流式細(xì)胞術(shù)的基本原理與應(yīng)用簡介ppt課件

1、流式細(xì)胞術(shù)的根本原理與運(yùn)用簡介流式細(xì)胞術(shù)的根本原理與運(yùn)用簡介余琪琪余琪琪12-09-2019流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)n流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)Flow Cytometry就是對處在快就是對處在快速直線流動形狀中的單列細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)展速直線流動形狀中的單列細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)展逐個(gè)、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分選逐個(gè)、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分選的技術(shù)。的技術(shù)。Injector TipSheath fluid流式細(xì)胞儀任務(wù)原理表示圖流式細(xì)胞儀可提供的信息流式細(xì)胞儀可提供的信息n物理信息：經(jīng)過散射光信號反映物理信息：經(jīng)過散射光信號反映n熒光信息：經(jīng)過熒光信號反映熒光信息：經(jīng)過熒光信號反映散射光信號

2、的產(chǎn)生散射光信號的產(chǎn)生n488nm激光產(chǎn)生散射光激光產(chǎn)生散射光SSCFSC前向角散射光信號前向角散射光信號FSC側(cè)向角散射光信號側(cè)向角散射光信號SSC利用散射光信號對混合細(xì)胞分群利用散射光信號對混合細(xì)胞分群n紅細(xì)胞裂解的全血紅細(xì)胞裂解的全血熒光信號的產(chǎn)生熒光信號的產(chǎn)生熒光信號的表示方法熒光信號的表示方法雙參數(shù)點(diǎn)圖雙參數(shù)點(diǎn)圖單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖一個(gè)完好的流式實(shí)驗(yàn)流程一個(gè)完好的流式實(shí)驗(yàn)流程 樣品的預(yù)備 熒光標(biāo)志的選擇 對照設(shè)置 儀器條件確實(shí)定 數(shù)據(jù)分析樣品預(yù)備 血液或骨髓標(biāo)本 體液、灌洗液、懸浮培育細(xì)胞 貼壁細(xì)胞 組織標(biāo)本單細(xì)胞懸液，濃度單細(xì)胞懸液，濃度51051 106/mL樣本流速的選擇n

3、高流速：普通用于定性分析，如免疫分型。采集速度快，但分辨率低高流速：普通用于定性分析，如免疫分型。采集速度快，但分辨率低.n低流速：普通用于對分辨率要求較高的分析，如低流速：普通用于對分辨率要求較高的分析，如DNA分析。分析。n 注：根據(jù)制備樣本濃度隨時(shí)調(diào)整流速注：根據(jù)制備樣本濃度隨時(shí)調(diào)整流速熒光標(biāo)志抗體的選擇 盡量運(yùn)用直標(biāo)抗體 多色標(biāo)志時(shí)應(yīng)該添加各種抗體的用量或適當(dāng)延伸反響時(shí)間 根據(jù)流式細(xì)胞儀的類型及熒光素的光譜選擇熒光抗體 根據(jù)檢測物抗原表達(dá)量選擇熒光染料 運(yùn)用雙標(biāo)以上抗體需求做熒光補(bǔ)償流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀n型號：型號：BD FACSCanto IIn光學(xué)信號的產(chǎn)生：光學(xué)信號的產(chǎn)生：n激光

4、激光488nm，633nmn光學(xué)信號的搜集：光學(xué)信號的搜集：n光學(xué)濾片光學(xué)濾片n光電倍增管光電倍增管PMT：將光信號轉(zhuǎn)換成電信號：將光信號轉(zhuǎn)換成電信號FACSCantoII的光學(xué)濾片的光學(xué)濾片長通濾片長通濾片Longpass，LP帶通濾片帶通濾片Bandpass，BPLP500500/50750-810nm650-670nmFACSCantoII信號檢測組件信號檢測組件常見熒光染料的發(fā)射波長常見熒光染料的發(fā)射波長熒光強(qiáng)度：熒光強(qiáng)度：APCPEPE-Cy7FITCAPCPEPE-Cy7FITC每個(gè)通道只能選擇一種熒光素每個(gè)通道只能選擇一種熒光素各個(gè)通道之間的熒光素可以隨意搭配各個(gè)通道之間的熒光素

