細(xì)胞培養(yǎng)概述級(jí)研

1、細(xì)胞培養(yǎng)總論劉 梅南通大學(xué)神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室與神經(jīng)科學(xué)系一、細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件無菌/滅菌條件：凈化工作室，風(fēng)淋室，傳遞窗，高效過濾器， 潔凈層流罩，生物安全柜，超凈工作臺(tái)，紫外燈， 電熱干燥箱，濾器，高壓滅菌器，抗生素 細(xì)胞生長條件：純水蒸餾器，純水儀，培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶， co2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基，血清細(xì)胞檢測條件：倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀 ，微孔板震蕩器， 高速離心機(jī)，移液器 細(xì)胞保存條件：液氮罐實(shí)驗(yàn)室安全： 生物實(shí)驗(yàn)室安全，p1, p2, p3 實(shí)驗(yàn)室安全凈化工作室- 我國藥品生產(chǎn)潔凈室（區(qū)）空氣潔凈度標(biāo)準(zhǔn) -潔凈度級(jí)別塵粒最大允許數(shù)/立方米塵粒最大允許數(shù)0.5um5um浮游菌/立方沉降菌/皿1003

2、,50005110,000350,0002,0001003100,0003,500,00020,00050010300,00010,500,00060,000na15細(xì)胞培養(yǎng)室風(fēng)淋室風(fēng)淋室是生物潔凈室的理想配套設(shè)備，它不僅可以清除人體和物品表面附著的塵埃，減少帶入潔凈室的灰塵量，而且兼有氣閘室的功能，可防止非潔凈空氣的侵入。風(fēng)淋室的板壁采用輕質(zhì)隔熱夾芯鋼板，吹淋板采用進(jìn)口不銹鋼制作，吹淋口方向可調(diào)，風(fēng)淋時(shí)間可在30-99秒間的調(diào)整。風(fēng)淋室可以配合加熱器，冬天可以加熱，溫度可調(diào)，一般控制溫度在30-35較為適宜。傳遞窗 該裝置是一種潔凈室的輔助設(shè)備，主要用于潔凈區(qū)與潔凈區(qū)，潔凈區(qū)與非潔凈區(qū)之間小

3、件物品的傳遞，以減少潔凈室的開門次數(shù)，把對潔凈區(qū)的污染降低到最低程度。高效過濾器 高效過濾器是用超細(xì)玻璃纖維紙作濾料，膠板紙作分隔板，可與鋁合金框、木框及鍍鋅鋼板框組合而成。 特點(diǎn)：具有低阻高效、輕質(zhì)、容塵量大等特點(diǎn)，層高的要求，縮小凈化設(shè)備靜壓箱體積等優(yōu)點(diǎn)。 適用于常溫常壓常濕條件下環(huán)境空氣的凈化，尤其適用于需要高效空氣過濾器覆蓋率高的凈化廠房。潔凈層流罩 層流罩是可提供局部高潔凈環(huán)境的空氣凈化設(shè)備。它主要由箱體、風(fēng)機(jī)。初效空氣過濾器、高效空氣過濾器、阻尼層、燈具等組成，外殼為不銹鋼或彩鋼板。 潔凈層流罩是將空氣經(jīng)風(fēng)機(jī)以一定的風(fēng)壓通過高效空氣過濾器后，由阻尼層均壓，使?jié)崈艨諝獬蚀怪睂恿餍蜌饬?/p>

4、送入工作區(qū)，從而保證了工作區(qū)內(nèi)達(dá)到工藝所需的高潔凈度。技術(shù)性能參數(shù)：技術(shù)性能參數(shù)：(1)凈化等級(jí)：100級(jí)(美國聯(lián)邦標(biāo)準(zhǔn)209e)(2)平均風(fēng)速：0.250.45m/s(可調(diào))(3)噪音：62db(a)超凈工作臺(tái) 超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。 適用范圍 適用性能凈i iiiaiiaiibiibiiiiiia1a2b1b2保護(hù)對象人-+環(huán)-+樣+-+實(shí)驗(yàn)室i+-ii-+-iii-+-+生物安全柜的選擇 一種既能使操作造成無菌、無塵的局部空氣環(huán)境，保證檢驗(yàn)、檢測不受污染，又能保證被研究的

