分子與基因工程實(shí)驗七

1、實(shí)驗七 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化目的及要求：目的及要求： 通過葉盤法將帶有報告基因的農(nóng)桿菌通過葉盤法將帶有報告基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入煙草中，誘導(dǎo)獲得轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)入煙草中，誘導(dǎo)獲得轉(zhuǎn)基因植株。 了解農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的原理，掌握農(nóng)了解農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的原理，掌握農(nóng)桿菌的培養(yǎng)和侵染植物的方法。桿菌的培養(yǎng)和侵染植物的方法。二、實(shí)驗原理二、實(shí)驗原理 農(nóng)桿菌重組子中攜帶經(jīng)改造的農(nóng)桿菌重組子中攜帶經(jīng)改造的Ti 質(zhì)粒（含有幫助質(zhì)粒（含有幫助T-DNA跳到植物染色跳到植物染色體上的體上的Vir 區(qū)）和包含區(qū)）和包含T-DNA的雙元載體的雙元載體pBinGUS，質(zhì)粒，質(zhì)粒pBinGUS上上T-DNA上插入了報告基因（上插入

2、了報告基因（GUS）和卡那霉素篩選標(biāo)記基因）和卡那霉素篩選標(biāo)記基因NPTII。 葉盤法轉(zhuǎn)化是通過人為在煙草葉片上產(chǎn)生傷口，侵染時農(nóng)桿菌吸附于植葉盤法轉(zhuǎn)化是通過人為在煙草葉片上產(chǎn)生傷口，侵染時農(nóng)桿菌吸附于植物的表面?zhèn)诓课?，受傷后雙子葉植物分泌的酚類化合物透過農(nóng)桿菌的細(xì)物的表面?zhèn)诓课?，受傷后雙子葉植物分泌的酚類化合物透過農(nóng)桿菌的細(xì)胞膜，活化胞膜，活化vir區(qū)基因，區(qū)基因，vir區(qū)基因的活化，促使區(qū)基因的活化，促使T-DNA進(jìn)行加工和轉(zhuǎn)移。進(jìn)行加工和轉(zhuǎn)移。T-DNA進(jìn)入植物細(xì)胞后整合到核進(jìn)入植物細(xì)胞后整合到核DNA上。共培養(yǎng)可使上。共培養(yǎng)可使T-DNA上攜帶的編上攜帶的編碼抗生素的抗性基因得到表

3、達(dá)，因此，轉(zhuǎn)化了的煙草外植體可在含有相應(yīng)碼抗生素的抗性基因得到表達(dá)，因此，轉(zhuǎn)化了的煙草外植體可在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上生長?？股氐呐囵B(yǎng)基上生長。植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng) 指用于轉(zhuǎn)化的外植體通過組織培養(yǎng)途徑或其他非組織培養(yǎng)途徑，能高效、穩(wěn)定地再生無性系，并能接受外源DNA整合，對轉(zhuǎn)化選擇抗生素敏感的再生系統(tǒng)。 具備條件：（1）高效穩(wěn)定的再生能力（2）較高的遺傳穩(wěn)定性（3）具有穩(wěn)定的外植體來源（4）對選擇性抗生素敏感（5）對農(nóng)桿菌侵染有敏感性外植體的種類 葉片、葉柄、子葉、子葉柄 莖、花莖、塊莖、莖尖分生組織 根 合子胚 成熟種子葉盤法轉(zhuǎn)化 雙子葉植物雙子葉植物 以葉片作為外植體，在葉片上產(chǎn)生傷口

4、，侵染時農(nóng)桿菌吸附于植物的表面?zhèn)谝匀~片作為外植體，在葉片上產(chǎn)生傷口，侵染時農(nóng)桿菌吸附于植物的表面?zhèn)诓课徊课? 受傷后雙子葉植物分泌的酚類化合物透過農(nóng)桿菌的細(xì)胞膜，活化受傷后雙子葉植物分泌的酚類化合物透過農(nóng)桿菌的細(xì)胞膜，活化vir區(qū)基因，區(qū)基因，vir區(qū)基因的活化，促使區(qū)基因的活化，促使T-DNA進(jìn)行加工和轉(zhuǎn)移。進(jìn)行加工和轉(zhuǎn)移。T-DNA進(jìn)入植物細(xì)胞后整合進(jìn)入植物細(xì)胞后整合到核到核DNA上。上。 農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng) 接種菌體后的外植體培養(yǎng)在誘導(dǎo)愈傷組織的固體培養(yǎng)基上，在外植體細(xì)胞分裂、生長的同時，農(nóng)桿菌在外植體切口面也增殖生長，該兩者共同培養(yǎng)過程稱之為共培養(yǎng)。 是整個轉(zhuǎn)化過程中非常重要的環(huán)

