HIV-1病毒載量檢測(cè)及質(zhì)量保證指南解讀

1、HIV-1病毒載量檢測(cè)及質(zhì)量保證指南本指南由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心艾滋病參比實(shí)驗(yàn)室組織有 關(guān)專家撰寫，由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心批準(zhǔn)執(zhí)行。編寫主持人：蔣巖編寫人員：潘品良蔣巖李敬云鐘平尚紅李太生審核咨詢專家及技術(shù)人員：邵一鳴康來儀朱效科王佑春汪寧朱紅郭志宏季陽(yáng)劉海林肖瑤邱茂鋒馬春濤編寫單位：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心參編單位：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 上海市疾病預(yù)防控制中心 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)北京協(xié)和醫(yī)院技術(shù)顧問：Mike Ussery, Hao Zhang美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院 過敏及傳染病研究所James W. Bremer美國(guó)Rush大學(xué)醫(yī)學(xué)中心VQA實(shí)驗(yàn)室Tr

2、ever Peter克林頓基金中國(guó)艾滋病防治項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)室專家Don aid J. Brambilla美國(guó)華盛頓大學(xué)新英格蘭研究所Fran cis F. Mandy加拿大公共衛(wèi)生局疾病預(yù)防控制中心國(guó)家免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室隨著HIV-1病毒載量檢測(cè)在艾滋病臨床輔助診斷和抗病毒治療監(jiān)測(cè)以及艾滋病科研工 作中的廣泛應(yīng)用，我國(guó)開展該項(xiàng)檢測(cè)工作的實(shí)驗(yàn)室日益增多。自1997年艾滋病實(shí)驗(yàn)室首次引進(jìn)HIV-1病毒載量檢測(cè)技術(shù)，截至2007年底，全國(guó)已經(jīng)配備了近120臺(tái)HIV-1病毒載量 檢測(cè)儀，覆蓋了疾控、醫(yī)院、檢疫、軍隊(duì)等系統(tǒng)。目前，雖然許多實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)將病毒載量檢 測(cè)納入艾滋病相關(guān)輔助診斷和治療監(jiān)測(cè)工作，但大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室

3、開展工作的時(shí)間較短，經(jīng)驗(yàn)不 足，因此，急需加強(qiáng)該領(lǐng)域的培訓(xùn)和質(zhì)量控制工作，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。為了加強(qiáng)質(zhì)控和保證檢測(cè)質(zhì)量，并得到國(guó)際上的認(rèn)可，艾滋病參比實(shí)驗(yàn)室2004年開始參加美國(guó)NIH組織的HIV-1病毒載量檢測(cè)能力驗(yàn)證工作。在通過考核和積累經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上， 2005年啟動(dòng)了國(guó)內(nèi)HIV-1病毒載量檢測(cè)能力驗(yàn)證工作。在積極組織實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證的同時(shí)， 艾滋病參比實(shí)驗(yàn)室也對(duì)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員進(jìn)行培訓(xùn)，積極開展室內(nèi)質(zhì)控。這些工作對(duì)提高HIV-1病毒載量的檢測(cè)技術(shù)，保證質(zhì)量起到了重要作用。為了進(jìn)一步規(guī)范艾滋病實(shí)驗(yàn)室 HIV-1病毒 載量檢測(cè)，建立標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)量控制程序，準(zhǔn)確開展各項(xiàng)檢測(cè)及質(zhì)量控制工作

4、，特制定本指南。本指南是根據(jù)各種HIV-1病毒載量檢測(cè)方法的技術(shù)要求，結(jié)合現(xiàn)行的國(guó)內(nèi)外相關(guān)技術(shù)規(guī) 范而制定。本指南針對(duì)HIV-1病毒載量檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)置、樣品管理、檢測(cè)技術(shù)、質(zhì)量控制、 生物安全等方面提出指導(dǎo)。本指南自2006年初正式開始編寫，性病艾滋病預(yù)防控制中心多次組織了有國(guó)內(nèi)外專家 參加的指南編寫專項(xiàng)技術(shù)咨詢會(huì)， 與會(huì)專家對(duì)指南提出了很多建設(shè)性意見和建議，美國(guó)NIH病毒載量檢測(cè)質(zhì)量保證實(shí)驗(yàn)室專家多次對(duì)指南進(jìn)行認(rèn)真的審閱和具體指導(dǎo)。指南編寫過程 中，也認(rèn)真聽取了實(shí)驗(yàn)室一線檢測(cè)人員的具體需求和建議，并補(bǔ)充了大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，包括 HIV-1病毒載量檢測(cè)值的穩(wěn)定性、凍融影響實(shí)驗(yàn)與不同檢測(cè)方法之間