5、可以隨意搭配搭配的熒光素之間的發(fā)射光譜重疊盡量小搭配的熒光素之間的發(fā)射光譜重疊盡量小對照設(shè)置對照設(shè)置n陰性對照陰性對照n陽性對照陽性對照n補(bǔ)償對照補(bǔ)償對照陰性對照 空白對照：即不進(jìn)展任何標(biāo)志的細(xì)胞。主要用于確定待測標(biāo)本的根底熒光域值 同型對照：即用同型抗體作平行實(shí)驗(yàn)。同型抗體為沒有特異性、與熒光抗體蛋白亞型一致的免疫球蛋白，通常是未進(jìn)展免疫小鼠血清的純化IgG1或IgG2。陽性對照 陽性對照：陽性對照即運(yùn)用知表達(dá)某種抗原的細(xì)胞陽性細(xì)胞進(jìn)展平行實(shí)驗(yàn)。通常用于檢測抗體能否有問題或確定實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性補(bǔ)償對照 補(bǔ)償對照:多色熒光分析，進(jìn)展熒光補(bǔ)償 將用于多色標(biāo)志的各種熒光抗體分別與樣本反響，

6、一一進(jìn)展單色標(biāo)志，以測定熒光信號的重疊并做適當(dāng)調(diào)整儀器條件確實(shí)定儀器條件確實(shí)定n電壓電壓n閾值閾值n熒光補(bǔ)償多色分析熒光補(bǔ)償多色分析電壓 PMT將光信號轉(zhuǎn)換成電信號，調(diào)整將光信號轉(zhuǎn)換成電信號，調(diào)整PMT的電壓，的電壓，信號強(qiáng)度將隨之改動。信號強(qiáng)度將隨之改動。放大器兩種放大方式：線性放大lin對數(shù)放大log光信號光電倍增管PMT放大器電信號線性放大線性放大linlin按光強(qiáng)度的線性關(guān)系輸出信號FSC、SSC、細(xì)胞周期檢測等對數(shù)放大對數(shù)放大loglog按光強(qiáng)度的對數(shù)關(guān)系輸出信號，用于大多數(shù)熒光染色實(shí)驗(yàn)閾值閾值threshholdthreshhold 屏蔽噪音信號和碎片信號熒光補(bǔ)償熒光補(bǔ)償 采用適宜

7、的方法校正熒光染料之間疊加所呵斥的誤差采用適宜的方法校正熒光染料之間疊加所呵斥的誤差補(bǔ)償公式補(bǔ)償公式 通常干擾光占該染料所發(fā)出熒光總量的通常干擾光占該染料所發(fā)出熒光總量的X%。RD1-X%FITC補(bǔ)償模型補(bǔ)償模型PE-X%FITC橫平豎直補(bǔ)償調(diào)整的實(shí)驗(yàn)過程補(bǔ)償調(diào)整的實(shí)驗(yàn)過程 樣本預(yù)備：陰性樣本，單陽性樣本樣本預(yù)備：陰性樣本，單陽性樣本 調(diào)整：第一步：陰性樣本調(diào)整一切調(diào)整：第一步：陰性樣本調(diào)整一切PMT 第二步：單陽性樣本調(diào)整補(bǔ)償?shù)诙剑簡侮栃詷颖菊{(diào)整補(bǔ)償 自動調(diào)補(bǔ)償自動調(diào)補(bǔ)償 手動調(diào)補(bǔ)償手動調(diào)補(bǔ)償判別規(guī)范：橫平豎直判別規(guī)范：橫平豎直數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)顯示方式：單參數(shù)直方圖 二維散點(diǎn)圖 二維等高線圖 假三維圖 三維圖 列表方式 設(shè)門：在細(xì)胞分布圖中指定某一個(gè)范圍或某一細(xì)胞性狀的細(xì)胞群，并對其進(jìn)展單參數(shù)或多參數(shù)分析。單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖 雙參數(shù)點(diǎn)圖雙參數(shù)點(diǎn)圖 二維等高圖二維等高圖Pseudo 3D Plot3D Plot 密度圖密度圖 假三維圖假三維圖 三維圖三維圖 設(shè)門設(shè)定陰性與陽性群體的界限確定陽性與陰性細(xì)胞群體統(tǒng)計(jì)陽性或陰性細(xì)胞群體的百分率，平均熒光值，絕對數(shù)或抗