5、對象（如病菌、細(xì)菌等）不外溢，保護(hù)周圍環(huán)境及操作人員的安全隔離設(shè)備。該設(shè)備可廣泛應(yīng)用于低、中等危險(xiǎn)度（病原體1-3，dna重組p1-p3）的臨床細(xì)菌學(xué)，病毒學(xué)、微生物學(xué)、組織培養(yǎng)、生物學(xué)及生命科學(xué)的研究，加工、檢驗(yàn)部門。ii級(jí)a型生物安全柜100fpm吸風(fēng)量70%氣體循環(huán)使用.30%氣體排出，既可以接管道外排，也可以不接管道直接排放在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境空氣 污染的空氣 hepa 過濾的空氣 負(fù)壓的污染空氣 a2型生物安全柜環(huán)境空氣 污染的空氣 hepa 過濾的空氣 負(fù)壓的污染空氣b2 型生物安全柜紫外燈 主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺(tái)、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒紫外線消毒。干熱消毒（160 ，2小時(shí)）,

6、主要用于玻璃器皿消毒 電熱干燥箱濾 器大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌。zeiss濾器(過濾除菌)：大容量高壓滅菌器 全自動(dòng)手提式滅菌器 濕熱滅菌裝置自動(dòng)雙重純水蒸餾器 純水儀細(xì)胞培養(yǎng)用水裝置培養(yǎng)板與培養(yǎng)瓶co2培養(yǎng)箱co2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ，100%濕度，5co2 。使用co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問題： 用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)， 需將瓶蓋微松，以保證通氣。 保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。 定期消毒（90 ，14 h)。 箱內(nèi)滅菌蒸餾水3000毫升蒸餾水 以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。移液器培養(yǎng)細(xì)胞的觀察正置顯微鏡酶標(biāo)儀 微孔板震蕩器高速離心機(jī) 超速離心機(jī) 液氮

7、罐實(shí)驗(yàn)室安全層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室管理規(guī)則一級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室二級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室三級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室四級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室管理規(guī)則 重點(diǎn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)為萬級(jí)，專供細(xì)胞培養(yǎng)、凍存以及細(xì)胞治療用。層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室的總體要求：經(jīng)濟(jì)、有序、高效、安全。初步制定相關(guān)制度如下：必須取得實(shí)驗(yàn)室相關(guān)實(shí)驗(yàn)技能考試合格方可進(jìn)入層流凈化室；在本室工作的實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)嚴(yán)格遵守本室工作守則，外來人員在進(jìn)入凈化室工作之前，必須接受培訓(xùn)；沒有經(jīng)過培訓(xùn)的人員不得單獨(dú)進(jìn)入凈化室工作；進(jìn)入凈化室后要保持安靜，不得大聲喧嘩。1.準(zhǔn)入制度2.安全制度層流凈化室內(nèi)必須注意安全用電；謹(jǐn)慎使用酒精

8、燈，不能在有明火的情況下加、換酒精； 實(shí)驗(yàn)人員自覺維護(hù)室內(nèi)設(shè)備的安全使用，對室內(nèi)的儀器如co2孵箱等要經(jīng)常注意機(jī)器運(yùn)轉(zhuǎn)情況，發(fā)現(xiàn)問題及時(shí)檢修或報(bào)告請人檢修；離開層流凈化室必須斷開必要的儀器電源；對不符合層流凈化室安全規(guī)定的行為主動(dòng)報(bào)告主管老師。 3.衛(wèi)生消毒制度一般情況下細(xì)胞間每日消毒一次（包括緩沖間），方法為紫外線消毒（每次30分鐘至1小時(shí)）一次，另外每周用10乳酸在緊閉門窗下熏蒸30分鐘；實(shí)驗(yàn)完畢應(yīng)及時(shí)清理所用物品，注意臺(tái)面整潔；及時(shí)清洗所用隔離衣，并高壓滅菌后存放于指定位置； 除實(shí)驗(yàn)必須的用品外，其它物品不得帶入凈化室； 層流凈化室內(nèi)所用儀器及附屬設(shè)備均應(yīng)在指定范圍內(nèi)使用，不得隨意轉(zhuǎn)移地

