第十九章毛細(xì)管電泳法PPT課件

1、第一節(jié)第一節(jié) 概述概述電泳電泳（Electrophoresis)是指溶液中帶電粒子在電場的作用下向與自身帶相反電荷的電極移動的現(xiàn)象。將電泳發(fā)展成為分離技術(shù)應(yīng)歸功于Tiselius的工作。他于1937年建立“移界電泳（moving boundary electrophoresis)”，成功地將人血清中的蛋白質(zhì)分為白蛋白、和球蛋白，這項(xiàng)工作成為蛋白質(zhì)化學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)，因此Tiselius本人榮獲1948年諾貝爾化學(xué)獎。 高效毛細(xì)管電泳高效毛細(xì)管電泳 經(jīng)典電泳法散熱差，分離電壓受到限制。經(jīng)典電泳法散熱差，分離電壓受到限制。1981年，年，Jorgenson和和Lukacs發(fā)表了在毛細(xì)管電泳發(fā)展史上具有

2、劃時代發(fā)表了在毛細(xì)管電泳發(fā)展史上具有劃時代意義的工作，他們采用意義的工作，他們采用75m內(nèi)徑的石英毛細(xì)管做為分離室，紫外柱上內(nèi)徑的石英毛細(xì)管做為分離室，紫外柱上檢測的方法，在檢測的方法，在30kv的分離電壓下分離丹酰化氨基酸，柱效達(dá)到的分離電壓下分離丹?；被?，柱效達(dá)到40萬萬個理論塔板。他們的工作為毛細(xì)管電泳的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。個理論塔板。他們的工作為毛細(xì)管電泳的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。James W. JorgensonNorth Illinois University化學(xué)系教授化學(xué)系教授第二節(jié)第二節(jié) 基本理論基本理論一一. . 電滲電滲u電滲（電滲（electroosmosis)electroo

3、smosis)是毛細(xì)管電泳分離理論中最基本的概是毛細(xì)管電泳分離理論中最基本的概念之一。念之一。 電滲電滲是指在電場作用下，毛細(xì)管中或固相多孔是指在電場作用下，毛細(xì)管中或固相多孔物質(zhì)內(nèi)，液體沿固體表面移動的現(xiàn)象。電滲與固液兩相界物質(zhì)內(nèi)，液體沿固體表面移動的現(xiàn)象。電滲與固液兩相界面的雙電層有著密切關(guān)系。面的雙電層有著密切關(guān)系。 EEuosos4os電滲速度電滲速度uos以下式表示：以下式表示： u石英毛細(xì)管壁上的硅羥基在水石英毛細(xì)管壁上的硅羥基在水溶液中發(fā)生電離，所產(chǎn)生的溶液中發(fā)生電離，所產(chǎn)生的SiOSiO- -負(fù)離子使毛細(xì)管壁帶負(fù)電負(fù)離子使毛細(xì)管壁帶負(fù)電荷。溶液中的抗衡離子靠靜電荷。溶液中的抗衡

4、離子靠靜電吸附和分子擴(kuò)散在固液界面上吸附和分子擴(kuò)散在固液界面上形成雙電層（形成雙電層（electric electric double layer)double layer)，雙電層包括，雙電層包括緊密層和擴(kuò)散層。緊密層和擴(kuò)散層。u在電場作用下，固液兩相間的相對運(yùn)動發(fā)生在緊密層與擴(kuò)散層之間的在電場作用下，固液兩相間的相對運(yùn)動發(fā)生在緊密層與擴(kuò)散層之間的滑動面上?；瑒用嫔?。由于離子的溶劑化作用，當(dāng)形成擴(kuò)散層的離子在電場中移動時，攜帶由于離子的溶劑化作用，當(dāng)形成擴(kuò)散層的離子在電場中移動時，攜帶著液體一同移動，因此產(chǎn)生電滲流（著液體一同移動，因此產(chǎn)生電滲流（electroosmotic flow,EO

