反相高效液相色譜法測(cè)定尿樣中維生素C、B1和B2的濃度

1、如有你有幫助，請(qǐng)購(gòu)買(mǎi)下載，謝謝！反相高效液相色譜法測(cè)定尿樣中維生素C、 B1 和 B 2 的濃度作者：李映章 張志宇 梁晟楠【關(guān)鍵詞】 色譜法水溶性維生素與人體的生長(zhǎng)發(fā)育和健康有著密切關(guān)系，在人體的生命活動(dòng)中具有十分重要的作用，它們?cè)谌梭w內(nèi)的含量是衡量一個(gè)人的健康指標(biāo)。 目前 VitC ， VitB 1 和 VitB 2 傳統(tǒng)測(cè)定方法中， VitC 常用 2， 4-二硝基苯肼比色法和 2， 6-二氯靛酚鈉鹽滴定， 這兩個(gè)方法靈敏度較低， 特異性差， 目前一般科研項(xiàng)目都不采用這個(gè)滴定法;Vit B1 和 Vit B 2 可用熒光法，但該法前期處理操作繁冗，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，其處理方法和過(guò)程增加了影響檢測(cè)

2、精確度欠佳的人為因素。本文數(shù)據(jù)采用液相色譜法分離檢測(cè)。1 實(shí)驗(yàn)部分1.1 儀器 SY5000LIQUID CHROMATOGR(APBIIEIFN) 具 UV/VIS 檢測(cè)器，色譜柱：Lichrosphcr C18, 4.6 X250, 5m TL9900色譜數(shù) 據(jù)工作站。1.2 試劑 本實(shí)驗(yàn)所用水為石英亞沸蒸儲(chǔ)水，以0.45 m水性 微孔濾膜過(guò)濾。 所用試劑均為分析純( AR) ， 甲醇為一級(jí)色譜純， 標(biāo)樣維生素C、 B 1 、 B 2 貯備液以 0.01mol/L 草酸配制，在4冰箱中保存。VitC臨用新配。流動(dòng)相 A:0.05ml/L KH2 PO4緩沖?取(pH6.00); 流動(dòng)相B:

3、甲醇。均經(jīng)0.45"m水性微孔濾膜過(guò)濾，超聲波脫氣后使用。 整個(gè)操作應(yīng)避光，且操作過(guò)程要迅速，以防維生素被氧化。1.3 樣品處理 檢測(cè)學(xué)生起床后將昨晚尿排空， 空腹以 200ml 水送服VitC500mg， VitB 1 5mg 和 VitB 2 5mg ，然后收集服藥后 4h內(nèi)排出的尿于1000ml 廣口棕色瓶中， 并加 4%的草酸防護(hù)，尿液經(jīng) 0.45wm微孔過(guò)濾器過(guò)濾 4,超聲波脫氣后即可上色譜柱分離檢測(cè)。1.4 色譜儀工作條件色譜檢測(cè)的流動(dòng)相由磷酸二氫鉀 A 和甲醇B組成，其比例為90： 10和65： 35。流速1.0ml/min ,柱溫：室 溫，波長(zhǎng):266nm,柱前壓：1

4、68240ATM1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作配制一系列不同濃度的混合液， 經(jīng)檢測(cè)得出的數(shù)據(jù)作出如下3 種維生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖 1 示） 。1.6 色譜檢測(cè) 分時(shí)間段采樣， 每采一批樣有30 個(gè)左右尿樣。樣品處理后， 按標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測(cè)的條件， 以外標(biāo)法檢測(cè) VitC 、 VitB 1 和 VitB 2 ,經(jīng)TL9900色譜數(shù)據(jù)工作站處理檢測(cè)出的數(shù)據(jù)和圖形。2 檢測(cè)結(jié)果經(jīng)檢測(cè)，得出樣品中所含3 種維生素的量，通過(guò)分析可得出如下結(jié)果（圖 2 為一個(gè)樣品的 VitC 、 VitB 1 和 VitB 2 3 種維生素的色譜分析圖） :色譜法檢測(cè)得此樣品中 VitC 、 VitB 1 和 VitB 2 的峰高分別

5、 為1805mV 40mW 386mV從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出其4h內(nèi)排出尿樣中的 三種維生素的量分別為 2.58mg、0.44mg和0.42mg。從五個(gè)斑151個(gè) 尿樣檢測(cè)結(jié)果來(lái)看， VitC 缺乏的占檢測(cè)總數(shù)的15.23%，不足的占13.90%，正常的占70.87%;VitB 1 缺乏的占1.99%，不足的占3.31%，正常的占 94.70%;VitB 2 不足的占16.56%，正常的占52.31%，良好的占31.13%（正常以上的占83.44%） 1 。3 討論與總結(jié)3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 待檢測(cè)的3種維生素中，VitC在261nmi VitB 1在246nmi VitB 2在260nm波長(zhǎng)處有

