常用的單克隆抗體檢測(cè)方法

1、常用的單克隆抗體檢測(cè)方法通過雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體，在雜交瘤制備完成后， 需要對(duì)抗體進(jìn)行一個(gè)檢測(cè)，本文介紹了幾種常用的抗體檢測(cè) 的方法（1）免疫酶技術(shù)免疫酶技術(shù)就是將抗原抗體反應(yīng)的特 異性與酶對(duì)底物顯色反應(yīng)的高效催化作用有機(jī)結(jié)合而成的 免疫學(xué)技術(shù)。由于它特異性強(qiáng)，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛用于篩選 與鑒定單抗。器材與試劑a、包被緩沖液：碳酸鹽緩沖液：取 0、2mol/L Na2CO3 8ml,0、2mol/L NaHCO3 17ml 混合，再 加 75ml 蒸播水，調(diào) PH 至 9、6。Tris-HCl 緩沖液（PH8、0,0、 02mol/L）:取 0、1mol/L Tris 100ml,0、1m

2、ol/L HCl 58、4ml 混 合，加蒸儲(chǔ)水至1000ml o b、洗滌緩沖液（PH7、2的 PBS）:KH2PO4 0、2g,KCl 0、2g,Na2HPO4 12H2O 2、9g,NaCl 8、0g,Tween-20 0、5ml,加蒸儲(chǔ)水至1000ml。c、稀釋液與封 閉液:牛血清白蛋白（BSA）0、1g,加洗滌液至100ml;或用洗滌 液將小牛血清配成 5-10%使用。d、酶反應(yīng)終止液（2mol/L H2SO4）:取蒸儲(chǔ)水 178、3ml,滴加濃硫酸（98%）21、7ml。e 底物緩沖液（PH5、0,磷酸鹽-檸檬酸緩沖液）:取0、2mol/L Na2HPO4 25、7ml,0、1ml

3、/L 檸檬酸 24、3ml,再加 50ml 蒸播 水。檸檬酸溶液及配成的底物緩沖液不穩(wěn)定，易形成沉淀，因此一次不宜配制過多。f、底物使用液:OPD底物使用液（測(cè) 490nm 的 OD 值）:OPD 5mg,底物緩沖液 10ml,3% H2O2 0、 15mLTMBS或TMB底物使用液（測(cè)450nm的OD值）:TMBS或 TMB(1mg/ml)1、0ml,底物緩沖液 10ml,1% H2O2 25ul。 ABTS底物使用液(測(cè)410nm的OD值):ABTS 0、5mg,底物緩 沖液1ml,3% H2O2 2ul。g、抗體對(duì)照：以骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清 作為陰性對(duì)照，以免疫鼠血清作為陽(yáng)性血清。h、抗原

4、：可溶性抗原：盡量純化，以獲得高特異性。病毒感染的傳代細(xì)胞或 全菌抗原。淋巴細(xì)胞等懸液。i、酶標(biāo)抗鼠抗體或酶標(biāo) SPA 或其她類似試劑。j、細(xì)胞固定液：-20C丙酮；或丙酮-甲醛固 定液:Na2HPO4 100mg,KH2PO4 500mg,蒸儲(chǔ)水 150ml,丙酮 225ml,甲醛125ml;或丙酮-甲醛溶液(1;1);或-20C甲醇。k、聚 苯乙烯微孔板：40孔、96孔、或條孔；硬板或軟板均可使用。 l、酶聯(lián)免疫閱讀儀；或光鏡。m、吸管、加樣器及水溶箱、離 心機(jī)等?？扇苄钥乖拿嘎?lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)a、純化抗原用包被液稀釋至 1-20ug/ml。b、以50-100ul/孔量加入酶

5、標(biāo)板孔中，置4c過夜或37c吸附2小時(shí)。c、棄去孔內(nèi)的液 體，同時(shí)用洗滌液洗 3次，每次3-5分鐘，拍干。d、每孔加200ul 封閉液4c過夜或37c封閉2小時(shí);該步驟對(duì)于一些抗原，可 省略。e、洗滌液洗3次;此時(shí)包被板可-20C或4c保存?zhèn)溆谩?f、每孔加50-100ul待檢雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性、 陰性對(duì)照與空白對(duì)照；37c孵育1-2小時(shí);洗滌,拍干。g、加酶 標(biāo)第二抗體，每孔50-100ul,37 c孵育1-2小時(shí),洗滌,拍干。h、 加底物液，每孔加新鮮配制的底物使用液50-100ul,37 c 10-30分鐘。i、以2mol/L H2SO4終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫閱讀儀上讀取OD