5、Felectroosmotic flow,EOF）陽離子型的表面活性劑使電滲流陽離子型的表面活性劑使電滲流發(fā)生反轉(zhuǎn)發(fā)生反轉(zhuǎn) a.無表面活性劑存在；無表面活性劑存在；b陽離子表陽離子表面活性劑在毛細(xì)管壁表面的吸附，面活性劑在毛細(xì)管壁表面的吸附，抵消了原來的負(fù)電荷，使電滲遷移抵消了原來的負(fù)電荷，使電滲遷移率率0；c.繼續(xù)增大陽離子表面活性繼續(xù)增大陽離子表面活性劑的濃度，陽離子表面活性劑分子劑的濃度，陽離子表面活性劑分子通過非極性鏈?zhǔn)杷嗷プ饔?，在毛通過非極性鏈?zhǔn)杷嗷プ饔?，在毛?xì)管柱表面形成雙分子層，使電滲細(xì)管柱表面形成雙分子層，使電滲流反轉(zhuǎn)流反轉(zhuǎn).u在緩沖液中在緩沖液中加入有機(jī)添加劑加入有機(jī)添加

6、劑，如甲醇、，如甲醇、異丙醇等，或水溶性高分子物質(zhì)，對異丙醇等，或水溶性高分子物質(zhì)，對EOF也有較顯著的抑制作用。也有較顯著的抑制作用。u電泳電泳（electrophoresiselectrophoresis）是指溶液中帶電粒子（離子）在電場）是指溶液中帶電粒子（離子）在電場中定向移動的現(xiàn)象。中定向移動的現(xiàn)象。u電泳遷移速度電泳遷移速度 uep 為為： 式中式中 電泳遷移率（電泳淌度）電泳遷移率（電泳淌度） （electrophoresis mobility)（m2/V.s） V毛細(xì)管柱兩端施加的電壓毛細(xì)管柱兩端施加的電壓, L毛細(xì)管柱長毛細(xì)管柱長二二 . 電泳電泳LVEuepepepep4i

7、ep 在空心毛細(xì)管中一個粒子的淌度可近似表示為：在空心毛細(xì)管中一個粒子的淌度可近似表示為： 三、表觀淌度Euuuoseffoseffap)（表觀淌度表觀淌度表觀遷移速度表觀遷移速度正離子正離子eff+osueff+ uos中性分子中性分子osuos負(fù)離子負(fù)離子eff-osueff - uos由于電滲流速度大大高于電泳速度，所以，不管正離子、負(fù)離子還是由于電滲流速度大大高于電泳速度，所以，不管正離子、負(fù)離子還是中性分子，均隨電滲流移動。中性分子，均隨電滲流移動。物質(zhì)在毛細(xì)管中的保留時間為： Ld為毛細(xì)管柱進(jìn)樣端至檢測窗口的距離（有效長度）VLLuLtapdapdm四、分離效率和譜帶展寬四、分離效

8、率和譜帶展寬（一）理論板數(shù)和板高（一）理論板數(shù)和板高22/154. 5WtnmnLHd22dLn m22DtVLLuLtapdapdmDLVLn2dap毛細(xì)管電泳分離柱效方程毛細(xì)管電泳分離柱效方程u從分離柱效方程可知：從分離柱效方程可知：（1）分離電壓）分離電壓V, n（2）V一定時，一定時，Ld/L , n（3）擴(kuò)散系數(shù)）擴(kuò)散系數(shù)D, n；大分子的；大分子的D小，故小，故CE對大分子分離柱效高。對大分子分離柱效高。（二）引起區(qū)帶展寬的因素1.分子擴(kuò)散2.焦耳熱 電流通過毛細(xì)管中的電解質(zhì)溶液時會產(chǎn)生焦耳熱，使毛細(xì)管內(nèi)及周圍溫度分布。由于毛細(xì)管柱中沿徑向存在一個拋物線型的溫度梯度，由此引起介質(zhì)的