5、比較的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)等。在 此基礎(chǔ)上，經(jīng)過多次修訂、補(bǔ)充和審定，于 2007年11月完成HIV-1病毒載量檢測(cè)及質(zhì)量 保證指南的最后定稿。由于國(guó)內(nèi)外還沒有可作為參考的 HIV-1病毒載量檢測(cè)及質(zhì)量控制的相關(guān)指南，因此本指 南主要提出一些原則上的參考建議，其中定有不妥之處，希望廣大同仁提出意見，以便不斷 完善。在本指南的編寫過程中，世界衛(wèi)生組織、克林頓基金中國(guó)艾滋病防治項(xiàng)目和美國(guó)NIH等國(guó)際組織與機(jī)構(gòu)給予了大力支持，全國(guó)HIV-1病毒載量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室一線操作人員提出了許多建設(shè)性的意見和具體需求，艾滋病參比實(shí)驗(yàn)室工作人員毛瑋、陶曉霞進(jìn)行了大量的補(bǔ) 充實(shí)驗(yàn)和文字編輯工作，才保證本指南的編寫順利完成，在此一并

6、向他們表示真誠(chéng)的感謝。中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心主任吳尊友研究員在本指南編寫過程 中提出了重要的修改意見，在此特別致謝。HIV-1病毒載量檢測(cè)及質(zhì)量保證指南（目錄2007 版）第一章總則第二章實(shí)驗(yàn)室設(shè)置第三章 樣品的采集、處理、保存、運(yùn)輸?shù)谒恼?常用HIV-1病毒載量檢測(cè)方法簡(jiǎn)介第五章 室內(nèi)質(zhì)量控制第六章外部質(zhì)量控制第七章實(shí)驗(yàn)室生物安全附表1常見問題分析和處理附表2 HIV-1病毒載量檢測(cè)樣品送檢及接收單附表3 HIV-1病毒載量檢測(cè)能力驗(yàn)證樣品接收專用單附表4 HIV-1病毒載量檢測(cè)報(bào)告單附表5 HIV-1病毒載量能力驗(yàn)證結(jié)果專用報(bào)告單（NASBA） 附表6 HIV-1病毒載

7、量能力驗(yàn)證結(jié)果專用報(bào)告單（RT-PCR） 參考文獻(xiàn)縮略語(yǔ)3HIV-1病毒載量檢測(cè)及質(zhì)量保證指南第一章 總則1.1意義HIV-1病毒載量是艾滋病防治工作中一項(xiàng)重要的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)。檢測(cè)HIV-1病毒載量可以監(jiān)控和預(yù)測(cè)病程，指導(dǎo)艾滋病患者的抗病毒治療，包括確定治療時(shí)機(jī)、選擇治療方案、 評(píng)價(jià)治療效果；結(jié)合疾病臨床癥狀和其它實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，可作為早期感染診斷的輔助手段；還可 用于嬰兒早期感染的輔助診斷以及采供血機(jī)構(gòu)樣品的窗口期檢測(cè)。為了準(zhǔn)確地檢測(cè)HIV-1病毒載量，必須對(duì)開展HIV-1病毒載量檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行規(guī)范化管理和質(zhì)量控制，才能保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。1.2目的指導(dǎo)HIV-1病毒載量檢測(cè)工作，規(guī)

8、范實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制與管理。1.3適用范圍適用于我國(guó)開展HIV-1病毒載量檢測(cè)工作的所有實(shí)驗(yàn)室。4HIV-1病毒載量檢測(cè)及質(zhì)量保證指南第二章實(shí)驗(yàn)室設(shè)置各種HIV-1病毒載量檢測(cè)方法需要相應(yīng)的輔助設(shè)備才能完成檢測(cè)。 以下為HIV-1病毒載 量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室不同分區(qū)內(nèi)必備的輔助設(shè)備及耗材。2.1樣品處理區(qū)：2.1.1生物安全柜：二級(jí)2.1.2離心機(jī)（32000g,可離心1.5mL管子）2.1.3 冰箱：4°C, -20 °C, -80 C2.1.4水浴箱：準(zhǔn)確度小于0.5 C2.1.5加樣器1套（20卩L、200卩L、1000卩L）,為專用設(shè)備2.1.6有濾芯的一次性吸頭（無 DNA和