6、值。j、結(jié)果判定：以P/N2、1,或PN+3D為陽(yáng)性。若陰 性對(duì)照孔無色或接近無色，陽(yáng)性對(duì)照孔明確顯色，則可直接用 肉眼觀察結(jié)果。全菌抗原的ELISASa、新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌用蒸播水或PBS懸浮，并調(diào)整細(xì)菌濃度至 1 X 108個(gè)/ml o必須指 由，對(duì)于人畜共患病病原體需注意安全操作，最好就是滅活處 理。b、每孔中加100ul 5%戊二醛溶液（0、1mol/L NaHCO3 95ml+25%戊二醛溶液5ml）,37 c作用2小時(shí)，蒸儲(chǔ)水洗滌3次; 加上述細(xì)菌懸液 50ul/孔;37-56C烘干；每孔加200ul封閉液 4c過夜或37C 2小時(shí)封閉。c、步驟b也可采用先每孔加 50ul細(xì)菌懸液，3

7、7C-56c烘干，然后用-20C預(yù)冷的無水甲醇 室溫作用15分鐘，蒸儲(chǔ)水洗滌3次;每孔加200ul封閉液4 C 過夜或37 C 2小時(shí)封閉。d、洗滌液洗3次;此時(shí)包被板可在-20C或4c保存?zhèn)溆?。e、以下步驟同上法。用全細(xì)胞抗 原的ELISAa、按常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞，接種病毒，收獲感染細(xì)胞 與未感染細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用PBS制成適當(dāng)濃度懸液。b、 淋巴細(xì)胞懸液的制備采用新鮮外周血加肝素抗凝后，滴加于淋巴細(xì)胞分離液之上，1500rpm離心30分鐘，吸取界面細(xì)胞洗 滌二次，即為新鮮淋巴細(xì)胞懸液。 該細(xì)胞懸液中若仍混有紅細(xì) 胞，離心后加0、83%的氯化鏤溶液，室溫10分鐘，洗滌一次即 可。將該細(xì)胞懸

8、液稀釋至適當(dāng)濃度。c、每孔加100ul上述a或b的細(xì)胞懸液，使每孔含細(xì)胞5X 104個(gè);1500r/min 15分鐘, 甩去上清；室溫干燥或吹干后用丙酮-甲醇（1:1）4C固定10分鐘;可4c或-20C保存?zhèn)溆?。d、以下步驟同上法?？贵w捕 捉ELISA試驗(yàn)本法用抗BALB/c小鼠Ig的多克隆抗體捕捉 待檢樣品中的McAb,再依次加抗原、酶標(biāo)多克隆抗體及底物 顯色。該法就是常用的 ELISA中較理想的一種；具操作步驟 如下:a、以適當(dāng)濃度的純化抗鼠Ig抗體包被酶標(biāo)板，每孔加 100ul,37c 2小時(shí)或4c過夜。b、洗滌、拍干后加待測(cè)的 McAb樣品,37C 1-2小時(shí)。c、洗滌后加適量的抗原，

9、37C 1-2 小時(shí)。d、洗滌后加入酶標(biāo)多克隆抗體 ,37 C 1-2小時(shí)。洗滌 后加底物顯色，判定結(jié)果。ABC-ELISA 試驗(yàn)ABC-ELISA 就是在常規(guī)ELISA原理的基礎(chǔ)上，增加了生物素（Biotin）與親 與素（Avidin）間的放大作用。親與素有4個(gè)亞單位組成，對(duì)生物素有高度的親合力。生物素很易與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合。因此,結(jié)合了酶的親與素與結(jié)合有抗體的生物素發(fā)生反應(yīng)即起到 了多極放大作用。具操作步驟如下：a、已知抗原的包被及加待檢McAb樣品，同間接ELISA試驗(yàn)。b、加生物素化抗鼠Ig 抗體，每孔100ul,37 c 1小時(shí);洗滌。c、加酶標(biāo)親與素，每孔 100ul,37c 30分

10、鐘洗滌；加底物顯色，判定結(jié)果。Dot-ELISA 試驗(yàn)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（Dot-ELISA）就是以硝酸纖維素膜或醋酸 纖維素膜為固相載體，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的免疫檢測(cè)手段。該法采用不溶性底物（如DAB,或4-氯蔡酚或AgNO3等）淇與相 應(yīng)標(biāo)記物（HRP、AP、膠體金）作用形成不溶性產(chǎn)物，呈現(xiàn)斑點(diǎn) 狀著色，從而易于判定結(jié)果。根據(jù)所用的標(biāo)記物不同，可分為HRP免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)、AP免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)與免疫金銀斑點(diǎn)法等。 其操作步驟大致如下：a、將抗原液2-5ul點(diǎn)加于纖維素膜上， 室溫37c干燥。b、將纖維膜浸入封閉液中,37 C 30分鐘。c、 用洗滌液洗2次,吸干后加待檢 McAb樣品,37C 1小時(shí);用洗

