儀器分析毛細(xì)管電泳法ppt課件

1、 第五章第五章 毛細(xì)管電泳法毛細(xì)管電泳法Capillary Electrophoresis 本章要求本章要求 了解電泳、淌度、電滲的概念了解電泳、淌度、電滲的概念 了解毛細(xì)管電泳儀的結(jié)構(gòu)了解毛細(xì)管電泳儀的結(jié)構(gòu) 了解六種毛細(xì)管電泳分離模式了解六種毛細(xì)管電泳分離模式 毛細(xì)管電泳capillary electrophoresis，CE又稱高效毛細(xì)管電泳HPCE），是以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的液相分離技術(shù)。 CE 實(shí)際上包含電泳、色譜及其交叉內(nèi)容，使分析化學(xué)得以從微升水平進(jìn)入納升水平，并使單細(xì)胞分析，乃至單分子分析成為可能。生物大分子如蛋白質(zhì)的分離分析也因此有了新的轉(zhuǎn)機(jī)。5.1 基本

2、概念和原理基本概念和原理 在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子在直流電場(chǎng)的作用下，以在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子在直流電場(chǎng)的作用下，以不同的速度或速率向其所帶電荷相反電場(chǎng)方向遷移的現(xiàn)不同的速度或速率向其所帶電荷相反電場(chǎng)方向遷移的現(xiàn)象。陰離子向正極方向遷移，陽(yáng)離子向負(fù)極方向遷移，象。陰離子向正極方向遷移，陽(yáng)離子向負(fù)極方向遷移，中性化合物不帶電荷，不發(fā)生電泳運(yùn)動(dòng)。中性化合物不帶電荷，不發(fā)生電泳運(yùn)動(dòng)。 利用這些帶電粒子在電場(chǎng)中遷移速度的不同而達(dá)到分利用這些帶電粒子在電場(chǎng)中遷移速度的不同而達(dá)到分離的技術(shù)稱為電泳。離的技術(shù)稱為電泳。1. 電泳電泳2. 毛細(xì)管電泳：毛細(xì)管電泳：CE 以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道

3、，利用被分析以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，利用被分析離子在電場(chǎng)作用下移動(dòng)速率不同而達(dá)到分離的目的，主要用離子在電場(chǎng)作用下移動(dòng)速率不同而達(dá)到分離的目的，主要用于分析在毛細(xì)管緩沖溶液中離解為離子的物質(zhì)。于分析在毛細(xì)管緩沖溶液中離解為離子的物質(zhì)。毛細(xì)管的內(nèi)徑比頭發(fā)絲還細(xì)得多10-30千伏電壓3. 淌度淌度淌度：?jiǎn)挝浑妶?chǎng)下的電泳速度。淌度：?jiǎn)挝浑妶?chǎng)下的電泳速度。絕對(duì)淌度：在無限稀釋溶液中稀溶液數(shù)據(jù)外推測(cè)絕對(duì)淌度：在無限稀釋溶液中稀溶液數(shù)據(jù)外推測(cè)得的淌度稱為絕對(duì)淌度，得的淌度稱為絕對(duì)淌度，0em電泳速率：待測(cè)物從進(jìn)樣端到檢測(cè)窗口的遷移速度，電泳速率：待測(cè)物從進(jìn)樣端到檢測(cè)窗口的遷移速度，vem=

4、 =vEemem em：cm2/(s V)； vem ：cm/s； E：V/cm4. 電滲電滲毛細(xì)管內(nèi)充滿溶液毛細(xì)管內(nèi)充滿溶液 pH 3時(shí)，管內(nèi)時(shí)，管內(nèi) Si-OH 電離電離 SiO- 基，基，毛細(xì)管壁帶負(fù)電，與溶質(zhì)界面上形成雙電層。在雙電層的毛細(xì)管壁帶負(fù)電，與溶質(zhì)界面上形成雙電層。在雙電層的擴(kuò)散外層中，陽(yáng)離子向陰極移動(dòng)，帶動(dòng)溶液形成軸向流動(dòng)。擴(kuò)散外層中，陽(yáng)離子向陰極移動(dòng)，帶動(dòng)溶液形成軸向流動(dòng)。在毛細(xì)管中電滲速度可比電泳速度大一個(gè)數(shù)量級(jí)，所以能在毛細(xì)管中電滲速度可比電泳速度大一個(gè)數(shù)量級(jí)，所以能實(shí)現(xiàn)樣品組分同向泳動(dòng)。正離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流一致，實(shí)現(xiàn)樣品組分同向泳動(dòng)。正離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流一致