9、RNAW）2.1.7計(jì)時(shí)器2.1.8旋渦振蕩器：震動(dòng)頻率可調(diào)2.1.9 一次性工作服、帽、口罩、無粉手套、鞋套2.2試劑準(zhǔn)備區(qū)：2.2.1超凈工作臺(tái)（或密閉工作臺(tái)）2.2.2加樣器1套（20卩L、200卩L、1000卩L）,為專用設(shè)備2.2.3離心機(jī)（18000g,可離心1.5mL管子）2.2.4 冰箱：4C, -20C2.2.5計(jì)時(shí)器2.2.6旋渦振蕩器，震動(dòng)頻率可調(diào)2.2.7有濾芯的一次性吸頭（無 DNA、RNA酶）2.2.8 1.5mL管子（無DNA和RNA酶）和1.5mL試管架2.2.9 一次性工作服、帽、口罩、無粉手套、鞋套2.3擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)：2.3.1 HIV-1病毒載量檢測(cè)儀2

10、.3.2力卩樣器1套（20卩L、200卩L、1000卩L）2.3.3 冰箱：4C, -20C2.3.4 水浴箱（41C ）2.3.5旋渦振蕩器：震動(dòng)頻率可調(diào)2.3.6有濾芯的一次性吸頭（無DNA、RNA酶）2.3.7 一次性工作服、帽、口罩、無粉手套、鞋套2.4 HIV-1病毒載量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備分布示意圖HIV-1病毒載量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備分布示意圖病毒載量?jī)x，加樣 器冰 箱-204C紫外燈擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)水浴箱冰箱-80-20C樣品處理區(qū)紫外燈冰箱-204°C紫外燈試劑準(zhǔn)備區(qū)241總體原則：各區(qū)獨(dú)立、控制風(fēng)向、因地制宜、萬(wàn)便工作。具體來說：2.4.1.1各區(qū)必須是相互獨(dú)立的，有條件各區(qū)內(nèi)

11、可分別設(shè)置緩沖間，以保證不同區(qū)之間始終完全分隔開。2.4.1.2各區(qū)的儀器設(shè)備以及各種物品必須是專用的。2.4.1.3試劑準(zhǔn)備區(qū)和樣品處理區(qū)可保持低度正壓（或常壓）狀態(tài)，使空氣流向始終由室 內(nèi)向外，以避免擴(kuò)增污染物進(jìn)入此區(qū)域。2.4.1.4擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可保持低度負(fù)壓狀態(tài)，使空氣流向始終由室外向內(nèi)，以防止擴(kuò)增產(chǎn)物造成其他區(qū)域的交叉污染?？砂惭b排風(fēng)扇或其他排風(fēng)裝置。241.5擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可以設(shè)在遠(yuǎn)離其他各區(qū)的地方。241.6工作時(shí)必須遵循單一工作流向進(jìn)行，即工作流向只能從試劑準(zhǔn)備區(qū)開始，到樣 品處理區(qū)，然后再到擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。8HIV-1病毒載量檢測(cè)及質(zhì)量保證指南第三章樣品的采集、處理、保存和

12、運(yùn)輸樣品采集、處理、保存和運(yùn)輸，按照所使用檢測(cè)方法的要求嚴(yán)格執(zhí)行。用于HIV-1病毒載量檢測(cè)的樣品推薦采用抗凝血漿。3.1樣品的采集3.1.1采樣器材：一次性抗凝真空采血管、持針器、蝶形針等。3.1.2抗凝劑：通常采用EDTA（乙二胺四乙酸）或ACD（枸櫞酸鈉），并符合不同檢測(cè) 方法對(duì)樣品的要求。3.1.3樣品標(biāo)識(shí)：在采血管上貼對(duì)應(yīng)的樣品編號(hào)，并填寫HIV-1病毒載量檢測(cè)樣品送檢及接收單（附表2）。3.1.4樣品采集量：通常采集全血35ml,采集的樣品量應(yīng)盡可能與定量采血管的刻度一 致，采集量過多或不足，會(huì)造成血液凝固或被稀釋。3.1.5樣品的混勻：采集血液后，立即輕輕上下顛倒抗凝管約10次，

13、使血液與抗凝劑充分混勻。3.1.6獲取其它信息：包括采集對(duì)象的基本信息和流行病學(xué)資料，抗病毒藥物使用情況， 以往的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，在HIV-1病毒載量檢測(cè)樣品送檢及接收單（附表2）上備注欄注明。 3.2樣品的處理3.2.1 一般要求在采血后6小時(shí)內(nèi)進(jìn)行離心，室溫下800-1200xg離心10分鐘。3.2.2分離后，吸出血漿，分裝到無菌的聚丙烯螺口凍存管中，并注明分裝時(shí)間。在凍 存管上貼樣品編號(hào)。3.2.3血漿樣品不能滅活。3.2.4做好樣品處理記錄。3.3樣品的保存3.3.1保存條件：根據(jù)血漿檢測(cè)時(shí)間而定，4天內(nèi)可在4C暫時(shí)保存，3個(gè)月以內(nèi)應(yīng)凍存 于-20 C以下，3個(gè)月以上應(yīng)置于-70 C以