9、粘度在徑向上的梯度分布，進(jìn)而引起徑向上的電泳速度梯度。3.吸附產(chǎn)生原因： （1）陽離子溶質(zhì)和帶負(fù)電的管壁的離子相互作用（2）疏水作用。 對于生物大分子，如堿性蛋白和多肽等，吸附嚴(yán)重時可能導(dǎo)致測不到信號。因此，生物大分子分析時常需用涂層處理的毛細(xì)管柱。 4.進(jìn)樣 （過載）5.電泳樣品區(qū)帶與周圍電解質(zhì)溶液間的電導(dǎo)率差，從而導(dǎo)致峰形展寬。分離度是指將淌度相近的組分分離的能力 4)(2122112mmmmttWWttRuunR4分離度也可表示為柱效的函數(shù)：分離度也可表示為柱效的函數(shù)： 2/1oseffdeff241）（DLVLR討論討論：分離度是下列因素的函數(shù)：外加電壓：分離度是下列因素的函數(shù)：外加電

10、壓V；有效柱長與總；有效柱長與總長度之比（長度之比（Ld/L）；電泳有效淌度差；電滲淌度）；電泳有效淌度差；電滲淌度 五、分離度五、分離度第三節(jié)第三節(jié) 毛細(xì)管電泳的主要分離模式毛細(xì)管電泳的主要分離模式 毛細(xì)管區(qū)帶電泳（capillary zone electrophoresis，CZE）膠束電動色譜（micellar electrokinetic chromatography, MEKC)毛細(xì)管凝膠電泳（capillary gel electrophoresis, CGE)毛細(xì)管等速電泳（capillary isotachophoresis, CITP) 毛細(xì)管等電聚焦（capillary i

11、soelectric focus, CIF)毛細(xì)管電色譜（capillary electrochromatography, CEC)毛細(xì)管電泳最基本的分離模式。背景電解質(zhì)是緩沖液，分離是基于樣品中各個組分間質(zhì)荷比的差異。有時需在緩沖液中加入一定的添加劑，用以提高分離選擇性，改變電滲流的大小、方向或抑制毛細(xì)管壁的吸附等。在CZE中，影響分離的操作條件為： 分離電壓 背景電解質(zhì)種類、濃度和pH 添加劑種類和濃度 分離效率與電壓間存在極大值。極大電壓通常也是最佳工作電壓。在實(shí)際分離中，如果所用的毛細(xì)管很細(xì)或緩沖液的電導(dǎo)很低，極大電壓可能會超出儀器范圍，此時沒有最佳電壓，可選擇儀器允許的最大輸出電壓。

12、當(dāng)毛細(xì)管較粗或緩沖液電導(dǎo)較高時，極大電壓可能很小，若此時分離度很高，也可選擇大于極大值的電壓進(jìn)行分離。1. 分離電壓分離電壓毛細(xì)管的溫度不僅影響分離的重視性，而且影響分離效率。溫度選擇應(yīng)考慮熱效應(yīng)、分析重現(xiàn)性、分離效率和分離介質(zhì)對溫度的限制等因素。溫度的確定也應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)，多數(shù)情況下，在2030之間進(jìn)行電泳，能獲得良好的分離效果?？筛鶕?jù)初步分離結(jié)果調(diào)整溫度。不少糖類樣品需要高于室溫的分離環(huán)境，一些樣品如蛋白等則可能需要低于室溫的分離條件。2.分離溫度分離溫度對背景電解質(zhì)的要求：在所選擇的pH范圍內(nèi)有足夠大的緩沖容量。在檢測波長處的吸收低。自身的淌度低，即分子大而荷電小，以減少電流的產(chǎn)生。應(yīng)使被測

