹水生長情況適當(dāng)增減。選出的陽性細(xì)胞株應(yīng)及早凍存。凍存的溫度越低越好， 凍存于液氮的細(xì) 胞株活性僅有輕微的降低，而凍存在-70 C冰箱則活性改變較快。 細(xì)胞 不同于菌種，凍存過程中需格外小心。二甲亞砜（ DMS）O 是普遍應(yīng)用的 凍存保護劑。凍存細(xì)胞復(fù)蘇后的活性多在50%95%之間。如果低于50，則說明凍存復(fù)蘇過程有問題。單克隆抗體的純化 單克隆抗體的純化方法同多克隆抗體的純化， 腹水特異性抗體的濃度較 抗血清中的多克隆抗體高，純化效果好。 按所要求的純度不同采用相應(yīng) 的純化方法。 一般采用鹽析、 凝膠過濾和離子交換層析等步驟達(dá)到純化