14、下。不推薦使用自動(dòng)除霜冰箱。3.3.2血漿樣品凍融不應(yīng)超過3次。3.3.3監(jiān)控并記錄保存溫度以及樣品狀態(tài)的變化。3.3.4防止樣品變質(zhì)、泄漏及污染。3.4樣品的運(yùn)輸根據(jù)可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定的要求 運(yùn)輸，并嚴(yán)格控制運(yùn)輸?shù)睦鋬鰻顟B(tài)，防止樣品凍融。3.5樣品的發(fā)送和接收3.5.1發(fā)送樣品時(shí)必須填寫樣品HIV-1病毒載量檢測(cè)樣品送檢及接收單（附表 2）。3.5.2接收樣品時(shí)，核對(duì)樣品數(shù)量，檢查樣品狀況，按HIV-1病毒載量檢測(cè)樣品送檢及接 收單（附表2）核對(duì)。3.5.3樣品管破損造成樣品溢出、出現(xiàn)明顯溶血、凝血的樣品，不宜作HIV-1病毒載量檢測(cè)；如果樣品已經(jīng)融化

15、，4C保存并盡快檢測(cè)，記錄凍融一次。10HIV-1病毒載量檢測(cè)及質(zhì)量保證指南第四章常用HIV-1病毒載量檢測(cè)方法簡(jiǎn)介目前常用的 HIV RNA測(cè)定方法為核酸序列依賴性擴(kuò)增（NASBA）技術(shù)，代表產(chǎn)品為NucliSens ECL及其升級(jí)產(chǎn)品熒光實(shí)時(shí) PCR技術(shù)NucliSens EasyQ 儀；逆轉(zhuǎn)錄 PCR系統(tǒng) （RT-PCR技術(shù)，代表產(chǎn)品為 AMPLICORIV-1 MONITORssay;分枝DNA言號(hào)放大系統(tǒng)（bDNA 技術(shù)，代表產(chǎn)品為bDNA340分析儀；實(shí)時(shí)熒光定量 PCRT增技術(shù)（real-time PCR，M2000 與國(guó)產(chǎn)試劑盒均屬此類技術(shù)。4. 1核酸序列依賴性擴(kuò)增（NASB

16、A）技術(shù)最早產(chǎn)品為NucliSens ECL定量RNA測(cè)定方法，最近被 NucliSens EasyQ新一代熒光實(shí)時(shí)定量PCR所取代。NASB/技術(shù)是一種等溫?cái)U(kuò)增系統(tǒng)，其擴(kuò)增基礎(chǔ)在于系統(tǒng)內(nèi)的混合酶系 統(tǒng)，此系統(tǒng)內(nèi)含有逆轉(zhuǎn)錄酶 AMV-RT和T7-DNA多聚酶在體外模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒體內(nèi)復(fù)制過程。此方法可分成四個(gè)步驟：核酸釋放、提取、擴(kuò)增和測(cè)定。擴(kuò)增后的產(chǎn)物使用NASBA QR電化學(xué)發(fā)光（ECL系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)和定量，此系統(tǒng)包括親和素標(biāo)記的磁珠、生物素標(biāo)記的核 苷酸片段（此片段可與新合成的RNA產(chǎn)物的一端互補(bǔ)結(jié)合）及可特異與四種產(chǎn)物結(jié)合的探針（探針上標(biāo)記有銣元素），這四種探針可分別與不同的 RNA產(chǎn)物結(jié)

17、合。將四種探針分別置于 不同的反應(yīng)管內(nèi)，在適當(dāng)?shù)臈l件下（410C）幾種成分將結(jié)合在一起，形成復(fù)合體。這些復(fù)合 體可在ECL讀數(shù)儀中被分別讀取銣元素的激發(fā)信號(hào)， 根據(jù)野生型病毒核酸測(cè)定值與其他三個(gè) 內(nèi)標(biāo)物測(cè)定值的比較可得到野生型病毒的拷貝數(shù)。Nuclisens EasyQ結(jié)合NASBA核酸序列基礎(chǔ)分析）技術(shù)與分子熒光探針技術(shù)（Molecular Beacon）檢測(cè)血漿中的 HIV RNA水平。這種結(jié)合的方法使用了實(shí)時(shí)擴(kuò)增分析（ real-time amplificatio n assay ），提高了對(duì)診斷質(zhì)量的要求。4. 2逆轉(zhuǎn)錄PCF系統(tǒng)技術(shù)目前用得最廣泛的儀器為 COBAS AMPLICO和