11、 滌液振蕩洗滌三次，每次5分鐘，力口 HRP或AP或膠體金標(biāo)記 的抗鼠Ig抗體,37C作用30分鐘。d、同法洗滌，吸干，用新配 的相應(yīng)底物溶液顯色，然后水洗終止反應(yīng)，觀察結(jié)果。免疫 組化染色法該法主要用于檢測(cè)針對(duì)細(xì)胞抗原成分的McAb,常用的方法就是間接免疫過氧化物酶試驗(yàn)（IIP,indirectimmunoperoxidase）及APAAP技術(shù)。其結(jié)果用光鏡或倒置顯 微鏡檢查。（2）免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)可用于多種抗原的 雜交瘤抗體檢測(cè)，如細(xì)胞性抗原（包括細(xì)菌與動(dòng)物細(xì)胞）、感染 細(xì)胞中的病毒抗原與膜抗原等。具操作簡(jiǎn)單、敏感性高，可直 接觀察抗原定位等優(yōu)點(diǎn)，在McAb的篩選與鑒定上具有重要

12、的應(yīng)用價(jià)值。器材與試劑a、供檢測(cè)抗體用的抗原制備固定細(xì)胞片或板，活細(xì)胞懸液。b、PBS（PH7、2,0、01mol/L）c、 待檢的McAb樣品。d、冷丙酮e、FITC（異硫匐酸熒光素）或 TRITC（四甲基異硫匐酸羅丹明熒光素）標(biāo)記的抗鼠Ig抗體等f、熒光顯微鏡，磁力攪拌器，離心機(jī)，水浴箱等。間接免疫熒 光法a、固定細(xì)胞片的制備：生長(zhǎng)在蓋片上的細(xì)胞（接種或未接 種病毒），可直接收獲蓋片，在PBS中洗滌，用4c丙酮固定10 分鐘，空氣干燥，置密封容器于-20C保存?zhèn)溆茫粏渭?xì)胞懸液可在蓋片上制成涂片，固定方法同上。細(xì)胞涂片的制備：將10ul細(xì)菌懸液（1 X108個(gè)/ml）涂抹7 x 21mm蓋片

13、上，自然干燥后， 用-20C丙酮固定10-15分鐘，于-20C保存?zhèn)溆?。b、蓋片在去 離子水中濕潤(rùn)后置架上滴加10-20U1雜交瘤上清或其她待檢樣品;設(shè)立陽(yáng)性、陰性對(duì)照；置37c水浴孵育0、5-1小時(shí)。c、 取由蓋片置PBS中用磁力攪拌器洗滌 15分鐘。d、蓋片置架 上,滴加工作濃度的抗鼠Ig的熒光抗體10-20U1,37c孵育0、 5-1小時(shí)。e、同法洗滌15分鐘;取由蓋片，用延緩熒光碎滅的 封載劑（如緩沖甘油，9份甘油加1份PBS）封于干凈載玻片上。f、光顯微鏡上觀察，陽(yáng)性結(jié)果可見特異性熒光（FITC為黃綠色 熒光,TRITC為桔紅色熒光）。g、細(xì)胞固定片的制備，也可改 在培養(yǎng)板孔中進(jìn)行，

14、其余步驟同上，在觀察結(jié)果時(shí)，將培養(yǎng)板翻 轉(zhuǎn)置于熒光顯微鏡下，判斷標(biāo)準(zhǔn)不變。細(xì)胞的膜熒光染色完 整的活細(xì)胞的細(xì)胞膜，抗體不能透過。如果細(xì)胞在4c操作，則熒光染色僅限于細(xì)胞膜。必須注意死細(xì)胞常以非特異性方 式吸附大量熒光抗體，因此試驗(yàn)過程中要保證細(xì)胞的高活力。活細(xì)胞的膜熒光染色大致步驟如下：a、制備活性較好的細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)濃度至107個(gè)/ml。b、在小試管（5x 50mm）中加入 100ul細(xì)胞懸液，再加入100ul待檢McAb的樣品，混勻,4C作 用30-90分鐘。c、用洗滌液（PBS 900ml,小牛血清50ml,4%NaN3 50ml）洗二次，每次加洗滌液 1-5ml,1000r/min 離