13、組分帶合適的電荷量，以實(shí)現(xiàn)有效進(jìn)樣和有合適的電泳淌度。盡可能采用酸性緩沖溶液，在低pH下，吸附和電滲流值都很小。與毛細(xì)管種類匹配，涂層毛細(xì)管只能在一定pH范圍內(nèi)使用。 3. 背景電解質(zhì)背景電解質(zhì) 在CZE中，常用于毛細(xì)管電泳的緩沖溶液有硼砂、磷酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽和醋酸鹽等。 緩沖體系的pH值要求與樣品的性質(zhì)有關(guān)，通常酸性組分的分離選擇在堿性條件下進(jìn)行，而堿性組分則選擇酸性介質(zhì)分離，蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸等兩性物質(zhì)，可選酸性(pH2)也可選堿性(pH9)分離介質(zhì)。糖類樣品通常在pH911之間能獲得最佳分離，羧酸或其它樣品多在pH59之間選擇分離條件。pH的選擇也和毛細(xì)管種類有關(guān)，很多涂層毛細(xì)

14、管只能在一定pH范圍內(nèi)使用，如聚丙烯酰胺涂層毛細(xì)管，只能在pH49范圍內(nèi)使用，否則涂層易水解失效。在相同的pH下，不同緩沖體系的分離效果可能相差很大，一般來說，能與樣品發(fā)生相互作用的試劑可能是最好的。如分離糖類和DNA等分子時優(yōu)先使用硼酸鹽緩沖體系，因?yàn)榕鹚岣芘c糖羥基形成配位鍵，從而增加糖的負(fù)電荷和分離度。硼酸鹽緩沖體系也適用于其它含鄰羥基或多羥基的化合物分離。 為了選擇合適的pH值，需要pH調(diào)節(jié)劑調(diào)整介質(zhì)的酸堿性。由于多數(shù)緩沖試劑屬酸性物質(zhì)，如磷酸，所以pH調(diào)節(jié)劑主要是堿類，常用的pH調(diào)節(jié)劑有NaOH、KOH、Tris等。有時也可考慮用胺或醇胺等有機(jī)堿，如乙醇胺、乙二胺。如果緩沖試劑為堿類

15、，則可用酸作為調(diào)節(jié)劑，盡量使用弱酸，如 H3PO4。 緩沖劑及調(diào)節(jié)劑的濃度對改善分離、抑制吸附、控制焦耳熱等均有影響，一般緩沖試劑的濃度控制在10200mmol/L，有時為了抑制蛋白質(zhì)等的吸附作用，可用高達(dá)500mmol/L的濃度（此時應(yīng)減少分離電壓）。電導(dǎo)率高的緩沖試劑如磷酸鹽和硼酸鹽等，一般控制在20mmol/L，電導(dǎo)小的緩沖試劑如硼酸其濃度可在100mmol/L以上。 如果緩沖體系經(jīng)各種參數(shù)優(yōu)化后仍無法給出良好的分離結(jié)果，可以加入添加劑以改善分離。添加劑種類較多： 1.無機(jī)電解質(zhì)（NaCl、KCl） 2.有機(jī)溶劑（如甲醇、乙腈） 3.非電解質(zhì)高分子（纖維素、多糖、聚乙烯醇、Triton

16、X-100) 4. 功能性添加劑（手性冠醚、環(huán)糊精等） 在緩沖溶液中加入離子型表面活性劑（如SDS），當(dāng)表面活性劑濃度超過其臨界膠束濃度時，則形成親水膠束，膠束具有疏水內(nèi)核, 外層帶負(fù)電荷。溶質(zhì)分子則在極性緩沖液與膠束中心的非極性相（假固定相）之間有一定的分配。中性分子因其本身疏水性不同，在兩相中分配存在差異。在電滲流作用下，膠束攜帶溶質(zhì)一起前行，疏水性強(qiáng)的溶質(zhì)和膠束結(jié)合得較牢，流出慢。不同分子在兩相中的分配差異是MECC分離的基礎(chǔ)。常用的陰離子表面活性劑有十二烷基硫酸鈉（SDS）、N-月桂酰-N-甲基?；撬徕c（LMT）、?；敲撗跄懰徕c（STDC）等。陽離子表面活性劑最常用的是季銨鹽，如十二烷

