血清尿素測(cè)定

1、【目的】學(xué)習(xí)血清尿素(Urea)測(cè)定方法,了解其意義.【原理】血清尿素(Urea )是蛋白質(zhì)的正常代謝產(chǎn)物.它的測(cè)定是常用的衡量腎小球功能的指標(biāo)之一.腎性血清尿素含量增加, 提示腎小球損傷.是研究藥物腎毒性的重要指標(biāo)之一.【器材】兔固定架、注射器、燒杯、可見(jiàn)分光光度計(jì)、試管、水浴【藥品】0.5%氯化高汞溶液、生理鹽水【動(dòng)物】家兔2只【方法】取家兔 2只,1只注射氯化高汞 5ml/kg (0.5%氯化高汞溶液1.0ml/kg),另1只注射等量的生理鹽水.48小時(shí)后,從家兔耳靜脈取血1ml ,制取血清,按血清尿素測(cè)定方法測(cè)定血清尿素含量.【結(jié)果】記錄2只家兔血清尿素含量,比擬并分析其差異.附血清尿

2、素(Urea)測(cè)定方法【原理】尿素與二乙酰在酸性反響環(huán)境中加熱,縮合生成色素原二嗪化合物.因二乙酰不穩(wěn)定,不宜直接參加,可由化學(xué)反響生成. 通常由反響系統(tǒng)中二乙酰一的與強(qiáng)酸作用,產(chǎn)生乙 二酰.二乙酰和尿素反響,縮合生成紅色的二嗪.根據(jù)顏色深淺確定尿素含量的多少.【試劑】 酸性試劑：在三角燒瓶中加蒸儲(chǔ)水約100ml ,然后參加濃硫酸 44ml及85%磷酸66ml .冷至室溫,參加硫氨月尿 50mg 及硫酸鎘(CdSO4 8H2O)2g .溶解后用蒸儲(chǔ)水稀釋至1L ,置棕色瓶中冰箱保存,可穩(wěn)定 6個(gè)月.(2)二乙酰-的溶液：稱取二乙酰-曲20g ,加蒸儲(chǔ)水約900ml ,溶解后,再用蒸儲(chǔ)水稀釋 至

3、1L ,置棕色瓶中,貯放冰箱內(nèi)可保存半年.尿素標(biāo)準(zhǔn)貯存液(100mmol/L):稱取枯燥純尿素(MW=60.06)0.6g,溶解于蒸儲(chǔ)水中,并稀釋至100ml ,加0.1g疊氮鈉防腐,置冰箱內(nèi)可穩(wěn)定半年.(4)尿素標(biāo)準(zhǔn)?應(yīng)用液(5mmol/L):取5.0ml貯存液用無(wú)氨蒸儲(chǔ)水稀釋至100ml.【操作】按表T4-1 進(jìn)行混勻后,置沸水中加熱12分鐘,置冷水中冷卻5分鐘后,用分光光度計(jì)在波長(zhǎng) 540nm 以空白管調(diào)至零點(diǎn).比色讀取標(biāo)準(zhǔn)管及測(cè)定管的吸光度.【計(jì)算】【正常參考值】2.868.20mmol/L 尿素【考前須知】1 .本法線性范圍達(dá) 14 mmol/L 尿素,如遇高于此濃度的標(biāo)本必須用生理

4、鹽水作適當(dāng)?shù)?稀釋后重測(cè),然后乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之.2 .試劑中參加硫氨月尿和鎘離子,增進(jìn)顯色強(qiáng)度和色澤穩(wěn)定性,但仍有輕度退色現(xiàn)象(每小時(shí)小于5%).加熱顯色冷卻后應(yīng)及時(shí)比色.3 .吸管必須校正,使用時(shí)務(wù)必注意清潔干凈,加量務(wù)必準(zhǔn)確.4 .世界衛(wèi)生組織推薦用mmol/L 尿素表示濃度,不再使用尿素氮一詞.5 .血清尿素增高的病理因素常見(jiàn)于腎臟原因,腎臟原因又可分為腎性、腎前或腎后：腎 性：急性腎小球腎炎、腎病晚期、腎功能衰竭、慢性腎盂腎炎及中毒性腎炎都可見(jiàn)血液中尿素含量增高.腎前或腎后：引起尿量顯著減少或尿閉,如脫水、水腫、腹水、循環(huán)功能衰竭、尿路結(jié)石或前列腺腫大引起的尿路梗阻等均可引起血清尿素

