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1、western blot lab208實(shí)驗(yàn)方法與一年辛酸WB經(jīng)驗(yàn)總結(jié) 浙江海洋大學(xué)lab208閆允君試劑準(zhǔn)備Tris-Hcl0.05mol/L(7.4)轉(zhuǎn)膜緩沖液1TBST緩沖液210%SDS310%過(guò)硫酸銨（Aps）4.5×SDS-PAGE電泳緩沖液5.（用時(shí)稀釋成1x來(lái)用）20×TBS緩沖液6TBST緩沖液7native 1x電泳緩沖液（8.8）85x native樣品緩沖液（buffer）9考馬斯亮藍(lán)染色液：1L10考馬斯亮藍(lán)脫色液: 1L111%溴酚藍(lán)12SDS-PAGE：分離膠和濃縮膠135%脫脂牛奶14單去污劑裂解液（裂解細(xì)胞）15蛋白buffer(師姐自己取的

2、名)161.轉(zhuǎn)膜緩沖液：3.03g Tris-base，14.41g甘氨酸，1mL10%SDS，200ml甲醇溶于去離子水中定容至1L。2.TBST緩沖液：加入lmLTween-20（Tween為一種非離子型去污劑，有復(fù)性抗原的作用，可提高特異性的識(shí)別能力。Tween很粘稠，吸取時(shí)剪槍頭）至1Ll×TBS溶液中，混勻待用。3.10%SDS（十二烷基硫酸鈉）：10g SDS溶于去離子水中定容至100ml。親水基表面活性劑，起到助溶作用。因其易吸水，在配置時(shí)，用EP管稱量SDS，配制高濃度的溶液，再稀釋使用。白色或淺黃色結(jié)晶或粉末。有特殊氣味。在濕熱空氣中分解。易溶于水，溶于熱醇。熔點(diǎn)：

3、180（分解）。SDS是一種已知的能夠使蛋白質(zhì)變性的去污劑。它用于確定蛋白分子量的聚丙烯酰胺凝膠電泳。它也可以用于核酸抽提操作中破壞細(xì)胞壁及裂解核酸：蛋白復(fù)合物。在較高溫度下，破壞蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，使DNA釋放出來(lái)。在乳液聚合反應(yīng)中，可充當(dāng)兩相溶液的乳化劑。4.10%過(guò)硫酸銨（Aps）：0.1gAps用純水定容1ml。提前配制好后每個(gè)EP管中1ml保存于-20°C保存，不要反復(fù)凍融，每次拿出一管，用完后就扔掉，不再保存。過(guò)硫酸銨是催化劑，四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。在聚合過(guò)程中，TEMED催化過(guò)硫酸銨產(chǎn)生自由基，后者引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時(shí)甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)

4、生甲叉鍵交聯(lián)，從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。5. 5×SDS-PAGE電泳緩沖液：15.1gTris-base，94g甘氨酸，50mL10%SDS，溶于去離子水定容至1L6.20×TBS緩沖液：48.4gTris-base，160gNaCl，溶于去離子水，調(diào)節(jié)pH至7.6，定容至1L，室溫貯存。（實(shí)驗(yàn)室買(mǎi)的是10×TBS成品）7. TBST緩沖液：加入lmLTween-20（Tween為一種非離子型去污劑，有復(fù)性抗原的作用，可提高特異性的識(shí)別能力。Tween很粘稠，吸取時(shí)剪槍頭）至1Ll×TBS溶液中，混勻待用8. 1x native 緩沖液：3.0gTris(

5、25 mmol/L), 14.4g甘氨酸(192mmol/L)定容至1L。9.5x native樣品緩沖液（buffer）:10ml1M Tris-Hcl (ph=6.8, 312.5mmol/L)3.1mL50% 甘油5mL1%溴酚藍(lán)（終濃度：0.05%）0.5mL蒸餾水（純水）1.4 mL10.考馬斯亮藍(lán)染色液：1LR-2501.0g甲醇450mL蒸餾水（純水）450mL冰醋酸100mL11.考馬斯亮藍(lán)脫色液: 1L甲醇100mL冰醋酸100mL蒸餾水（純水）800mL12. 1%溴酚藍(lán): 1g溴酚藍(lán)定容于100mL無(wú)水乙醇。13. SDS-PAGE：分離膠和濃縮膠SDS-PAGE7.5%

6、分離膠1.5molTris-Hcl2.5 mlSDS-PAGE4%濃縮膠1.5molTris-Hcl0.5 mlH204.845 mlH201.945 ml10% SDS100 ul10% SDS100ul30%Arc-Bis2.5 ml30%Arc-Bis0.4 ml10% AP50ul10% AP50ulTEMED5ulTEMED5ul14.5%脫脂牛奶：5g Skim milk powder, 100mL TBS.15.單去污劑裂解液（50mmol/L Tris·HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1TritonX100，100mg/ml PMSF）：具體配制：1