6、最大的吸收2, 3,本次實(shí)驗(yàn)曾分別選用以上 3 種波長(zhǎng)檢測(cè)這三種維生素混合液，以上波 長(zhǎng)都不是這3 種維生素混合液的最大吸收波長(zhǎng)，經(jīng)試驗(yàn)，最后確定266nm波長(zhǎng)為三種待檢測(cè)維生素的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。3.2 回收率 測(cè)得人體尿樣的 3種維生素的含量， 再加入已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，混合后按1.6 項(xiàng)操作，測(cè)其含量，得出其平均回收率的范圍是90.12%99.85%,變異系數(shù)在1.98%6.56位間，說(shuō)明此種方法檢測(cè)人體尿樣中的維生素C、 B 1 和 B 2 3 種水溶性維生素的含量是可靠的。3.3 流動(dòng)相確定流動(dòng)相由磷酸二氫鉀緩沖液和甲醇組成， 本實(shí)驗(yàn)曾以不同比例的流動(dòng)相和波長(zhǎng)對(duì)3 種維生素C、 B 1 、

7、 B 2 進(jìn)行反復(fù)分離檢測(cè)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，最終摸索出檢峰形好，保留時(shí)間短的流動(dòng)相組成比例。在磷酸二氫甲緩沖液：甲醇 =90 : 10情況下，VitC保留 時(shí)間在 2.280 2.300min 之內(nèi)，VitB 1 在 5.250 5.400min 之內(nèi)，VitB 2在20min之后。此種情況分析一個(gè)的混合樣至少需要 25min （含平 衡時(shí)間）。在流動(dòng)相比例65： 35的情況下，VitB 1保留時(shí)間9.120 9.310min 。中 VitC 和 VitB 1 出峰不好，拖尾嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)曾試行以梯度洗脫法檢測(cè)， 可將 3 種維生素分開(kāi)， 但檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)， 至少在 25min 以上，且出現(xiàn)拖尾情況?？紤]

8、到本實(shí)驗(yàn)要檢測(cè)的樣品數(shù)目多，需以盡快的速度檢測(cè)，故采取分步檢測(cè)法：在流動(dòng)相比例90 ： 10和65 ： 35情況下分別檢測(cè) VitC 、 VitB 1 和 VitB 2 ， 兩次檢測(cè)合計(jì)不用 20min， 且它們分離得好，波型都是VV波型。3.4 標(biāo)準(zhǔn)樣品溶劑的選擇在 VitC 、 VitB 1 和 VitB 2 的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制中，本實(shí)驗(yàn)曾采用鹽酸、偏磷酸和草酸作溶劑。從實(shí)驗(yàn)情況來(lái)看， 草酸是以上3 種維生素較好的溶劑， 其獲得檢測(cè)數(shù)據(jù)誤差小，檢測(cè)波型好，這可能是草酸對(duì)VitC 、 VitB 1 和 VitB 2 具有更好的穩(wěn)定作用。3.5 流速 流速對(duì)檢測(cè)精確度影響不大， 但對(duì)檢測(cè)保留時(shí)間影

9、響較大。如流速1.0ml/1min ,柱前壓稍大一些，在200240ATM之間，但儀器仍然可承受 ; 如果流速變小， 如 0.8ml/min ， 雖然柱前壓隨之變小，約168atm，但保留時(shí)間卻延遲510min,這對(duì)要檢測(cè)大量樣品是不可取的。故本實(shí)驗(yàn)采用 1.0ml/min 流速。3.6 待檢樣品處理的注意事項(xiàng) 由于維生素類(lèi)物質(zhì)穩(wěn)定性不好， 樣品在檢測(cè)之前， 加入適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑， 力求低溫保存， 防強(qiáng)光照，爭(zhēng)取在最短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，以防維生素被氧化。這些都是取得較高檢測(cè)精確度的重要性舉措。3.7 總結(jié) 液相色譜法檢測(cè)快捷，特異性好，靈敏度高 ; 加上儀器具有色譜數(shù)據(jù)工作站軟件，對(duì)數(shù)據(jù)和圖形處理極為方便。故該方法是檢測(cè)維生素物質(zhì)的理想方法。參考文獻(xiàn)1 于守祥， 劉志誠(chéng) . 營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生監(jiān)督檢測(cè)方法指南. 北京 :人民衛(wèi)生出版社， 1980， 9.2 潘建國(guó)，王開(kāi)發(fā). 高效液相色譜法同步測(cè)定花粉中的水溶性維生素 . 上海 : 同濟(jì)大學(xué)出版社