9、點(diǎn)，以便他人順利使用；層流凈化室實(shí)施值日生負(fù)責(zé)制，值班人員負(fù)責(zé)檢查室內(nèi)是否保持清潔整齊，督促違反規(guī)定者改正錯(cuò)誤。4.出入制度層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室共有兩個(gè)緩沖間，進(jìn)入每個(gè)緩沖間必須更換指定消毒的拖鞋；穿戴好消毒的鞋、帽、口罩后不得逆行離開層流凈化室；人員流動(dòng)：原則為進(jìn)出凈化室應(yīng)按次序開、關(guān)門，只有將前面打開的門關(guān)閉后才允許打開下一個(gè)門，出入線路絕對不能逆行，使緩沖間起到應(yīng)有的作用。物品流動(dòng)：所有進(jìn)出層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室的物品均應(yīng)通過傳遞窗進(jìn)行；物品進(jìn)入層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室時(shí)，應(yīng)先打開傳遞窗外側(cè)門，將物品放入傳遞窗，關(guān)閉傳遞窗外側(cè)門，打開紫外燈照射15分鐘；人員進(jìn)入層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室后，關(guān)閉紫外燈，打開

10、傳遞窗內(nèi)側(cè)門，取出物品；物品出室次序與以上進(jìn)室次序相反，但不需紫外線照射。二、培養(yǎng)細(xì)胞的生長條件 細(xì)胞的營養(yǎng)需要 細(xì)胞的生存環(huán)境 滲透壓: 溫度: 37，o2 co2: 5%，co2 +h2o h2co3 h+ + hco3- ph: 7.27.4 無污染 無毒細(xì)胞培養(yǎng)常用器材處理方法體外培養(yǎng)細(xì)胞使用的器材品種較多。離體細(xì)胞對各種毒物都很敏感，所用器材的清洗、消毒處理是培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵之一。清潔液的配制200100063強(qiáng) 液1000200120次強(qiáng)酸1000100100弱 液蒸餾水（ml）濃硫酸（ml）重鉻酸鉀（克）組成強(qiáng)度200100063強(qiáng) 液1000200120次強(qiáng)酸10001001

11、00弱 液蒸餾水（ml）濃硫酸（ml）重鉻酸鉀（克）組成強(qiáng)度一、玻璃器材一、玻璃器材（各種規(guī)格的玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、吸管、離心管等）浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉）、清潔液處理（24小時(shí)）、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50烘干包裝殺菌。一般用121磅高壓蒸氣滅菌20分鐘。二、塑料器材二、塑料器材（多孔培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶及吸嘴等）塑料器皿若反復(fù)使用：使用后，先用自來水浸泡沖洗、晾干，再用3%hcl或2%naoh溶液浸泡過夜，用自來水充分沖洗，雙蒸水沖洗，晾干。采用紫外線直接照射或輻照滅菌辦法。清洗時(shí)要防止產(chǎn)生劃痕。三、橡皮器材三、橡皮器材選擇質(zhì)軟、耐高溫、毒性小的橡皮制品(最好是硅制品)。

12、新購置的自來水沖洗去，5%氫氧化鈉煮沸15分鐘，自來水沖洗，4%鹽酸煮沸15分鐘，自來水沖洗，單蒸水沖洗，雙蒸水(或去離子水)沖洗，晾干后包裝或置于鋁盒內(nèi)，用121高壓蒸氣滅菌20分鐘。四、金屬器材四、金屬器材（解剖器械，剪刀、鑷子、手術(shù)刀、解剖刀、血管鉗、組織鑷、眼科鑷及各種型號(hào)針頭等）新的金屬器材，先用紙擦去表面的油脂，再用洗衣粉煮沸，水洗，擦干后再用95%酒精紗布擦干，包裝或置鋁盒內(nèi)于121高壓蒸氣滅菌20分鐘。已用過的金屬器材，及時(shí)用酒精棉球擦干凈，滅菌。五、其他物品五、其他物品紗布、注射器的針頭等；各種人工合成培養(yǎng)液、緩沖液和酶 等、過濾除菌。消毒滅菌前所用的包裝材料可用牛皮紙、硫酸

13、紙、棉布、鋁飯盒和特制玻璃（或金屬）消毒筒等，可根據(jù)器材大小、形態(tài)選用，采取局部包裝或部分包裝，并用線繩扎緊。水：新鮮配置的三蒸水或去離子水水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液平衡鹽溶液(balanced salt solution(balanced salt solution，bss)bss)又稱生理鹽水或鹽溶液，是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的基本液體。它主要由無機(jī)鹽和葡萄糖配制而成，起著維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度等重要作用。配液時(shí)注意：（1）用水；配制先后順序；稱量，要看清藥品的規(guī)格、純度、結(jié)晶水的數(shù)量等。（2）物質(zhì)的純度，常用的純度有優(yōu)級(jí)純(特級(jí)純)，分析純（ar）和化學(xué)純（cd）三種。（3）

