實驗二-蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)

1、一、實驗?zāi)康?、了解構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位及主要連接形式。2、了解蛋白質(zhì)和某些氨基酸的呈色反應(yīng)原理。3、學(xué)習(xí)幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸的方法。1.雙縮脲反應(yīng)2.茚三酮反應(yīng)3.黃色反應(yīng)4.考馬斯亮藍反應(yīng)呈色反應(yīng)呈色反應(yīng)1、雙縮脲反應(yīng)、雙縮脲反應(yīng)（1）原理：尿素加熱至180oC左右，生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性條件下能與Cu2+結(jié)合生成紫紅色化合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中有肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲相似，也能發(fā)生此反應(yīng)（二肽和氨基酸都不能發(fā)生雙縮脲反應(yīng)二肽和氨基酸都不能發(fā)生雙縮脲反應(yīng)）?？捎糜诘鞍踪|(zhì)的定性或定量測定。反應(yīng)式如下： 雙縮脲反應(yīng)不僅為含有兩個以上肽鍵兩個以上肽鍵的物

2、質(zhì)所有，-CH2-NH2, -CS-NH2, -CHR-NH2, -CH2-NH2-CH-NH2-CH2-OH或-CHOHCH2NH2等基團的物質(zhì)以及乙二酰二胺等物質(zhì)也有此反應(yīng)。NH3也干擾此反應(yīng)也干擾此反應(yīng)，因為NH3與Cu2+可生成暗暗藍色的絡(luò)離子藍色的絡(luò)離子Cu（NH3）42+。因此，一切蛋白一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應(yīng)質(zhì)或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應(yīng)，但有雙縮脲反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽。（2）試劑尿素，10%氫氧化鈉溶液，1%硫酸銅溶液，改為蛋清溶液：水= 1：9（3）操作取少量尿素結(jié)晶，放在干燥試管中。用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開始硬化時，停止加熱，尿素放出

3、氨，形成雙縮脲。冷后，加10%氫氧化鈉溶液約1mL，振蕩混勻，再加1%硫酸銅溶液1滴滴，再振蕩。觀察出現(xiàn)的粉紅顏色粉紅顏色。要避免添加過量硫酸銅，否則，生成的藍色氫氧化銅能掩蓋粉紅色。（由于雜由于雜質(zhì)以及氨氣的干擾，導(dǎo)致顏色不都是紫紅色質(zhì)以及氨氣的干擾，導(dǎo)致顏色不都是紫紅色）向另一試管加蛋清溶液：水= 1：9約1mL和10%氫氧化鈉溶液約2mL，搖勻，再加1%硫酸銅溶液2滴，隨加隨搖。觀察紫紫玫瑰色玫瑰色的出現(xiàn)。2、茚三酮反應(yīng)(1) 原理蛋白質(zhì)、多肽和各種氨基酸以及所有氨基酸均能發(fā)生該反應(yīng) ，除無-氨基的脯氨酸和羥脯氨酸呈黃色反應(yīng)外，其它均生成藍紫色化合物，最終生成藍色化合物。氨、-丙氨酸和許

4、多一級氨化合物都有此反應(yīng)。因此，雖然蛋白質(zhì)或氨基酸均有茚三酮反應(yīng)，但能與茚三酮反應(yīng)呈陽性反應(yīng)的不一定都是蛋白質(zhì)或氨基酸。該反應(yīng)的適宜的PH為57，同一濃度的蛋白質(zhì)或氨基酸在不同pH條件下的顏色深淺不同，酸度過大時甚至不顯色。該反應(yīng)分為兩步，第一步是氨基酸被氧化脫氨形成酮酸，酮酸脫羧成醛，放出CO2、NH3，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原型茚三酮同另一個水合茚三酮分子和氨縮合生成有藍色物質(zhì)。反應(yīng)機理如下：（2）試劑蛋白質(zhì)溶液：新鮮雞蛋清溶液（蛋清：水=1：9），0.5%甘氨酸，0.1%茚三酮水溶液，0.1%茚三酮-乙醇溶液。（3）操作取兩支試管分別加入蛋白質(zhì)溶液和甘氨酸溶液

5、1mL，再各加0.5mL0.1%茚三酮水溶液,混勻，在沸水浴中沸水浴中加熱加熱12分鐘分鐘，觀察顏色由粉色變紫色再變藍色（pH不同顏色深淺不同）。在一小塊濾紙上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，風(fēng)干后，再在原處滴一滴0.1%茚三酮-乙醇溶液，在微火旁烘干顯色，觀察紫紅色斑點的出現(xiàn)。3、黃色反應(yīng)、黃色反應(yīng)（1）原理含有苯環(huán)的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黃色物質(zhì)，該化合物在堿性溶液中進一步形成深橙色的硝醌酸鈉。反應(yīng)式如下：多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以呈黃色反應(yīng)，苯丙氨酸不易硝化苯丙氨酸不易硝化，須加入少量濃硫酸才有黃色反應(yīng)。（2）試劑 雞蛋清溶液（將新鮮雞蛋清用6層紗布過濾，然

6、后按雞蛋清：水=1：20配制而成。大豆提取液：將大豆浸泡充分吸脹后研磨成漿狀再用紗布過濾。 頭發(fā)。指甲。 0.5%苯酚溶液。濃硝酸。0.3%色氨酸溶液。0.3%酪氨酸溶液。10%氫氧化鈉溶液。（3）操作向7個試管中分別按下表加入試劑，觀察各管出現(xiàn)的現(xiàn)象，有的試管反應(yīng)慢可略放置或用微火加熱。待各管出現(xiàn)黃色后，于室溫下逐滴加入10%氫氧化鈉溶液至堿性，觀察顏 色變化（1 4管可能需要加熱）。4、考馬斯亮藍反應(yīng)（1）原理考馬斯亮藍G250（R250）具有紅色和藍色兩種色調(diào)。在酸性溶液中，其以游離態(tài)存在呈棕紅色；當它與蛋白質(zhì)通過疏水作用結(jié)合后變?yōu)樗{色。它染色靈敏度高，比氨基黑高3倍。反應(yīng)速度快，約在2分鐘左右時間達到平衡，在室溫一小時內(nèi)穩(wěn)定。在0.01 1.0mg蛋白質(zhì)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度與A595nm值成正比。所以常用來測定蛋白質(zhì)含量。（2）試劑蛋白質(zhì)溶液（雞蛋清：水=1：20配制而成）?？捡R斯亮藍溶液：考馬斯亮藍G250100g溶于50mL95%乙醇中，加100mL85%磷酸混勻，配