工具酶與基因工程-PowerPoint演示文稿

1、 第一部分第一部分 工具酶與基因工程工具酶與基因工程 一限制性核酸內(nèi)切酶一限制性核酸內(nèi)切酶 1限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) 2I類和類和III類限制和修飾酶的基本特征類限制和修飾酶的基本特征 3II類限制和修飾酶的基本特征類限制和修飾酶的基本特征 4甲基化酶的基本特征甲基化酶的基本特征 二其它工具酶其它工具酶 1 DNA連接酶連接酶 2聚合酶聚合酶 3末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(TdT) 4. SI核酸酶核酸酶 5Bal31核酸酶核酸酶 6堿性磷酸單脂酶堿性磷酸單脂酶 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 (Restriction Endonuclease)* 存在于任何一種

2、原核細(xì)菌中存在于任何一種原核細(xì)菌中.* 在特異位點(diǎn)上催化雙鏈在特異位點(diǎn)上催化雙鏈DNA分子的斷裂分子的斷裂,產(chǎn)生相應(yīng)的限制性產(chǎn)生相應(yīng)的限制性片段片段.* 各種生物呈現(xiàn)特征性的限制性內(nèi)切酶切圖譜各種生物呈現(xiàn)特征性的限制性內(nèi)切酶切圖譜.* 在生物分類在生物分類,基因定位基因定位,基因重組基因重組,疾病診斷疾病診斷,刑事偵察領(lǐng)域極為刑事偵察領(lǐng)域極為重要重要. 一限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)：一限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)：(宿主細(xì)胞的限制和修飾作用宿主細(xì)胞的限制和修飾作用)宿主細(xì)胞的限制和修飾作用：宿主細(xì)胞的限制和修飾作用：兩種不同來源的入兩種不同來源的入-噬菌體噬菌體 入入K；入入B，能高頻感染各自大腸桿能高頻感染各

3、自大腸桿菌宿主細(xì)胞（菌宿主細(xì)胞（ K株株 ，B 株株 ）。）。當(dāng)它們分別與其它宿主菌交叉混合培養(yǎng)時(shí)，感染下降數(shù)千倍。當(dāng)它們分別與其它宿主菌交叉混合培養(yǎng)時(shí)，感染下降數(shù)千倍。一但一但 入入K 噬菌體在噬菌體在 B 株成功，由株成功，由 B 株繁殖出株繁殖出 入入K 后代，能感后代，能感染染 B 株株, 不能感染原來不能感染原來 K株株.1 宿主細(xì)胞的限制和修飾作用；宿主細(xì)胞的限制和修飾作用；1兩種不同來源的入兩種不同來源的入-噬菌體噬菌體 （ 入入- K ，入入-B ）。）。2能高頻感染各自大腸桿菌宿主細(xì)胞（能高頻感染各自大腸桿菌宿主細(xì)胞（ K株株 ，B 株株 ）。）。3當(dāng)它們分別與其它宿主菌交叉

4、混合培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)它們分別與其它宿主菌交叉混合培養(yǎng)時(shí)， （ 入入K-B ，入入B-K ）感染下降數(shù)千倍。感染下降數(shù)千倍。4一但一但 入入K 噬菌體在噬菌體在 B 株成功，由株成功，由 B 株繁殖出株繁殖出 入入-K 后代，能感染后代，能感染 B 株株, 不能再感染原來不能再感染原來 K株株. 稱為：宿主細(xì)胞的限制和修飾作用稱為：宿主細(xì)胞的限制和修飾作用二限制和修飾作用的分子機(jī)制二限制和修飾作用的分子機(jī)制1大腸桿菌宿主細(xì)胞大腸桿菌宿主細(xì)胞 K株，株，B 株株 ，有各自的限制和修飾系統(tǒng)。，有各自的限制和修飾系統(tǒng)。1） 它們均有三個(gè)連續(xù)的基因位點(diǎn)控制，它們均有三個(gè)連續(xù)的基因位點(diǎn)控制，hsdR; hsdM