14、物質(zhì)的可溶性，避免沉淀析出。（4）物質(zhì)的穩(wěn)定性，如葡萄糖只能在10磅下維持1520分鐘。（5）貯存液 通常先配制成10倍或100倍的一系列母液，用前臨時(shí)混合和稀釋，過濾除菌備用。常用的緩沖液：生理鹽水、pb、pbs(注意有無鈣鎂離子)、 hanks液（含有鈣鎂離子、葡萄糖、酚紅）細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制ph調(diào)節(jié)液調(diào)節(jié)液(1)碳酸氫鈉液可根據(jù)需要與使用方便配制10%以下的各種濃度。先用雙蒸水溶解后，需經(jīng)過濾除菌，分裝小瓶中。亦可使用高壓蒸氣滅菌，密封，4冰箱保存。市售有5%10%濃度的安瓿封裝品，使用也很方便。在調(diào)節(jié)ph過程中或超過要求值時(shí)，可用高壓滅菌的10%醋酸溶液或以co2調(diào)節(jié)。(2)hepes

15、緩沖液是一種可以保持細(xì)胞培養(yǎng)過程中ph值較長時(shí)間穩(wěn)定的氫離子緩沖劑。通常使用濃度為1015mmol/l。配制時(shí)，稱取所需的hepes量，用培養(yǎng)液溶解，用1mmol/lnaoh調(diào)節(jié)ph至7.0，過濾除菌分裝小瓶中，4冰箱保存。消化液消化液胰蛋白酶溶液 一種黃白色粉末，易受潮，應(yīng)密封放置陰暗干燥處。它的主要作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，從而使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫落并使細(xì)胞游離分散開來。常用濃度為0.25%或0.5%胰蛋白酶。edta(乙烯二胺與乙酸或versene)溶液 edta是一種化學(xué)螯合劑，毒性小，對貼壁細(xì)胞有離散作用。一般使用濃度為0.02%。 稱0.1g 溶解于500ml無鈣鎂離子磷酸緩沖液

16、中，15磅30分鐘高壓滅菌，4或室溫保存。胰蛋白酶edta溶液 0.5%胰蛋白酶液96ml，1%edta液4ml，無鈣鎂離子緩沖液100ml?？股厝芤嚎股厝芤簽榉乐辜?xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染，一般在培養(yǎng)液中加入青霉素鈉鹽和硫酸鏈霉素，其濃度分別為每毫升含100u和100g。配制時(shí)取青霉素1106和鏈霉素1106g，溶于100mlhanks或pbs中，使其含量為青霉素1104u/ml，鏈霉素1104g/ml，使用時(shí)每100ml培養(yǎng)液中加入0.51ml。培養(yǎng)基u 培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基： 天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛

17、胚浸液）。 優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好。 缺點(diǎn)：來源受限。成分復(fù)雜，影響對某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染。 合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如tc199、mem、rpmi-1640、dmem等。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。成本低 。 缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要。 人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。 血清中含有： 多種蛋白質(zhì)（白蛋白

18、、球蛋白、鐵蛋白等）； 多種金屬離子； 激素；各種生長因子； 促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等； 胰酶抑制因子； 轉(zhuǎn)移蛋白； 不明成分。 血 清 一般說來，含5小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死，但支持細(xì)胞生長一般需加10血清。 對于血清支持細(xì)因生長的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚。 血清中不僅存在促細(xì)胞生長因子，同對也存在細(xì)胞生長抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。 在生長因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。血清的作用無血清培養(yǎng)基的主要研制策略

19、：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充各種必需因子，如激素、生長因子 、結(jié)合蛋白 、貼壁和擴(kuò)展因子 等。無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充成分組成。1975年，sato首次成功地用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細(xì)胞株，近20多年來已報(bào)道了幾十種細(xì)胞系在無血清培養(yǎng)基中成功地生長和增殖。但是向無清培養(yǎng)液中能促進(jìn)細(xì)胞系生長的補(bǔ)加物都是獨(dú)特的。適用于某種細(xì)胞株的培養(yǎng)液，很可能不適合另一種細(xì)胞株的生長。即使同源組織的不同細(xì)胞株，所需補(bǔ)加物也不同。無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的使用保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少了細(xì)胞污染，簡化了提純和鑒定各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序。無血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣。目前，絕大多數(shù)人工合成培養(yǎng)