5、，最先流出；中性粒子的電泳流速度為最先流出；中性粒子的電泳流速度為“零零”，其遷移速度，其遷移速度相當(dāng)于電滲流速度；負(fù)離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流方向相反，相當(dāng)于電滲流速度；負(fù)離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流方向相反，但因電滲流速度一般都大于電泳速度，在中性粒子之后流但因電滲流速度一般都大于電泳速度，在中性粒子之后流出，從而因各種粒子遷移速度不同而實(shí)現(xiàn)分離。出，從而因各種粒子遷移速度不同而實(shí)現(xiàn)分離。離子的出峰次序?yàn)椋赫x子離子的出峰次序?yàn)椋赫x子 中性分子中性分子 負(fù)離子負(fù)離子電滲流的作用：電滲流的作用： 可一次完成陽(yáng)離子、陰離子、中性粒子的分離。可一次完成陽(yáng)離子、陰離子、中性粒子的分離。 改變電滲流的大小和

6、方向，可改變分離效率和選擇性，改變電滲流的大小和方向，可改變分離效率和選擇性，也是也是CE與與HPLC相比能優(yōu)化分離的重要因素。相比能優(yōu)化分離的重要因素。 電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性，控制電滲流恒定電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性，控制電滲流恒定是是CE分析關(guān)鍵所在。分析關(guān)鍵所在。 電滲流在電滲流在CE中起到像中起到像HPLC中的泵一樣作用。中的泵一樣作用。鉑電極鉑電極緩沖溶液緩沖溶液高壓電源高壓電源毛細(xì)管毛細(xì)管5.2 毛細(xì)管電泳裝置毛細(xì)管電泳裝置1. 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)電動(dòng)進(jìn)樣；壓力進(jìn)樣；擴(kuò)散進(jìn)樣。電動(dòng)進(jìn)樣；壓力進(jìn)樣；擴(kuò)散進(jìn)樣。進(jìn)樣體積一般在納升級(jí)。進(jìn)樣體積一般在納升級(jí)。2. 分離系統(tǒng)分

7、離系統(tǒng)毛細(xì)管：毛細(xì)管： 熔融石英，長(zhǎng)熔融石英，長(zhǎng)40100 cm，內(nèi)徑，內(nèi)徑25100 m；恒溫系統(tǒng)：控制柱溫變化在恒溫系統(tǒng)：控制柱溫變化在0.1； 高壓電源：電流高壓電源：電流0300 A，電壓，電壓030 kV (穩(wěn)定性穩(wěn)定性0.1%)3. 檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)4. 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)紫外紫外-可見檢測(cè)器可見檢測(cè)器 ；激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器；電化學(xué)檢測(cè)器。；激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器；電化學(xué)檢測(cè)器。5.3 毛細(xì)管電泳分離模式毛細(xì)管電泳分離模式6種分離模式：種分離模式： 毛細(xì)管區(qū)帶電泳毛細(xì)管區(qū)帶電泳CZE 毛細(xì)管等速電泳毛細(xì)管等速電泳CITP 毛細(xì)管等電聚焦毛細(xì)管等電聚焦CIEF 毛細(xì)管電色譜毛細(xì)管電

8、色譜CEC 膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜MECC 毛細(xì)管凝膠電泳毛細(xì)管凝膠電泳CGE1. 毛細(xì)管區(qū)帶電泳毛細(xì)管區(qū)帶電泳 (CZE) 用用CZE時(shí)，整個(gè)系統(tǒng)用一種緩沖溶液時(shí)，整個(gè)系統(tǒng)用一種緩沖溶液 (背景電解質(zhì)背景電解質(zhì))，根據(jù)，根據(jù)各組分荷質(zhì)比不同而分離。背景電解質(zhì)僅起各組分荷質(zhì)比不同而分離。背景電解質(zhì)僅起傳導(dǎo)電流的作用。傳導(dǎo)電流的作用。 t 0 t 02. 毛細(xì)管等速電泳毛細(xì)管等速電泳CITP） 使用兩種電解質(zhì)：一種為遷移率較高的前導(dǎo)離子使用兩種電解質(zhì)：一種為遷移率較高的前導(dǎo)離子L電解質(zhì)，電解質(zhì)，一種為遷移率較低的尾隨離子一種為遷移率較低的尾隨離子T電解質(zhì)，被分離組分夾在電解質(zhì)，被分

9、離組分夾在L與與T之間，以同一速度運(yùn)動(dòng)，由于遷移率不同而分離。之間，以同一速度運(yùn)動(dòng)，由于遷移率不同而分離。3. 毛細(xì)管等電聚焦毛細(xì)管等電聚焦 (CIEF) 基本操作步驟：進(jìn)樣、聚焦和遷移，用于生物大分子的分離?；静僮鞑襟E：進(jìn)樣、聚焦和遷移，用于生物大分子的分離。酸酸酸酸堿堿堿堿毛細(xì)管等電聚焦電泳的運(yùn)行過程毛細(xì)管等電聚焦電泳的運(yùn)行過程 (a)進(jìn)樣；進(jìn)樣；(b)聚焦；聚焦；(c)遷移遷移4. 毛細(xì)管電色譜毛細(xì)管電色譜 (CEC) 分為填充柱和開管柱兩種方式，可分離離子和中性分子，且分為填充柱和開管柱兩種方式，可分離離子和中性分子，且可分離手性分子。可分離手性分子。5. 膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜膠束電動(dòng)