5、含量升高.此外,生理因素也可導(dǎo)致血清尿素增高.如體內(nèi)蛋白質(zhì)分解過(guò)多：急性傳染病、上消化道出血、大面積燒傷、 大手術(shù)后和甲狀腺功能抗進(jìn)等.雖然血清尿素增高,此時(shí)其它腎功能試驗(yàn)結(jié)果一般均正常.注：本法引自中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部醫(yī)政司編著的?全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程?尿素的測(cè)定方法可分為兩大類：一類直接法,尿素直接和某試劑作用, 測(cè)定其產(chǎn)物,最常見(jiàn)的為二乙酰一的法；另一類是 尿素酶法,用尿 素酶將尿素變成氨,然后用不同的方法測(cè)定 氨.1尿素酶法直接法：尿素酶法利用尿素酶催化尿素水解生成俊鹽,俊鹽可用納氏試劑 直接顯色、酚-次氯酸鹽顯色或酶偶聯(lián)反 應(yīng)顯色.尿素測(cè)定目前多采用尿素酶偶聯(lián)法：用尿素酶分解尿素產(chǎn)生

6、氨,氨在谷氨酸脫氫酶的作用下使 NADH氧化為NAD+時(shí),通過(guò)34 0nm吸光度的降低值可計(jì)算出尿素含量.此反響是目前自動(dòng)生化分析儀上常用的測(cè)定原理.此外,尿素酶水解尿素產(chǎn)生氨的速率,也可用電導(dǎo)的方法進(jìn)行測(cè)定,其電導(dǎo)的增加 與氨離子濃度有關(guān),反響只需要很短的時(shí)間,適用于自動(dòng)分析儀.2酚-次氯酸鹽顯色法：尿素酶水解尿素生成氨和酚及次氯酸鹽,在堿性環(huán)境中作用形成對(duì)-醍氯亞胺,亞硝基鐵氧化鈉催化此反 應(yīng)：又醍氯亞胺同另一分子的酚作用,形成 口引味酚,它在堿性溶液中產(chǎn)生藍(lán)色的解離型 口引味酚:此反響敏感,血清用量少10 口,無(wú)需蛋白沉淀,一般用于手工操作測(cè)定中.3納氏試劑 顯色法:尿素經(jīng)尿素酶作用后生

7、成氨,氨可與納氏試劑HgI2.2KI的強(qiáng)堿溶液作用,生成棕黃色的碘化雙汞俊.尿素酶法的優(yōu)點(diǎn)是反響專一,特異性強(qiáng),不受尿素類似物的影響,缺點(diǎn)是操作費(fèi)時(shí),且受體液中氨的影響.二乙酰一曲法直接法：尿素可與二乙酰作用,在強(qiáng)酸加熱的條件下,生成粉紅色的二 嗪化合物Fearom反響,在54 0nm比色,其顏色強(qiáng)度與尿素含量成正比.二乙酰不穩(wěn) 定,用二乙酰一曲代替, 后者遇酸水解成二乙酰.試劑中參加Fe3+或Cd2+及硫氨月尿,可提升靈敏度,增加顯色穩(wěn)定性,其中 Fe3+和Cd2+有氧化作用,還能消除生的干擾作 用.提升酸的濃度可增加靈敏度.二乙酰一的與尿素的反響不是專一的,與瓜氨酸也有顯色.本法靈敏、簡(jiǎn)單,產(chǎn)生的顏色穩(wěn)定,缺點(diǎn)是加熱時(shí)有異味釋放,一般臨床已很少使用此方法.尿素測(cè)定用血清或血漿,體液中尿素的濃度常用尿素中含有的氮來(lái)表示,稱為尿素