20、基使用時(shí)還需添加血清。 無血清培養(yǎng)基 血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。 常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。 優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。 血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56 ，30 分鐘。 血清的消毒：過濾除菌。血清的使用 在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長。 通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。 慶大霉素：每毫升100單位-方便、廣譜、穩(wěn)定?？咕氐氖褂没A(chǔ)培養(yǎng)基 80一95血清 5一20碳酸氫鈉 2.0 g/l青霉素 100單位

21、/毫升鏈霉素 100微克/毫升完全培養(yǎng)基的組成 合成培養(yǎng)基（粉） 1袋 碳酸氫鈉 2.0 g 青霉素 100單位毫升 鏈霉素 100微克毫升 加三蒸水 至1000ml 過濾除菌，調(diào)節(jié)ph值至7.2 加血清（終濃度 10）。 培養(yǎng)基的配制三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作技術(shù) 體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。即便使用設(shè)備完善的實(shí)驗(yàn)室，若實(shí)驗(yàn)者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范,也會(huì)導(dǎo)致污染。因而,為在一切操作中最大可能地保證無菌，每一項(xiàng)工作都必須做到有條不紊和完全可靠。 消毒(disinfection)和消毒劑(disinfectant)滅菌(sterilization)防腐(

22、antisepsis)和防腐劑抑菌(bacteriostasis)和抑菌劑(bacteriostatic)無菌(asepsis)無菌技術(shù)/無菌操作(antiseptic technique) 在開始實(shí)驗(yàn)前要制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點(diǎn)無誤后將其放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺(tái))內(nèi)，然后開始消毒。這可以避免開始實(shí)驗(yàn)后，因物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會(huì)?！九囵B(yǎng)前準(zhǔn)備】 無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面一次(拖布專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用75酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。在工作

23、臺(tái)面消毒時(shí)切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時(shí)照射紫外線，消毒時(shí)工作臺(tái)面上用品不要過多或重疊放置，否則會(huì)遮擋射線降低消毒效果。操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺(tái)內(nèi)同時(shí)紫外線消毒?！静僮饕跋尽?原則上和外科手術(shù)相同。平時(shí)僅做觀察不做培養(yǎng)操作時(shí)，可穿著細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)紫外線照射30min的清潔工作服。在利用超凈臺(tái)工作時(shí)，因整個(gè)前臂要伸入箱內(nèi)，應(yīng)著長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用75酒精消毒手。如果實(shí)驗(yàn)過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。 【洗手和著裝】 在無菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無菌工作時(shí)，首先要點(diǎn)燃

24、酒精燈。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。 培養(yǎng)瓶 滴管、試管、吸管 接種環(huán)、接種針 【火焰消毒】 進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。 不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。 【操作】【培養(yǎng)細(xì)胞的觀察】肉眼觀察培養(yǎng)物顏色及混濁度倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)【細(xì)胞培養(yǎng)的污染和檢測】細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌和病毒。無菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等是主要的污染源。 嚴(yán)格的無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。 肉眼直接

25、觀察法、培養(yǎng)檢查法、顯微鏡觀察法1. 細(xì)菌和真菌的污染和檢測2.支原體的污染和檢測造成支原體高污染率的原因有多種 1. 支原體大小0.10.8 m，無細(xì)胞壁，可透過一般過濾膜（0.22-0.45 m ）；2. 支原體污染時(shí)，沒有明顯的肉眼或一般光學(xué)顯微鏡可觀察到的特征變化 ；3. 過去缺乏簡單、快速且可靠的檢測方式；4. 細(xì)胞流通間缺乏物品管理，造成實(shí)驗(yàn)室間的相互污染；5. 研究或操作人員忽略污染問題；6. 已受污染的細(xì)胞、培養(yǎng)基、血清 等。 相差顯微鏡觀察法 hayflick培養(yǎng)基直接培養(yǎng)法 dna熒光染色法 pcr方法 特異引物擴(kuò)增支原體 dna支原體的檢測支原體污染后的抗生素處理: 第一