17、基三甲基溴化銨（DTAB）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等。非離子型表面活性劑有3-3-(氯化酰胺基丙基)二甲基胺基-1-丙基磺酸酯（CHAPS）等。另外，還有手性表面活性劑，如膽酸、毛地黃皂苷、十二烷基-N-L-纈氨酸鈉等。 表面活性劑選擇時應(yīng)考慮以下因素：（1）經(jīng)濟(jì)易得（2）水溶性好（3）紫外吸收背景越低越好（4）不與樣品發(fā)生破壞性作用（5）所形成的膠束足夠穩(wěn)定碳鏈較短的陰離子表面活性劑為優(yōu)先選擇對象。SDS易得、紫外吸收低，最為常用。如經(jīng)濃度、緩沖溶液及pH優(yōu)化，分離仍不佳，再換具有不同碳鏈長度或結(jié)構(gòu)的其它陰離子表面活性劑。若結(jié)果仍不好，應(yīng)考慮使用陽離子或中性、兩性表面活性劑，如CT

18、AB（ 十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 銨 ） 、 T r i t o n X - 1 0 0 等 。應(yīng) 注 意 ： 陽 離 子 表 面 活 性 劑 可 能 會 改 變 電 滲 流 方 向 。膠束修飾：添加重金屬離子可改變膠束表面的電荷數(shù)量；使用混合表面活性劑可調(diào)節(jié)分離度或峰分布；加入另一種膠束，如采用多相體系（水膠束環(huán)糊精），利用多種作用改善分離。以微填充柱作為分離柱，以電滲流驅(qū)動流動相完成色譜分離過程。CEC中，固定相的選擇主要依據(jù)HPLC的理論和經(jīng)驗(yàn)，常用C18或C8 。 根據(jù)固定相的特性（正相、反相等），緩沖液可以是水溶液或有機(jī)溶液。常用乙腈水或甲醇水等為流動相。 1.盡可能多地了

19、解樣品的類型、來源、組成及其性質(zhì)。2.根據(jù)樣品性質(zhì)、來源選擇分離模式，若無樣品信息可先選CZE。3.根據(jù)樣品性質(zhì)確定檢測方法。4.確定pH、緩沖試劑濃度。5.優(yōu)化其它操作參數(shù)，如毛細(xì)管尺寸、分離電壓、溫度等。6.確定是否需要使用添加劑和非水溶劑。7.根據(jù)分離結(jié)果考慮是否換其它分離模式。1.高壓電極槽和進(jìn)樣機(jī)構(gòu) 2.填灌清洗機(jī)構(gòu) 3.毛細(xì)管 4.檢測器 5.鉑絲電極 6.低壓電極槽 7.恒溫系統(tǒng) 8.數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng)進(jìn)樣機(jī)構(gòu)不存在死體積，能進(jìn)行精確的進(jìn)樣控制。需有毛細(xì)管清洗機(jī)構(gòu)。高壓電源至少應(yīng)能輸出200A25kV的功率。檢測器盡量安裝在接地端，優(yōu)先考慮柱上紫外檢測方式。 溫控范圍寬，以0 為界

20、，越寬越好，上限不應(yīng)低于50 ，最好能達(dá)到6570 ，至少能在2040內(nèi)恒溫，恒溫精度應(yīng)小于0.2 。高壓電源一般采用（030）kV連續(xù)可調(diào)的直流高壓電源，電壓輸出精度應(yīng)高于1%。電極通常由直徑0.5mm1mm的鉑絲制成。電極槽通常是帶螺帽的玻璃瓶或塑料瓶（1ml5ml不等），以便于密封。儀器必須接地，操作過程中必須注意高壓的安全保護(hù)。 一、高壓電源一、高壓電源1.尺寸 毛細(xì)管尺寸的選擇與分離模式和樣品有關(guān)。自由溶液電泳多選用50或75m內(nèi)徑的毛細(xì)管，分離的有效長度?？刂圃?0100cm之間。如進(jìn)行大顆粒如紅細(xì)胞的分離，則需要內(nèi)徑大于 300m的毛細(xì)管。CGE或CEC的有效長度一般控制在20c