18、相應(yīng)的檢測(cè)試劑 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITORTM 1.版。聚合酶鏈反應(yīng)人類免疫缺陷病毒 HIV-1定量檢測(cè)試劑盒1.5版是在聚合酶鏈反應(yīng)全自動(dòng) 診斷儀上定量測(cè)定人血漿中人類免疫缺陷病毒I型（HIV-1） RNA水平的體外核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒。該檢測(cè)試劑盒可以通過兩種樣品處理程序進(jìn)行檢測(cè)，即標(biāo)準(zhǔn)的和超敏感的操作步驟，定量測(cè)定含量為50-750,000拷貝/毫升HIV-1 RNA。標(biāo)準(zhǔn)的樣品處理程序中，HIV-1 RNA通 過應(yīng)用裂解液裂解病毒顆粒從而直接從血漿中分離出來，然后用乙醇沉淀RNA采用超敏感 的制備方法，血漿中HIV-1病毒顆粒首先通過高速離心濃縮，然后用裂解

19、試劑裂解病毒顆粒。 再用乙醇沉淀RNACOBAS AMPLICOR HIV-1 MONITORS劑盒1.5版包括5個(gè)主要步驟：試劑準(zhǔn)備；樣品 制備；靶RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA用HIV-1特異互補(bǔ)引物進(jìn)行靶cDNA PC擴(kuò)增；通過比色 與探針結(jié)合的擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)定。HIV-1病毒RNA的定量檢測(cè)是采用HIV-1定量標(biāo)準(zhǔn)品來完成 的。HIV-1定量標(biāo)準(zhǔn)品是包括作為HIV-1靶RNA引物結(jié)合部位和HIV-1擴(kuò)增子單一探針結(jié)合 區(qū)的非感染性RNA轉(zhuǎn)錄物。將已知拷貝數(shù)的 HIV-1定量標(biāo)準(zhǔn)品加到每一個(gè)樣品中和 HIV-1 靶序列一起共同進(jìn)行樣品制備、逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增、雜交和檢測(cè)并和HIV-1靶序列一起

20、擴(kuò)增。 COBAMPLICOR分析儀根據(jù)HIV-1定量標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)據(jù)計(jì)算每一個(gè)樣品的 HIV-1 RNA勺含量。 該定量標(biāo)準(zhǔn)品補(bǔ)償了抑制因素的影響并且擴(kuò)增過程的質(zhì)控使每一個(gè)樣品的HIV- 1 RNA得以準(zhǔn)確定量。4. 3分枝DNA（bDNA技術(shù)分枝DNA«定技術(shù)基于其獨(dú)特的信號(hào)放大系統(tǒng)，即分枝DNA言號(hào)放大系統(tǒng)，這是一個(gè)人工合成的分枝DNA分枝DNA勺分枝可結(jié)合多個(gè)酶標(biāo)記物，從而將病毒的信號(hào)放大，以便進(jìn) 行檢測(cè)。此檢測(cè)系統(tǒng)不涉及核酸擴(kuò)增反應(yīng)。本方法定量系統(tǒng)中沒有內(nèi)標(biāo)記物，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置 一系列外部標(biāo)記，通過實(shí)驗(yàn)樣品反應(yīng)強(qiáng)度與外部標(biāo)記樣品強(qiáng)度的比較確定實(shí)驗(yàn)樣品的病毒拷 貝數(shù)。每一種bDNA

21、僉測(cè)都有各自的步驟或試劑。bDNA僉測(cè)通常包括以下步驟：（1）將患者血 清或血漿連同含有特異的合成寡聚核苷酸靶探針的裂解液加到微孔中；（2）孵育。此步驟可釋放病毒核酸，降解RNA酶或使DNA變性，然后靶探針結(jié)合到靶RNA或 DNA并固定在固相板 上; （3）冷卻洗板；（4）加信號(hào)放大探針（bDNA）到各孔內(nèi)；（5）孵育.此步驟使bDNA雜交 到靶探針的相應(yīng)部位；（6）冷卻洗板；（7 ）加標(biāo)記探針到各孔內(nèi)；（8）孵育，此步驟使酶標(biāo) 記的探針雜交到bDNA上; （9）冷卻洗板；（10）加化學(xué)發(fā)光底物到各孔中；（11）孵育，此 步驟讓酶和底物相互作用，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)。發(fā)射的光強(qiáng)以相對(duì)光量值（RLU