5、; hsdS.2） hsdR編碼限制性核酸內(nèi)切酶編碼限制性核酸內(nèi)切酶-識(shí)別識(shí)別DNA分子特定位點(diǎn)，分子特定位點(diǎn)，將雙鏈將雙鏈DNA切斷。（切斷。（DNA分子轉(zhuǎn)化細(xì)胞：受體細(xì)胞去掉分子轉(zhuǎn)化細(xì)胞：受體細(xì)胞去掉hsdR基因位點(diǎn)）基因位點(diǎn)）3） hsdM編碼產(chǎn)物是編碼產(chǎn)物是DNA甲基化酶甲基化酶-催化催化DNA分子特定位點(diǎn)分子特定位點(diǎn)的堿基甲基化反應(yīng)。的堿基甲基化反應(yīng)。4） hsdS表達(dá)產(chǎn)物的功能是表達(dá)產(chǎn)物的功能是-協(xié)助限制性核酸內(nèi)切酶和甲基協(xié)助限制性核酸內(nèi)切酶和甲基化酶，識(shí)別特殊的作用位點(diǎn)?；?，識(shí)別特殊的作用位點(diǎn)。 2.入噬菌體長(zhǎng)期生長(zhǎng)在大腸桿菌宿主細(xì)胞入噬菌體長(zhǎng)期生長(zhǎng)在大腸桿菌宿主細(xì)胞 K株，株

6、，B株株 中，中， 1）宿主細(xì)胞甲基化酶，將染色體）宿主細(xì)胞甲基化酶，將染色體DNA和噬菌體和噬菌體DNA 特異性保護(hù)特異性保護(hù). 2）封閉自身所產(chǎn)生的核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。）封閉自身所產(chǎn)生的核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。-（修飾）（修飾） 3當(dāng)外來當(dāng)外來DNA入侵時(shí)，遭到宿主限制性內(nèi)切酶的特異降解入侵時(shí)，遭到宿主限制性內(nèi)切酶的特異降解 -（限制）（限制） 4. 由于降解不完全，外來少數(shù)由于降解不完全，外來少數(shù)DNA分子在宿主細(xì)胞中繁殖過程分子在宿主細(xì)胞中繁殖過程 中被宿主細(xì)胞的甲基化酶修飾，雖然是外來卻不被降解。中被宿主細(xì)胞的甲基化酶修飾，雖然是外來卻不被降解。 5但喪失在原宿主細(xì)胞中的存活能力，因

7、為接受了新宿主菌甲但喪失在原宿主細(xì)胞中的存活能力，因?yàn)榻邮芰诵滤拗骶谆揎椀耐瑫r(shí)喪失了原宿主菌修飾的標(biāo)記基化修飾的同時(shí)喪失了原宿主菌修飾的標(biāo)記(一但一但 入入-K 噬菌噬菌體在體在 B 株成功，由株成功，由 B 株繁殖出株繁殖出 入入-K 后代，能感染后代，能感染 B 株株, 不不能感染原來能感染原來 K株株.) 6細(xì)菌利用限制和修飾系統(tǒng)來區(qū)分自身細(xì)菌利用限制和修飾系統(tǒng)來區(qū)分自身DNA與外來與外來DNA。C株不能產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶，其它來源入株不能產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶，其它來源入- 噬菌噬菌體可以感染體可以感染C株，而在株，而在 C株繁殖入株繁殖入- 噬菌體則在噬菌體則在 K株和株和 B 株株

8、受到嚴(yán)格的限制作用受到嚴(yán)格的限制作用三三 限制性內(nèi)切酶的分類：（三大類）限制性內(nèi)切酶的分類：（三大類）I I類，類， II類類, III類類.2 I類，類，III類為限制類為限制-修飾酶。修飾酶。 限制性內(nèi)切活性和甲基化活性，都作為亞基的功能限制性內(nèi)切活性和甲基化活性，都作為亞基的功能 單位包含在單位包含在 同一酶分子中。同一酶分子中。3 II類限制性內(nèi)切酶與甲基化酶是分離的，切割位點(diǎn)類限制性內(nèi)切酶與甲基化酶是分離的，切割位點(diǎn) 專專 一，適合于一，適合于DNA重組。重組。四原核細(xì)胞中限制和修飾系統(tǒng)四原核細(xì)胞中限制和修飾系統(tǒng)四原核細(xì)胞中限制和修飾系統(tǒng)四原核細(xì)胞中限制和修飾系統(tǒng) I類酶類酶 II類