7、mol/L Tris·HCl（pH8.0）（穩(wěn)定PH,對(duì)生物化學(xué)過(guò)程干擾很小，不與鈣、鎂離子及重金屬離子發(fā)生沉淀。）2.5ml，NaCl(降低蛋白質(zhì)在水中的溶解度) 0.438g，TritonX100(溶解脂質(zhì)，以增加抗體對(duì)細(xì)胞膜的通透性)（100%母液） 0.5ml，加蒸餾水至50ml。混勻后， 4保存。使用時(shí)，加入PMSF至終濃度為100mg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50l）。16蛋白buffer(師姐自己取的名，替代單去污劑裂解液)50 mMTris·HCl(ph7.5)100 mMNaCl10 mMEDTA(在不影響蛋白質(zhì)功能的情況下

8、去除干擾離子)1 mMPMSF（抑制蛋白酶）PMSF：花絮物質(zhì)苯甲基磺酰氟的英文簡(jiǎn)稱。使用：1）抑制絲氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，凝血酶）和巰基蛋白酶（如木瓜蛋白酶）；2） 10mg/ml溶于異丙醇（或無(wú)水乙醇）中；它對(duì)異丙醇沒(méi)有特殊要求，分析純即可，它也可以用DMSO進(jìn)行配置，儲(chǔ)存濃度同樣為100mM3）在室溫可保存一年,一般保存在-20度或4度.；4）工作濃度：17174ug/ml（0.11mM），儲(chǔ)存液濃度為100或200mM；5）在水液體溶液中不穩(wěn)定，30分鐘就會(huì)降解一半，必須在每一分離和純化步驟中加入新鮮的PMSF，樣品處理超過(guò)1h,補(bǔ)加一次。（見(jiàn)水分解，使用前加入）6）P

9、MSF劇毒，嚴(yán)重?fù)p害呼吸道粘膜、眼睛及皮膚，吸入、吞進(jìn)或通過(guò)皮膚吸收后有致命危險(xiǎn)。一，組織蛋白的提?。ㄕ麄€(gè)過(guò)程都要用滅過(guò)菌的槍頭和離心管，還有進(jìn)口直徑為3cm的一次性板子），稱量個(gè)體重，卵巢重，體長(zhǎng)，胴長(zhǎng)。PS:刺激樣品的處理（以師姐雌二醇的為例）1.取卵巢（例0.9g），平均分到9處，每份0.1g,其中一份放在2mL離心管中，加入1mL蛋白buffer（師姐自己取的名）和10uL PMSF作為空白對(duì)照。剩下的8份分別放在一次性板子上。所有的樣品都在蓋子上記號(hào)個(gè)體編號(hào)，重量，濃度，時(shí)間。（1）E2終濃度為10-6的兩個(gè)對(duì)照：1mL海水+1uL他莫昔芬母液（抑制雌激素受體），30min后，+10

10、uL10-4E2(終濃度為10-6)1mL海水+10uL10-4E2（終濃度為10-6）（2）E2終濃度為10-8的兩個(gè)對(duì)照：1mL海水+1uL他莫昔芬母液（抑制雌激素受體），30min后，+10uL10-6E2(終濃度為10-8)1mL海水+10uL10-6E2（終濃度為10-8）（3）E2終濃度為10-10的兩個(gè)對(duì)照：1mL海水+1uL他莫昔芬母液（抑制雌激素受體），30min后，+10uL10-8E2(終濃度為10-10)1mL海水+10uL10-8E2（終濃度為10-10）（4）E2終濃度為10-12的兩個(gè)對(duì)照：1mL海水+1uL他莫昔芬母液（抑制雌激素受體），30min后，+10uL

11、10-10E2(終濃度為10-12)1mL海水+10uL10-4E2（終濃度為10-12）空白對(duì)照組樣品勻漿(按照組織蛋白的提取方法)，-70保存。另外8個(gè)孵育8個(gè)小時(shí)后，將液體倒掉，用蛋白buffer涮洗，然后加入1mL蛋白buffer和10uL的PMSF,勻漿，提取組織蛋白。1.取少量組織（每個(gè)樣約1g），用PBS沖洗，放入1.5凍存管中，加入裂解液（蛋白buffer和PMSF），用勻漿器勻漿，期間注意用水和75%梯度來(lái)清洗勻漿器，避免樣品之間的交叉。2.10000rpm, 4，15分鐘，取上清，重復(fù)三次。-70保存。3.(SDSPAGE電泳第二步跑電泳的時(shí)候準(zhǔn)備)，取100ul 蛋白上清

12、液，加入SDS上樣緩沖液（加在蓋子上，按8×加，即100µL樣品加12.5µL，離心）100°C變性10 min，3000-4000 rpm離心收集細(xì)胞，輕微震蕩（由于會(huì)爆沸將蓋子彈開(kāi)，樣品濺出，講溫度設(shè)置成97°C，金屬浴上加熱7min變性（上面壓上東西），震蕩，離心（4000rpm，90s），重復(fù)兩次），樣品待用，或-20°C(不超過(guò)一周)備用。變性的目的：破壞蛋白質(zhì)二級(jí).三級(jí).四級(jí)結(jié)構(gòu),空間結(jié)構(gòu)影響蛋白質(zhì)電泳的速率,用SDS變性,大家都是線性結(jié)構(gòu)了.同時(shí)SDS可以給蛋白質(zhì)加上很多負(fù)電荷,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出蛋白質(zhì)本身所帶電荷.這樣就可以把所