22、s）表示。產(chǎn)生的光強(qiáng)直接與各樣品中病毒 RNA或 DNA的載量成正比。各樣品中病毒核酸的含量由與樣品一 同處理的標(biāo)準(zhǔn)所制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獲得。4. 4實(shí)時(shí)（real-time ）熒光定量PCF擴(kuò)增實(shí)時(shí)熒光定量PCF技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí) 監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR®程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù) Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系。 利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)， 縱坐標(biāo)代表Ct值）。因此，只要獲得未知樣品的 Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線

23、上計(jì)算出該樣品的起始拷 貝數(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PC擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過程可分為：（1）樣品制備,抽提和濃縮目標(biāo)RNA分子, 并除去可能存在的抑制因子。（2）Real-time PCR檢測(cè)PCR勺產(chǎn)物使用熒光標(biāo)記的寡核苷酸 探針。檢測(cè)的原理基于熒光信號(hào)增長(zhǎng)曲線與循環(huán)數(shù)相關(guān)。（3） RT-PC反應(yīng)，病毒RNAU用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA然后通過DNA聚合酶對(duì)特定片段進(jìn)行擴(kuò)增。（4）擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)， 基于檢測(cè)閾值的設(shè)定，當(dāng)病毒載量高時(shí)，低循環(huán)數(shù)即能檢測(cè)到熒光信號(hào)，當(dāng)病毒載量低時(shí)， 高循環(huán)數(shù)時(shí)才能檢測(cè)到熒光。循環(huán)數(shù)與樣品載量成線性關(guān)系。利用標(biāo)準(zhǔn)品制作循環(huán)數(shù)與載量 的標(biāo)準(zhǔn)曲線就能對(duì)樣品載量進(jìn)行定量檢測(cè)。

24、13HIV-1病毒載量檢測(cè)及質(zhì)量保證指南第五章 室內(nèi)質(zhì)量控制內(nèi)部質(zhì)量控制是在良好實(shí)驗(yàn)室整體環(huán)境支持下，從樣品接收到發(fā)出報(bào)告整個(gè)過程每個(gè)環(huán) 節(jié)的管理過程，包括：（1）人員；（2）實(shí)驗(yàn)室分區(qū)和環(huán)境；（3）儀器；（4）檢測(cè)過程（試劑、 操作過程，質(zhì)控品使用）；（5）數(shù)據(jù)。5.1人員HIV-1病毒載量檢測(cè)人員分為檢驗(yàn)人、復(fù)核人、簽發(fā)人。5.1.1所有相關(guān)檢驗(yàn)人員需經(jīng)操作培訓(xùn)，能獨(dú)立熟練地操作，并經(jīng)考核合格，持證上崗。5.1.2復(fù)核人、簽發(fā)人應(yīng)具備對(duì)檢測(cè)過程進(jìn)行分析、解決問題的能力。5.2實(shí)驗(yàn)室分區(qū)和環(huán)境5.2.1實(shí)驗(yàn)室分區(qū)的功能HIV-1病毒載量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室原則上應(yīng)分為三個(gè)獨(dú)立工作區(qū)：試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣品處

25、理區(qū)、 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，并設(shè)在不同房間。不同檢測(cè)方法的分區(qū)功能和要求可有所不同。5.2.1.1試劑準(zhǔn)備區(qū)：擴(kuò)增試劑的配制、分裝和保存；5.2.1.2樣品處理區(qū)：樣品登記、分裝，核酸提取、保存和加樣；5.2.1.3擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)：產(chǎn)物擴(kuò)增的測(cè)定、結(jié)果分析、登記及報(bào)告。嚴(yán)格要求三區(qū)的空氣流向：從試劑準(zhǔn)備區(qū)到樣品處理區(qū)，然后到擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，不能 逆向流動(dòng)。實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置及輔助設(shè)備的具體要求參見第二章。5.2.2實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的要求5.2.2.1實(shí)驗(yàn)室有足夠的空間；5.2.2.2采光好，應(yīng)避免陽(yáng)光直射設(shè)備；5.2.2.3室溫控制在1825C；5.2.2.4室內(nèi)相對(duì)濕度控制在 5070%;5.2.2.5電源

26、穩(wěn)定，HIV-1病毒載量檢測(cè)儀應(yīng)配備穩(wěn)壓電源；5.2.2.6室內(nèi)保持干凈整潔，無灰塵。5.2.2.7實(shí)驗(yàn)前后，用75%乙醇或0.1%次氯酸鈉及時(shí)處理操作臺(tái)面。5.3儀器設(shè)備質(zhì)控5.3.1加樣器、溫濕度計(jì)須經(jīng)計(jì)量部門校準(zhǔn)，每年一次。每季度期間核查一次。5.3.2 HIV-1病毒載量檢測(cè)儀、離心機(jī)可以委托公司校準(zhǔn)，每年一次。5.3.3冰箱、水浴箱用校準(zhǔn)合格的溫度計(jì)測(cè)量溫度，并做好記錄。5.4檢測(cè)過程質(zhì)控541試劑質(zhì)控5.4.1.1所有試劑盒須嚴(yán)格按要求條件保存。5.4.1.2試劑盒拆封時(shí)，要記錄拆封時(shí)間，所有試劑嚴(yán)格控制在有效期內(nèi)使用。5.4.1.3使用經(jīng)中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)的試劑。5.4.