9、酶類酶 III類酶類酶 酶分子酶分子 三亞基雙功能三亞基雙功能 內(nèi)切酶與甲基化酶分離內(nèi)切酶與甲基化酶分離 二亞基雙二亞基雙 能能 識(shí)別位點(diǎn)識(shí)別位點(diǎn) 二分非對(duì)稱序列二分非對(duì)稱序列 4-6bp序列，回文結(jié)構(gòu)序列，回文結(jié)構(gòu) 5-7bp非對(duì)稱序列非對(duì)稱序列 切割位點(diǎn)切割位點(diǎn) 距識(shí)別位點(diǎn)距識(shí)別位點(diǎn)1000bp 在識(shí)別位點(diǎn)中或靠識(shí)別位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)中或靠識(shí)別位點(diǎn) 在識(shí)別位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn) 下游下游24-26bp限制性反應(yīng)限制性反應(yīng) 互斥互斥 分開反應(yīng)分開反應(yīng) 同時(shí)竟?fàn)幫瑫r(shí)竟?fàn)幣c甲基化反應(yīng)與甲基化反應(yīng)限制作用限制作用 需要需要ATP 需要需要 需要需要 不需要不需要 五五I類酶，類酶，III類酶限制類酶限制-修飾

10、酶基本特怔修飾酶基本特怔 1）I類酶，類酶，EcoK，EcoB。（1）異源多聚體，亞基異源多聚體，亞基R.M.S分別具有限制分別具有限制,修飾酶的作用，特修飾酶的作用，特 異性位點(diǎn)識(shí)別活性。異性位點(diǎn)識(shí)別活性。（2）I類酶與類酶與 DNA識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合依賴亞基識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合依賴亞基 M與輔助因子與輔助因子S腺苷腺苷甲硫氨酸甲硫氨酸(SAM)相互作用。相互作用。（3）S腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸(SAM)通過變構(gòu)作用使酶處于活性狀態(tài)，通過變構(gòu)作用使酶處于活性狀態(tài)，酶與酶與 DNA識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合后，根據(jù)甲基化狀態(tài)發(fā)揮相應(yīng)酶的活識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合后，根據(jù)甲基化狀態(tài)發(fā)揮相應(yīng)酶的活性，或限制性，或限制, 或限修飾，或不

11、限制不限修飾或限修飾，或不限制不限修飾 2）III類限制修飾酶基本特怔類限制修飾酶基本特怔（1）亞基）亞基R，MS亞基組成。亞基組成。MS亞基具有識(shí)別和甲基化修飾亞基具有識(shí)別和甲基化修飾雙重作用雙重作用.（2）修飾與限制取決于兩亞基之間的竟?fàn)?。）修飾與限制取決于兩亞基之間的竟?fàn)?。?）切割位點(diǎn)無特異性，只與識(shí)別位點(diǎn)的距離有關(guān)）切割位點(diǎn)無特異性，只與識(shí)別位點(diǎn)的距離有關(guān) MboII 識(shí)別識(shí)別 5-AAGA- 3 切割位點(diǎn)切割位點(diǎn) 5-GAAGANNNNNNNN/N-3 3-CTTCTNNNNNNN/NN-53）II類限制修飾酶基本特怔類限制修飾酶基本特怔（1） 命名規(guī)則：命名規(guī)則： 生物體屬名的第

12、一大寫字母和種名前兩個(gè)小寫構(gòu)成基本名稱生物體屬名的第一大寫字母和種名前兩個(gè)小寫構(gòu)成基本名稱 基本名稱基本名稱 + 菌株名的字母菌株名的字母 + 羅馬字母（發(fā)現(xiàn)順序）羅馬字母（發(fā)現(xiàn)順序） Hid III Haemophilus infuenzae d株中的第三個(gè)酶株中的第三個(gè)酶 EcoR I 基因位于基因位于Escherichia coli 抗藥性抗藥性R質(zhì)粒上質(zhì)粒上 E co R I 細(xì)菌屬名細(xì)菌屬名 細(xì)菌種名種細(xì)菌種名種 菌株類型菌株類型 有幾種限制酶有幾種限制酶（2）特點(diǎn)）特點(diǎn) A識(shí)別序列識(shí)別序列 4，5 或或 6個(gè)堿基對(duì)，個(gè)堿基對(duì)， EcoR I 識(shí)別識(shí)別 5-G/AATTC- 3 序列