5、節(jié)。因為農(nóng)桿菌吸附，T-DNA的轉(zhuǎn)移及整合都在這共培養(yǎng)時期內(nèi)完成。Events An event is the insertion of a particular transgene into a specific location on a chromosome.Conceptions Transformation frequency Independent transgenic plants/inoculated immature embryo or callus. Line The seedlings from one transgenic cell, namely, one indep

6、endent successfully transformation event, belong to one line, also are called clones. Generation These transgenic seedlings are T0 generation seedlings, T0 generation mature seeds are T1 generationMeiosis or pollination is the boundary of different generations. 實(shí)驗儀器、材料和試劑儀器：超凈工作臺，培養(yǎng)箱，臺式離心機(jī)，培養(yǎng)皿，加樣器儀器

7、：超凈工作臺，培養(yǎng)箱，臺式離心機(jī)，培養(yǎng)皿，加樣器 及吸頭，無菌濾紙；及吸頭，無菌濾紙；材料：攜帶質(zhì)粒植物表達(dá)材料：攜帶質(zhì)粒植物表達(dá)(pBI121)載體土壤農(nóng)桿菌載體土壤農(nóng)桿菌LBA4404 煙草無菌苗煙草無菌苗試劑：試劑： YEB液體培養(yǎng)基（液體培養(yǎng)基（1升）：升）： 酵母提取物酵母提取物1g，牛肉膏，牛肉膏5g，蛋白胨，蛋白胨5g，蔗糖，蔗糖5g， MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0 MS鹽：鹽： MS大量元素、微量元素、大量元素、微量元素、pH7.0； MS基本培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基： MS大量元素、微量元素、有機(jī)物，大量元素、微量元素、有機(jī)物， 3%蔗糖，蔗糖，0.8 %瓊脂，瓊脂

8、，pH5.8；實(shí)驗步驟實(shí)驗步驟1. 從平板上挑取含有pBI121的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落，接種于50ml YEB液體培養(yǎng)液(含有100mg/L Kan和125mg/L Sm)中，28C振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8；2. 4000rpm，室溫離心10分鐘，倒掉上清.3. 用MS鹽溶液（pH7.0）重新懸浮菌體，侵染時采用MS鹽溶液稀釋至原體積的20-50倍。4. 在超凈臺上從煙草無菌苗上切下葉片,切去邊緣和主要葉脈，切成0.40.6cm2大?。?. 侵染：將切好的外植體在農(nóng)桿菌菌液中浸泡10分鐘，取出外植體置于無菌濾紙上吸去材料表面的菌液。6. 共培養(yǎng)，將侵染過的外植體接種在上鋪一層

9、濾紙的MS基本培養(yǎng)基，28C暗培養(yǎng)三天。7 . 外 植 體 暗 培 養(yǎng) 三 天 后 ， 轉(zhuǎn) 到 含 有 抗 生 素 的 分 化 培 養(yǎng) 基 （ M S + 3 m g / L 6 -BA+0.2mg/L NAA+ Kan 100mg/L + Cb 500mg/L）上，在光照為2000-10000lx，25C條件下進(jìn)行選擇培養(yǎng)。8. 三天觀察一次，發(fā)現(xiàn)污染，立刻轉(zhuǎn)入新的相同培養(yǎng)基中注意事項1煙草無菌苗上切下葉片后，注意迅速蓋好封口膜。煙草無菌苗上切下葉片后，注意迅速蓋好封口膜。2嚴(yán)格控制葉盤在農(nóng)桿菌菌液中的浸泡時間。嚴(yán)格控制葉盤在農(nóng)桿菌菌液中的浸泡時間。3避免外植體于無菌濾紙上過于干燥。避免外植

10、體于無菌濾紙上過于干燥。思考題思考題1培養(yǎng)農(nóng)桿菌培養(yǎng)農(nóng)桿菌LBA4404時加時加Sm的作用是什么？的作用是什么？2暗培養(yǎng)時培養(yǎng)基中是否要加抗生素？為什么？暗培養(yǎng)時培養(yǎng)基中是否要加抗生素？為什么？外植體的種類 葉片、葉柄、子葉、子葉柄 莖、花莖、塊莖、莖尖分生組織 根 合子胚 成熟種子 Transformation frequency Independent transgenic plants/inoculated immature embryo or callus. Line The seedlings from one transgenic cell, namely, one independent successfully transformation event, belong to one line, also are called clones. Generation These transgenic seedlings are T0 generation seedlings, T0 generation mature seeds are T1 generationMeiosis or pollin