10、毛細(xì)管色譜 (MECC) 兩相：流動(dòng)的水相和起固定相作用的膠束相兩相：流動(dòng)的水相和起固定相作用的膠束相(準(zhǔn)固定相準(zhǔn)固定相)，被測(cè)組分由于在水相和膠束相之間分配系數(shù)的差異而分離。被測(cè)組分由于在水相和膠束相之間分配系數(shù)的差異而分離。5.4 毛細(xì)管電泳特點(diǎn)及應(yīng)用毛細(xì)管電泳特點(diǎn)及應(yīng)用(1) 高分辨率：理論塔板數(shù)高達(dá)數(shù)百萬塊至數(shù)千萬塊。高分辨率：理論塔板數(shù)高達(dá)數(shù)百萬塊至數(shù)千萬塊。(2) 高靈敏度：可檢測(cè)出低至高靈敏度：可檢測(cè)出低至10-20 mol濃度的物質(zhì)。濃度的物質(zhì)。(3) 高分析速度：可高分析速度：可3 min內(nèi)分離內(nèi)分離30種陰離子；種陰離子；1.7 min內(nèi)內(nèi)分離分離19種陽(yáng)離子；種陽(yáng)離子；4

11、 min內(nèi)分離內(nèi)分離10種蛋白質(zhì)。種蛋白質(zhì)。(4) 試樣用量少：僅需幾試樣用量少：僅需幾nL (10-9 L)的試樣。的試樣。(5) 儀器簡(jiǎn)單，操作成本低：分析一個(gè)試樣僅需幾毫升。儀器簡(jiǎn)單，操作成本低：分析一個(gè)試樣僅需幾毫升。(6) 自動(dòng)：自動(dòng)：CE是目前自動(dòng)化程度最高的分離方法。是目前自動(dòng)化程度最高的分離方法。(7) 通常使用水溶液，對(duì)人和環(huán)境無害。通常使用水溶液，對(duì)人和環(huán)境無害。1. 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)2eUND HPLC中，縱向擴(kuò)散和傳質(zhì)阻力是影響譜峰展寬的重要因中，縱向擴(kuò)散和傳質(zhì)阻力是影響譜峰展寬的重要因素，而素，而CE只有縱向擴(kuò)散影響譜峰展寬，塔板數(shù)：只有縱向擴(kuò)散影響譜峰展寬，塔板數(shù)：D: 組

12、分?jǐn)U散系數(shù)組分?jǐn)U散系數(shù)U：毛細(xì)管兩端施加電壓：毛細(xì)管兩端施加電壓可采用可采用2000060000V的高壓，分離速度和分離度有明顯的高壓，分離速度和分離度有明顯的改善，的改善，N為為(12)105，HPLC的的N為為51032104。理論塔板數(shù)理論塔板數(shù)(1) 進(jìn)樣不夠方便。進(jìn)樣不夠方便。(2) 分析陰離子時(shí)，出峰時(shí)間較長(zhǎng)。電滲會(huì)因樣品組成而變分析陰離子時(shí)，出峰時(shí)間較長(zhǎng)。電滲會(huì)因樣品組成而變化，影響分離重現(xiàn)性?；?，影響分離重現(xiàn)性。(3) 光路太短，非高靈敏度的檢測(cè)器難以測(cè)出樣品峰。光路太短，非高靈敏度的檢測(cè)器難以測(cè)出樣品峰。2. 缺陷缺陷毛細(xì)管電泳與高效液相色譜比較：毛細(xì)管電泳與高效液相色譜比較

13、： 操作簡(jiǎn)單，試樣量少。操作簡(jiǎn)單，試樣量少。 分離效率高，成本低。分離效率高，成本低。 遷移時(shí)間的重現(xiàn)性、進(jìn)樣的準(zhǔn)確性和靈敏度比遷移時(shí)間的重現(xiàn)性、進(jìn)樣的準(zhǔn)確性和靈敏度比HPLC差。差。3. 運(yùn)用運(yùn)用毛細(xì)管電泳技術(shù)不僅在基礎(chǔ)科學(xué)中得到廣泛應(yīng)用，在臨床毛細(xì)管電泳技術(shù)不僅在基礎(chǔ)科學(xué)中得到廣泛應(yīng)用，在臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域也有較多應(yīng)用，如臨床疾病診斷、臨床蛋白分醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域也有較多應(yīng)用，如臨床疾病診斷、臨床蛋白分析、臨床藥物監(jiān)測(cè)、代謝研究、病理研究、析、臨床藥物監(jiān)測(cè)、代謝研究、病理研究、PCR產(chǎn)物分析、產(chǎn)物分析、DNA片段及序列分析等。片段及序列分析等。可檢測(cè)多種樣品，如血清、血漿、尿樣、腦脊液、紅細(xì)胞、可檢測(cè)多種樣品，如血清、血漿、尿樣、腦脊液、紅細(xì)胞、體液或組織及其實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)。體液或組織及其實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)。除分離生物大分子肽、蛋白、除分離生物大分子肽、蛋白、 DNA、糖等外，還可、糖等外，還可用