13、有的蛋白質(zhì)看做是帶相等的電荷.這樣大家在電場(chǎng)里面泳動(dòng).影響速率的唯一一個(gè)因素就是分子量了.這樣電泳才能區(qū)分開(kāi)不同的分子量的蛋白質(zhì)二，SDSPAGE電泳基本原理：· SDS-PAGE 是在蛋白質(zhì)樣品中加入SDS和含有巰基乙醇的樣品處理液，SDS是一種很強(qiáng)的陰離子表面活性劑，它可以斷開(kāi)分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。· 強(qiáng)還原劑巰基乙醇（或二硫蘇糖醇，DTT）可以斷開(kāi)二硫鍵破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚后的側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。· 蛋白質(zhì)分子結(jié)合SDS陰離子后，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)

14、超 過(guò)了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間所帶凈電荷的差異。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要決定于亞基的相對(duì)分子質(zhì)量，而與其所帶電荷的性質(zhì)無(wú)關(guān)。（1）具有相同的形狀，形狀像一個(gè)長(zhǎng)橢圓棒（2）平均1g 蛋白質(zhì)結(jié)合1.4g SDS（3）短軸對(duì)不同的蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束基本上是相同的（4）長(zhǎng)軸的長(zhǎng)度則與亞基分子量的大小成正比（5）SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳時(shí)，不再受蛋白質(zhì)電荷與形狀的影響，而只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。1.清洗玻璃板：一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過(guò)后用自來(lái)水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。2. 灌膠與上樣（1）玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊（短邊的玻璃板

15、朝外）。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。（操作時(shí)要使兩玻璃對(duì)齊，以免漏膠。）（2） 按前面方法配7.5%分離膠，立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)，可用10ml槍吸取5ml膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。然后膠上加一層水（純水），液封后的膠凝的更快。（灌膠時(shí)開(kāi)始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變型。）（3 ）當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)（約20min），說(shuō)明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。（4 ）按前面方法配4%的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃

16、縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過(guò)程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。（5 ）用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。）（6）加足夠的SDS-PAGE電泳緩沖液后開(kāi)始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過(guò)內(nèi)測(cè)的小玻璃板。）用槍貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將槍頭至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣

17、泡也可能使樣品溢出。）3.電泳 每孔加樣15-20µL（18µL），30V-45V（35V）恒壓濃縮膠，待樣品進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)至120V，根據(jù)Marker指示，待樣品基本分離后關(guān)閉電源。因?yàn)樯蠈拥臐饪s膠，目的是使蛋白變性后在進(jìn)入分離膠前，能夠都在同一起跑線上，低電壓跑的慢，可以使蛋白更好的壓在同一起跑線上放膠板時(shí)，短板都朝內(nèi)，因此加樣時(shí)注意方向。膠板兩端要封閉，可以用marker（3-4µL）或者細(xì)胞裂解液加buffer封閉（18µL）。加樣時(shí)要快，以免樣上浮，加樣前在膠板內(nèi)側(cè)倒上電泳緩沖液，加完樣后在旁邊倒?jié)M電泳液，用移液槍把內(nèi)外側(cè)的樣加平。ps:

18、 SDSPAGE膠考馬斯亮藍(lán)R-250染色將膠浸沒(méi)在考馬斯亮藍(lán)R-250染色試劑的盤(pán)中，放在小搖床上搖2個(gè)小時(shí)。然后倒掉，加脫色液，過(guò)夜。三，轉(zhuǎn)膜PVDF膜PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白質(zhì)印跡法中常用的一種固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔徑有大有小，隨著膜孔徑的不斷減小，膜對(duì)低分子量的蛋白結(jié)合就越牢固。大于20000的蛋白選用0.45um的膜，小于20000的蛋白選用0.2um的膜。PVDF膜在使用時(shí)需預(yù)處理，用甲醇處理的目的是活化膜上的正電基團(tuán)，使其更容易與帶負(fù)電的蛋白結(jié)合。PVDF膜具有較高的機(jī)械強(qiáng)度，是印跡法中的理想固相支持物材料。1.用20%的甲醇浸泡PVDF膜3min，后轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10 min，在轉(zhuǎn)膜夾中鋪好海綿、濾紙（2層）（海綿和濾紙要浸濕）（從下往上:海綿濾紙濾紙PVDF膠濾紙濾紙海綿），再鋪好割下的目的條帶（割膠時(shí)不要滑動(dòng)割，注意膠的方向），（鋪好PVDF膜后，將其浸濕），再依次鋪好濾紙（2層）及海綿后夾好夾板(鋪各層時(shí)避免起泡)，1.5mm的225-230 mA恒流轉(zhuǎn)膜55-60 min，1.0mm的210mA，55min。