13、序列 3-CTTAA/G- 5 B180度旋轉(zhuǎn)對(duì)稱回文結(jié)構(gòu)，對(duì)稱軸在第三，四堿基之間。度旋轉(zhuǎn)對(duì)稱回文結(jié)構(gòu)，對(duì)稱軸在第三，四堿基之間。 C任何一個(gè)任何一個(gè)DNA分子，每分子，每9對(duì)堿基出現(xiàn)一個(gè)對(duì)堿基出現(xiàn)一個(gè)II類酶切口。類酶切口。 （3） 切割方式切割方式 A以酶切特點(diǎn)來分以酶切特點(diǎn)來分 同位酶：識(shí)別相同序列切點(diǎn)不同。同位酶：識(shí)別相同序列切點(diǎn)不同。 同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)相同，酶的來源不同。同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)相同，酶的來源不同。 同尾酶：識(shí)別位點(diǎn)不同，切出片段有相同末端序列。同尾酶：識(shí)別位點(diǎn)不同，切出片段有相同末端序列。 B以切出片段末端性質(zhì)不同可分，粘性末端和平末端。以切出片段末端性質(zhì)不同可分，粘性末

14、端和平末端。 粘性末端：（粘性末端：（Cohesive Ends）兩個(gè)突出末端可退火互補(bǔ)兩個(gè)突出末端可退火互補(bǔ) DNA是分子重組的基礎(chǔ)是分子重組的基礎(chǔ)限制內(nèi)切酶切出的三種斷口限制內(nèi)切酶切出的三種斷口 六六甲基化酶的基本特征：甲基化酶的基本特征：1)類限制性內(nèi)切酶有相應(yīng)甲基化酶伙伴，類限制性內(nèi)切酶有相應(yīng)甲基化酶伙伴，a)限制性內(nèi)切酶，甲基化酶的識(shí)別位點(diǎn)相同，序列內(nèi)使堿限制性內(nèi)切酶，甲基化酶的識(shí)別位點(diǎn)相同，序列內(nèi)使堿基甲基化，封閉酶切口?；谆?，封閉酶切口。b)甲基化酶封閉一個(gè)限制性內(nèi)切酶切口同時(shí)產(chǎn)生另一種酶甲基化酶封閉一個(gè)限制性內(nèi)切酶切口同時(shí)產(chǎn)生另一種酶切口。切口。 c) DNA腺嘌呤甲基化酶

15、腺嘌呤甲基化酶 Darn DNA胞嘧啶甲基化酶胞嘧啶甲基化酶 Dcm七酶切圖譜示意圖七酶切圖譜示意圖1。 一圈表示一種酶。一圈表示一種酶。2 單切口酶在里圈，越多切口酶越在外面。單切口酶在里圈，越多切口酶越在外面。3 大寫英文字母表示片段（大寫英文字母表示片段（ A，B，C AB ）。）。4 兩種片段同樣大小兩種片段同樣大小 （ A1 A2 A3 E1 E2 E3）。）。幾次實(shí)驗(yàn)后，大小不一幾次實(shí)驗(yàn)后，大小不一 致以致以 虛線表示不肯定。虛線表示不肯定。 八八DNA切接反應(yīng)的影響因素切接反應(yīng)的影響因素1 限制性內(nèi)切酶的切割反應(yīng)限制性內(nèi)切酶的切割反應(yīng) 10-50mmol/L Tris-HCl (

16、PH7.5), 10mmol/L MgCl2, 1mmol/L DTT (二硫蘇糖醇二硫蘇糖醇) 只是鹽濃度不同，分低鹽，中鹽，高鹽組只是鹽濃度不同，分低鹽，中鹽，高鹽組,1）需兩種酶切同一分子，酶對(duì)鹽濃度相同，可同時(shí)反應(yīng)。）需兩種酶切同一分子，酶對(duì)鹽濃度相同，可同時(shí)反應(yīng)。 2）需兩種酶切同一分子，酶對(duì)鹽濃度要求差別不大，中，高）需兩種酶切同一分子，酶對(duì)鹽濃度要求差別不大，中，高 鹽，可同時(shí)反應(yīng)。利于酶較貴重的鹽濃度緩沖液。鹽，可同時(shí)反應(yīng)。利于酶較貴重的鹽濃度緩沖液。 3）兩種酶切同一分子，酶對(duì)鹽濃度要求差別大，低，高鹽，）兩種酶切同一分子，酶對(duì)鹽濃度要求差別大，低，高鹽， 不可不可 同時(shí)反應(yīng)