26、種方法：使用泰樂菌素（tylosin，sigma)，泰樂菌素是一種獸用抗生素,常用在雞、豬的食料輔料，可以防止支原體感染引起的支氣管哮喘，至今尚未見有耐藥菌株，是治療支原體感染的特效藥。第二種方法：m-plasmocin, invivogen公司研究開發(fā)的新一代支原體抗生素m-plasmocin能有效地殺滅支原體，不影響細(xì)胞本身的代謝，并且用m-plasmocin處理過的培養(yǎng)細(xì)胞，不會(huì)重新感染支原體。第三種方法：用bm-cyclin-1/2，效果很好，方法如下：細(xì)胞傳代同時(shí)加bm-cyclin-1 10g/ml，37培養(yǎng)3天，加入bm-cyclin-2 5 g/ml，37培養(yǎng)3天；（不需傳代，

27、因?yàn)橹гw污染的細(xì)胞生長非常慢！）如果細(xì)胞生長恢復(fù)正常，即可結(jié)束。否則加bm-cyclin-1 20 g/ml，37培養(yǎng)3天，加入bm-cyclin-2 10 g/ml，37培養(yǎng)3天。懷疑是支原體污染的就可以試試，對細(xì)胞不會(huì)有太大影響。3. 病毒的污染和檢測 細(xì)胞的直接觀察 動(dòng)物接種檢查 電子顯微鏡觀察 免疫學(xué)檢查 pcr技術(shù)常用抗生素用量和效應(yīng)抗生素抗菌譜細(xì)菌 真菌 支原體 常用濃度青霉素g+100iu/ml鏈霉素g-100g/ml慶大霉素g+,g-200g/ml四環(huán)素g+,g-10g/ml卡那霉素g+,g-50g/ml兩性霉素2g/ml制霉菌素25g/ml四、培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特征（一）體外

28、培養(yǎng)細(xì)胞的分型（一）體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型 1. 貼附型：貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，判斷細(xì)胞形態(tài)時(shí)不能按照體內(nèi)組織學(xué)標(biāo)推判定，僅大致分成以下四型：成纖維細(xì)胞成纖維細(xì)胞上皮型細(xì)胞上皮型細(xì)胞游走細(xì)胞型游走細(xì)胞型多型細(xì)胞型多型細(xì)胞型2. 懸浮型：懸浮型：見于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細(xì)胞容易大量繁殖。 胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時(shí)呈放射狀。除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。另外，凡培養(yǎng)中細(xì)胞的形態(tài)與成纖維類似時(shí)皆可稱之為

29、成纖維細(xì)胞。 成纖維細(xì)胞型：1.貼附型名稱：名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的來源：來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細(xì)胞，心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，真正的成纖維細(xì)胞，心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，血管內(nèi)皮血管內(nèi)皮形態(tài)：形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)，胞體梭形或不規(guī)則似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)，胞體梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出三角形，胞質(zhì)向外伸出2 23 3個(gè)長短不等的突起，個(gè)長短不等的突起，中有卵圓形核中有卵圓形核生長特點(diǎn)：生長特點(diǎn)：排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片，排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片， 細(xì)胞細(xì)胞

30、細(xì)胞接觸易斷開而單獨(dú)行動(dòng)，游離的單獨(dú)細(xì)胞接觸易斷開而單獨(dú)行動(dòng)，游離的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞，常有幾個(gè)伸長的細(xì)胞突起的成纖維樣細(xì)胞，常有幾個(gè)伸長的細(xì)胞突起 細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜。生長時(shí)呈膜狀移動(dòng)，處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連，很少單獨(dú)行動(dòng)。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。 上皮型細(xì)胞：名稱：名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全相同僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全相同來源：來源：來源于外胚層、內(nèi)胚層細(xì)胞來源于外胚層、內(nèi)胚層細(xì)胞, , 如：如： 皮膚及其衍生物皮膚及其衍生物, ,消化道，乳腺，肺泡消化道，乳腺，肺泡

31、, , 上皮性腫瘤上皮性腫瘤形態(tài)：形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞扁平，不規(guī)則多角形，中有圓類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核形核 生長特點(diǎn)：生長特點(diǎn)：易相連成片，相靠易相連成片，相靠緊密相連緊密相連成薄層成薄層鋪石狀鋪石狀生長時(shí)呈膜狀移動(dòng)，很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng)生長時(shí)呈膜狀移動(dòng)，很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng)游走細(xì)胞型：呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。多型細(xì)胞型：有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。 見于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸

32、浮生長。這類細(xì)胞容易大量繁殖。 2. 懸浮型概念：概念：培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長 或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長來源：來源：自血，脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞癌腫細(xì)胞也可能自血，脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞癌腫細(xì)胞也可能特點(diǎn)：特點(diǎn)：在懸浮中生長良好細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)在懸浮中生長良好細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便( (不需消化不需消化) )， 易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：觀察不方便，很多細(xì)胞不能懸浮生長觀察不方便，很多細(xì)

33、胞不能懸浮生長( (尤以正常細(xì)胞尤以正常細(xì)胞) )hepatocytes（二）培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程（二）培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程 1. 1. 培養(yǎng)細(xì)胞生命期（培養(yǎng)細(xì)胞生命期（life span of culture cellslife span of culture cells）指細(xì)胞在整個(gè)離體培養(yǎng)過程中持續(xù)增殖和生長的時(shí)間，分為：原代培養(yǎng)期、傳代期和衰退期。2. 2. 組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期 所謂細(xì)胞“一代”一詞，僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法，它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代15

34、3次。它與細(xì)胞世代（generation）或倍增( doubling）不同；在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增36次。也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大。細(xì)胞群是異質(zhì)的（heterogeneous），也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)。如把這種細(xì)胞群稀釋分散成單細(xì)胞，在軟瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞克隆形成率（cloning efficiency）很低，即細(xì)胞獨(dú)立生存性差?？寺⌒纬陕始醇?xì)胞群被稀釋分散成單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，形成細(xì)胞小群（克?。┑陌俜?jǐn)?shù)。初

35、代培養(yǎng)細(xì)胞多呈二倍體核型；由于原代培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞性狀相似性大，是檢測藥物很好的實(shí)驗(yàn)對象。 原代培養(yǎng)（原代培養(yǎng)（primary cultureprimary culture）期期 初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱為細(xì)胞系（cell line）.在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系（diploid cell line）.為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。當(dāng)前世界上常用細(xì)胞均在不出十代內(nèi)凍存。如不凍存，則需反復(fù)傳代以維持細(xì)胞的適宜密度，以利于生存。但這樣就有可能導(dǎo)致細(xì)胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化

36、。一般情況下當(dāng)傳代1050次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。 傳代期傳代期此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡。在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點(diǎn)（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化（spontaneous transformation）。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性（immortality）或惡性性（malignancy）。細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無限細(xì)胞系（infinite cell line），也稱連續(xù)細(xì)胞系（continuous cell li

37、ne）。無限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（heteroploid）。細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì)。細(xì)胞永生性和惡性性非同一性狀。衰退期衰退期組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期細(xì)胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個(gè)階段： 潛伏期（latent phase）; 指數(shù)增生期（logarithmic growth phase）; 停滯期（stagnate phase）.細(xì)胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過一個(gè)在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時(shí)細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細(xì)胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結(jié)束。各種細(xì)

38、胞貼附速度不同，這與細(xì)胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。 1潛伏期（潛伏期（latent phase）初代培養(yǎng)細(xì)胞貼附慢，可長達(dá)1024小時(shí)或更多；連續(xù)細(xì)胞系和惡性細(xì)胞系快，1030分鐘即可貼附。 細(xì)胞貼附現(xiàn)象是一個(gè)非常復(fù)雜和與多種因素相關(guān)的過程。支持物能影響細(xì)胞的貼附；底物表面不潔不利貼附，底物表面帶有陽性電荷利于貼附。另外在貼附過程中，有一些特殊物質(zhì)如纖維連接素（fibronectin），又稱lets（larger external transformation substance），細(xì)胞表面蛋白（cell surface protein：csp）等也參與貼附過程。這些物質(zhì)都