21、m左右。 2.涂層 一般不需涂層處理。大分子化合物分離時，常常需要惰性管壁，以抑制吸附。做CIEF或CGE時，需要涂層毛細(xì)管以抑制電滲。在分離中，有時為了加強(qiáng)電滲或改變其方向，也需要涂層毛細(xì)管。3. 清洗清洗毛細(xì)管在使用過程可能被污染，從而影響分析的結(jié)果。為使測定具毛細(xì)管在使用過程可能被污染，從而影響分析的結(jié)果。為使測定具有良好的重現(xiàn)性，毛細(xì)管在使用時應(yīng)經(jīng)常清洗。有良好的重現(xiàn)性，毛細(xì)管在使用時應(yīng)經(jīng)常清洗?？展芡ǔＳ每展芡ǔＳ?0.l1mol/L NaOH、水和緩沖液順序沖洗，各洗、水和緩沖液順序沖洗，各洗510min，或增加有機(jī)溶劑如甲醇清洗步驟，以除去管中的脂溶性，或增加有機(jī)溶劑如甲醇清洗步

22、驟，以除去管中的脂溶性吸附組分。如果懷疑管內(nèi)壁吸附有蛋白質(zhì)或其他有機(jī)分子，可用吸附組分。如果懷疑管內(nèi)壁吸附有蛋白質(zhì)或其他有機(jī)分子，可用0.l1mol/L的的HNO3洗洗 510min，然后再按常規(guī)清洗。，然后再按常規(guī)清洗。兩次分析之間，可用運(yùn)行緩沖液清洗、平衡。兩次分析之間，可用運(yùn)行緩沖液清洗、平衡。 毛細(xì)管通道十分細(xì)小，所需樣品不過數(shù)nl，所以不能采用色譜的進(jìn)樣方式。通過讓毛細(xì)管與樣品溶液直接接觸，然后由重力、電場力或其它動力來驅(qū)動樣品進(jìn)入管中。進(jìn)樣量可以通過控制驅(qū)動力的大小或時間長短來控制。進(jìn)樣系統(tǒng)必須包括動力控制、計時控制、電極槽或毛細(xì)管移位控制等機(jī)構(gòu)。 進(jìn)樣方式： 電動法 壓力法 擴(kuò)散

23、法當(dāng)把毛細(xì)管的進(jìn)樣端插入樣品溶液并加上電場時，組分就會因電遷移和電滲作用而進(jìn)入管內(nèi)。電動進(jìn)樣的控制參數(shù)是電場強(qiáng)度E和進(jìn)樣時間t。電場強(qiáng)度E取值多在160kv/60cm 之間；進(jìn)樣時間通常在110s 之間，有時可達(dá)1min或更大。優(yōu)點(diǎn)：電動進(jìn)樣對毛細(xì)管內(nèi)的填充介質(zhì)沒有特殊限制，屬普適性方法，可實(shí)現(xiàn)自動化操作。缺點(diǎn)：電動進(jìn)樣對離子組分存在偏向，電遷移速度快的進(jìn)樣多，電遷移速度小的少進(jìn)甚至不進(jìn)，這會降低分析的準(zhǔn)確性和可靠性。也稱流動進(jìn)樣，它要求毛細(xì)管中的填充介質(zhì)具有流動性。當(dāng)毛細(xì)管兩端置于不同的壓力環(huán)境中時，管中溶液即能流動，將樣品帶入。可用三種方法產(chǎn)生進(jìn)樣動力：正壓、負(fù)壓（管尾抽吸）、重力（虹吸）。采用壓縮空氣（氣體鋼瓶）可實(shí)現(xiàn)正壓進(jìn)樣，并可與毛細(xì)管清洗系統(tǒng)共用，多為商品儀器采用。優(yōu)點(diǎn)：壓力