27、2實(shí)驗(yàn)用水：要求使用無 DNA和RNA酶的水。5.4.3操作過程質(zhì)控嚴(yán)格執(zhí)行儀器和試劑的標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP，不得擅自修改。5.4.4質(zhì)控品的使用每次實(shí)驗(yàn)需同時(shí)使用試劑盒內(nèi)的質(zhì)控品以及一個(gè)HIV-1 RNA為5000-15000拷貝/毫升的外部質(zhì)控品。5.4.4.1外部質(zhì)控品的制備按實(shí)際使用量的要求配制大樣品量的血漿（推薦每次配置量可使用兩年），用0.2卩m濾膜過濾除菌，充分混勻。用無菌凍存管定量分裝，標(biāo)記，封口，凍存于-80C以下非自動(dòng)除霜冰箱內(nèi)。5.4.4.2外部質(zhì)控品的定值隨機(jī)選出10管外部質(zhì)控品，按照實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)條件進(jìn)行HIV-1病毒載量檢測(cè)，將拷貝值換算成Log10值，計(jì)算算術(shù)平均值

28、（m）和標(biāo)準(zhǔn)偏差（s）。5.4.4.3質(zhì)控圖的繪制和使用根據(jù)外部質(zhì)控品的定值，繪制質(zhì)控圖。在質(zhì)控圖上顯示所有10次質(zhì)控品檢測(cè)值的Log10值、平均值以及1.5s值范圍。每次檢測(cè)都應(yīng)帶1個(gè)外部對(duì)照，將得到的外部對(duì)照Log10 值標(biāo)在質(zhì)控圖上，根據(jù)是否在1.5s值范圍判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否有效，每次測(cè)得值在平均值土1.5S內(nèi)方為有效。使用新批次的外部對(duì)照質(zhì)控品時(shí)，必須重新繪制質(zhì)控圖。5.4.5試劑盒質(zhì)控品的使用每次實(shí)驗(yàn)按照試劑盒說明書的要求使用試劑盒提供的質(zhì)控品，并滿足質(zhì)控品的要求。5.5數(shù)據(jù)分析、結(jié)果報(bào)告5.5.1在試劑盒及外部質(zhì)控品結(jié)果滿足要求的前提下，對(duì)樣品進(jìn)行分析。5.5.2外部質(zhì)控品不合格，樣

29、品需要重新檢測(cè)。5.5.3結(jié)果超過檢測(cè)上限的樣品應(yīng)稀釋以后重新檢測(cè)。5.5.4復(fù)核人對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行仔細(xì)復(fù)核并對(duì)結(jié)果提出結(jié)論、簽字。5.5.5簽發(fā)人對(duì)結(jié)果的結(jié)論進(jìn)行審核、分析、總結(jié)、簽字。5.5.6按不同方法的要求，以拷貝/毫升或國(guó)際單位/毫升為單位報(bào)告樣品的HIV-1病毒載量 值。16HIV-1病毒載量檢測(cè)及質(zhì)量保證指南第六章外部質(zhì)量控制HIV-1病毒載量檢測(cè)的外部質(zhì)量控制可以通過參加外部質(zhì)量評(píng)價(jià)，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比 性，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)誤差，改進(jìn)實(shí)驗(yàn)室工作，提高檢測(cè)質(zhì)量。艾滋病參比實(shí)驗(yàn)室自2004年開始參加由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH ）組織的HIV-1病毒載量檢測(cè)考核工作，考核盤有 5個(gè)樣品 組成

30、，分別考核實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的靈敏度、特異性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，通過將結(jié)果與國(guó)際上參與 考核的所有實(shí)驗(yàn)室結(jié)果進(jìn)行比對(duì)評(píng)估，給出綜合評(píng)估結(jié)果。通過參加考核，保證艾滋病參比 實(shí)驗(yàn)室的不同HIV-1病毒載量檢測(cè)系統(tǒng)的有效性。目前，艾滋病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室通過參加艾滋病參比實(shí)驗(yàn)室組織的HIV-1病毒載量檢測(cè)能力驗(yàn)證來實(shí)施外部質(zhì)量控制。6.1 HIV-1病毒載量檢測(cè)能力驗(yàn)證（PT）的組織艾滋病參比實(shí)驗(yàn)室為HIV-1病毒載量檢測(cè)能力驗(yàn)證（PT）的組織者，負(fù)責(zé)制定國(guó)內(nèi)HIV-1 病毒載量檢測(cè)能力驗(yàn)證的計(jì)劃并組織實(shí)施。建議國(guó)內(nèi)所有從事HIV-1病毒載量檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室參加該 PT項(xiàng)目，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)使用有 效試劑與實(shí)驗(yàn)樣品一起檢測(cè)，