17、。同時(shí)反應(yīng)。 a) 低鹽組先切，加熱滅活后，補(bǔ)加鹽濃度再切。低鹽組先切，加熱滅活后，補(bǔ)加鹽濃度再切。 b) 沉淀后重新加入另一種鹽濃度緩沖液沉淀后重新加入另一種鹽濃度緩沖液 c）兩種酶不能同時(shí)反應(yīng)，有先有后。兩種酶不能同時(shí)反應(yīng)，有先有后。 圖圖3-162酶量酶量 標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)37度反應(yīng)度反應(yīng)1小時(shí)完全水解小時(shí)完全水解1微克所需的酶量。微克所需的酶量。 0.11.0微克微克DNA 5微升微升 10倍緩沖液倍緩沖液 2微升微升 酶酶 1微升（微升（10倍過量）倍過量） 無菌水無菌水 12微升微升 總體積總體積 20微升微升 酶加入量不超過總體積十分之一酶加入量不超過總體積十分之一. 九酶切位點(diǎn)

18、的確定九酶切位點(diǎn)的確定 line DNA W=N+1 ccc DNA W=N 1. 片段大小片段大小2450 line DNA W=N+1 ccc DNA W=N2. 兩單酶切成三個(gè)片段兩單酶切成三個(gè)片段,說明各有兩個(gè)切點(diǎn)說明各有兩個(gè)切點(diǎn) -p- p- 750 500 12003 .Pst1, 1200, 750不見不見, 說明說明:(1) 另外兩個(gè)酶的切點(diǎn)在其中另外兩個(gè)酶的切點(diǎn)在其中 -x-p-p-x- Xbo1 500 (2) 兩個(gè)兩個(gè)Pst1酶的切點(diǎn)相距酶的切點(diǎn)相距500 500 -1200-4. 1200-300+900(被被Xbo1) -x-p-p- x- 300 900 Pst1距

19、距Xbo1為為300 -750-5. 750150+600 -x-p-p-x- 150 600 Pst1距距Xbo1為為600 -1400-6. 1400600+500+300 -x-p-p-x- 600 500 300 -2450-7. 2450-150+600+500+300+900 -x- p- p-x- 150 600 500 300 900 基因重組的其它工具酶基因重組的其它工具酶 1 DNA連接酶連接酶 催化的基本反應(yīng)形式：催化的基本反應(yīng)形式： 圖圖3-11 DNA雙鏈分子上相鄰雙鏈分子上相鄰 3 羥基和羥基和 5 磷酸集團(tuán)共價(jià)結(jié)合，磷酸集團(tuán)共價(jià)結(jié)合， 形成形成 3-5 磷酸二酯鍵

20、，磷酸二酯鍵， 使原來斷開的缺口重新連接起來。使原來斷開的缺口重新連接起來。（1）T4 DNA連接酶連接酶 由由 T4 噬菌體基因編碼，分子量噬菌體基因編碼，分子量60KD。 基本活性基本活性: 圖圖3-12 1）修復(fù)雙鏈）修復(fù)雙鏈DNA上單鏈缺口上單鏈缺口 2）連接）連接RNA-DNA雜交雙鏈上雜交雙鏈上DNA鏈缺口鏈缺口 3）連接完全斷開兩個(gè)平頭雙鏈）連接完全斷開兩個(gè)平頭雙鏈DNA分子。分子。 修復(fù)雙鏈修復(fù)雙鏈 DNA上上 單鏈缺口，單鏈缺口， 連接連接 RNA-DNA雜交雙鏈上雜交雙鏈上 DNA鏈缺口，鏈缺口， 連接完全斷開兩個(gè)平頭連接完全斷開兩個(gè)平頭 雙鏈雙鏈DNA分子。分子。 2聚合

21、酶聚合酶 DNA聚合酶活性聚合酶活性 3-13 1）5-3聚合酶活性聚合酶活性 2）3-5外切酶活性外切酶活性 3）5-3外切酶活性外切酶活性 4）核酸內(nèi)切酶活性）核酸內(nèi)切酶活性 Klenow酶酶 1）5-3聚合酶活性聚合酶活性 2）3-5外切酶活性外切酶活性 作用：作用： 1）修復(fù)限制性內(nèi)切酶造成）修復(fù)限制性內(nèi)切酶造成3凹端，成為平末端。凹端，成為平末端。 2）用同位素對(duì)）用同位素對(duì)DNA標(biāo)記。標(biāo)記。 3）催化第二鏈合成）催化第二鏈合成 4）測(cè)定）測(cè)定DNA序列序列 3末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(TdT) 圖圖3-141)1） 適合于帶有適合于帶有3游離羥基的雙鏈分子。游離羥基的雙鏈分子。2) DNA雙鏈雙鏈3端突出時(shí)，端突出時(shí)，