39、是蛋白類成分，它們有的存在于細(xì)胞膜的表面（如 csp），有的則來自培養(yǎng)基中的血清（lets）。近年又從各種不同組織和生物成分中提取出了很多促貼附物質(zhì)。貼附是貼附類細(xì)胞生長增殖條件之一。 操作時(shí)，細(xì)胞表面上與其它細(xì)胞及支持物黏附與連接的分子被破壞，細(xì)胞受到損傷接種細(xì)胞: 適應(yīng)，恢復(fù)，積累(代謝中間產(chǎn)物)組織塊: 細(xì)胞遷移出一般經(jīng)數(shù)小時(shí)-幾天潛伏期存在的原因游離: 懸浮,胞質(zhì)回縮, 全部細(xì)胞變?yōu)閳A球形;吸附: 貼附底物,一般24小時(shí)內(nèi)貼壁;潛伏期:可有運(yùn)動(dòng)活動(dòng),基本無增殖,少見分裂相.細(xì)胞貼壁過程1.細(xì)胞密度：細(xì)胞密度：接種的細(xì)胞密度越大、數(shù)量越多，細(xì)胞群體越容易適應(yīng)體外環(huán)境，潛伏期就短。相反，即

40、便是在很小的培養(yǎng)空間內(nèi)，如接種的細(xì)胞數(shù)量不夠大，潛伏期仍會(huì)較長。2.細(xì)胞類型：細(xì)胞類型：傳代培養(yǎng)的細(xì)胞潛伏期比原代培養(yǎng)的細(xì)胞短。傳代培養(yǎng)期的細(xì)胞,一般為624h;原代2496h或更長。單個(gè)細(xì)胞快,細(xì)胞大團(tuán)慢,組織塊慢。連續(xù)細(xì)胞系與發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(6-24h)比有限細(xì)胞系與正常二倍體細(xì)胞的短。來源：胚胎組織:短,2天可見細(xì)胞生長；成體組織:長。 3.細(xì)胞機(jī)能狀態(tài)：細(xì)胞機(jī)能狀態(tài)：不良者慢。4.培養(yǎng)條件：培養(yǎng)條件：培養(yǎng)液, ph, 底物等，不利：污染,有毒； 慢。滯留時(shí)間的長短與：細(xì)胞種類、接種的細(xì)胞密度、培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。初代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長，約2496小時(shí)或更長，連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期

41、短，僅624小時(shí)；細(xì)胞接種密度大時(shí)潛伏期短。當(dāng)細(xì)胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時(shí)，標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入指數(shù)增生期。這是細(xì)胞增殖最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長旺盛與否的一個(gè)重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂指數(shù)（細(xì)胞分裂指數(shù)（mitotic indexmitotic index，mimi）表示，即細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%0.5%，初代細(xì)胞分裂指數(shù)低，連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)3%5%。特點(diǎn)：特點(diǎn)：細(xì)胞增生最活躍、活力最旺盛的階段；培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)增長，細(xì)胞群體均一，是理想的實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。 2指數(shù)增生期（指數(shù)增生期（log

42、arithmic growth phase）在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)35天后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長空間漸趨減少、最后細(xì)胞相互接觸匯合成片。細(xì)胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細(xì)胞，由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，這種現(xiàn)象稱接觸抑制接觸抑制（contact inhibition）。細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制密度抑制（density inhibition），導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。有絲分裂指數(shù)有絲分裂指數(shù)(m

43、i) : 指培養(yǎng)物中分裂相數(shù)量占全部細(xì)胞數(shù)量的百分比，統(tǒng)計(jì)時(shí)，每瓶至少需計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞。一般細(xì)胞的mi約為0.1 0.5%；原代培養(yǎng)物的mi比繼代培養(yǎng)物低。連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞高，可達(dá)3% 5%。細(xì)胞群體倍增時(shí)間細(xì)胞群體倍增時(shí)間: 培養(yǎng)物種中細(xì)胞數(shù)量翻倍的平均時(shí)間mtt法法: 反映細(xì)胞內(nèi)線粒體中一種酶活性程度標(biāo)記核苷酸標(biāo)記核苷酸(3h-tdr)摻入量摻入量：反映dna合成判斷細(xì)胞生長的指標(biāo)：指數(shù)生長期內(nèi)細(xì)胞分裂活動(dòng)的程度(增殖活性)可作為判斷細(xì)胞生長是否旺盛的重要指標(biāo)。細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱平臺(tái)期（plateau）。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動(dòng)，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、ph降低。此時(shí)需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會(huì)中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細(xì)胞的機(jī)能狀態(tài)。在這種情況下，雖進(jìn)行了傳代，因細(xì)胞已受損，需要恢復(fù)，至少還要再傳12兩代，通過換液淘汰死細(xì)胞和使受損