15、心5分鐘，棄上清。加入100ul熒光抗體，4C作用30-90分鐘。d、同法洗滌，將細(xì)胞重新懸于20-30U1含10%甘油與 10-100ug苯二胺/ml的溶液中；滴加于載玻片上，加蓋片封載。 e、立即在熒光顯微鏡上檢查。f、細(xì)胞也可在染色后用 1%多 聚甲醛生理鹽水固定，立即檢查，或至少在4c可保存一周。（3） 間接血凝試驗(yàn)間接血凝試驗(yàn)又稱被動(dòng)血凝試驗(yàn)（PHA）,就是目前應(yīng)用較廣的檢測(cè)方法之一。本試驗(yàn)就是以包被可溶性抗原 的紅細(xì)胞作為指示系統(tǒng)，當(dāng)被檢抗體與包被在紅細(xì)胞上的抗 原產(chǎn)生特異性反應(yīng)時(shí)，導(dǎo)致紅細(xì)胞呈凝集現(xiàn)象。可見，該法具 有靈敏、快速、容易操作與無需昂貴儀器等優(yōu)點(diǎn)，而且經(jīng)改用 醛化紅細(xì)

16、胞以后，克服原來重復(fù)性差的缺點(diǎn)。 器材與試劑a、 綿羊抗凝血，或人“ O”型抗凝血。b、緩沖液：PBS（PH7、2）; 醋酸緩沖液。c、甲醛，丙酮醛，NaN3,抗凝劑等。d、血凝板， 振蕩器等。多糖抗原的間接血凝試驗(yàn)a、甲醛化綿羊紅細(xì)胞的制備：無菌采集綿羊頸靜脈血50ml,用枸檬酸鈉作抗凝劑用5倍于紅細(xì)胞壓積的 PH7、2 PBS（Na2HPO4 - 12H2O 3、 58g,KH2PO4 0、41g,NaCl 8、01g,蒸播水 1000ml）充分洗滌 5 次，每次1500r/min 5-10分鐘,直至上清測(cè)定無蛋白質(zhì)（用飽與 硫酸鏤滴定上清，觀察有無白色沉淀，再以相同緩沖液配成 25%紅細(xì)

17、胞懸液；將25%紅細(xì)胞懸液與20%甲醛以2、5:1的 比例混勻，37 C水浴作用2小時(shí)，每15分鐘振蕩一次，紅細(xì)胞顏 色逐漸由鮮紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣?；以PH7、2 PBS洗滌4次，每次 2000r/min 10分鐘，再以同樣的PBS制成25%紅細(xì)胞懸液；其 后,重復(fù)醛化一次，方法同前；最后配成20%醛化綿羊紅細(xì)胞懸 液，加甲醛至0、3%防腐,4 C保存?zhèn)溆?。b、脂多糖抗原致敏 甲醛化綿羊紅細(xì)胞的制備：取脂多糖（LPS）,以0、2mol/L PH8、 0 PB液，調(diào)整多糖濃度至120ug/ml,然后100 c水浴處理1小 時(shí);將冷卻至37c的熱處理LPS與6%醛化紅細(xì)胞等量混合,37 C攪拌作用45分

18、鐘;取由離心2000r/min 10分鐘，以0、 01mol/L PH7、2 PBS洗滌4次;配制成4%致敏血球，分裝，保 存于4c備用，或凍干保存。c、McAb的篩選：取待測(cè)McAb 樣品25ul,加入V型微量血凝板孔中，同時(shí)設(shè)立陰性、陽(yáng)性對(duì) 照;再加入0、5-4%致敏紅血球懸液25ul,在振蕩器上混勻 30 秒;置室溫或37 C 30-60分鐘觀察結(jié)果。陰性對(duì)照孔應(yīng)呈緊 縮的圓點(diǎn)。可溶性蛋白抗原的間接血凝試驗(yàn)a、紅細(xì)胞醛化:采用雙醛法。采綿羊或人“ O”型抗凝血，每次加10倍于 紅細(xì)胞壓積的PBS洗滌4-6次，然后配成8%紅細(xì)胞懸液；向此 8%紅細(xì)胞懸液緩慢加入等量含有3%丙酮醛與3%甲醛的PBS,于室溫緩慢攪拌17小時(shí);其后洗滌3次，配成20%雙醛化 紅細(xì)胞懸液，力口 0、1% NaN3防腐,4C保存?zhèn)溆?。b、致敏紅 細(xì)胞:取20%雙醛化紅細(xì)胞 0