31、填寫HIV-1病毒載量實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告單（附表4-6），上報(bào)艾滋病 參比實(shí)驗(yàn)室。鼓勵(lì)有條件的實(shí)驗(yàn)室參加國(guó)際組織的 PT活動(dòng)。6.2 HIV-1病毒載量檢測(cè)能力驗(yàn)證（PT）的實(shí)施6.2.1 PT樣品組成：每次5份。包括陰性、不同拷貝數(shù)的陽(yáng)性樣品。6.2.2 PT頻率：一年2次，分別為3月和9月。6.2.3 PT樣品的接收與保存：要求參加 PT的實(shí)驗(yàn)室收到考核樣品后，立即進(jìn)行核對(duì)、檢查，填寫HIV-1病毒載量檢測(cè)能力驗(yàn)證樣品接收專用單（附表3），3天內(nèi)將接收專用單傳回艾滋病參比實(shí)驗(yàn)室。如發(fā)現(xiàn)考核樣品缺失、量不足、空管等情況，及時(shí)書面回報(bào)，艾滋病 參比實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)補(bǔ)寄或更換。收到樣品后應(yīng)及時(shí)檢測(cè)或在-70

32、度以下保存。6.2.4 PT樣品的檢測(cè)：要求將考核樣品同實(shí)驗(yàn)室常規(guī)樣品一起檢測(cè)，由常規(guī)檢測(cè)人員進(jìn) 行，不應(yīng)作為特殊樣品處理。PT結(jié)果的報(bào)告和處理：參加 PT的實(shí)驗(yàn)室必須在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)（收到樣品 3個(gè)月 內(nèi)），用電子郵件報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并將 HIV-1病毒載量實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告單（附表4-6）和打印的18HIV-1病毒載量檢測(cè)及質(zhì)量保證指南儀器原始記錄一起上報(bào)給艾滋病參比實(shí)驗(yàn)室，后者將負(fù)責(zé)結(jié)果錄入和處理。626評(píng)分原則：沒有任何問題者為優(yōu)秀；出現(xiàn)6.2.6.1中的一條為良好；出現(xiàn)至少626.1 中的兩條或至少6.2.6.2中的一條為不合格。6.2.6.1次要問題:一個(gè)樣品結(jié)果在土 1.52.0S內(nèi)；一個(gè)

33、假陽(yáng)性；一個(gè)無效結(jié)果；一個(gè)抄寫錯(cuò)誤6.2.6.2主要問題：兩個(gè)樣品結(jié)果超過土 2.0S；兩個(gè)及以上假陽(yáng)性；兩個(gè)及以上無效結(jié)果；兩個(gè)及以上抄寫錯(cuò)誤。6.2.7評(píng)估結(jié)果反饋：艾滋病參比實(shí)驗(yàn)室根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室的兩次考核結(jié)果，每年反饋?zhàn)詈?的評(píng)估結(jié)果。6.2.8抱怨和申訴：參評(píng)實(shí)驗(yàn)室如對(duì)評(píng)估結(jié)果或其它方面存有異議，可以在收到結(jié)果后 10天內(nèi)向艾滋病參比實(shí)驗(yàn)室提出異議，后者在核實(shí)情況后予以答復(fù)。6.2.9現(xiàn)場(chǎng)督導(dǎo)：根據(jù)考核情況的需要，艾滋病參比實(shí)驗(yàn)室組成技術(shù)專家組對(duì)不合格實(shí) 驗(yàn)室進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢查。檢查內(nèi)容包括：實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)、實(shí)驗(yàn)室布局、儀器運(yùn)行狀況、輔助設(shè)備 校準(zhǔn)狀況、實(shí)驗(yàn)耗材質(zhì)量、樣品保存、試劑盒使用狀態(tài)、人

34、員培訓(xùn)狀況、質(zhì)量保證和質(zhì)量控 制等。19HIV-1病毒載量檢測(cè)及質(zhì)量保證指南第七章實(shí)驗(yàn)室生物安全7.1相關(guān)依據(jù)病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例、實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求、可感染人類的 高致病性病原微生物菌（毒）種或樣品運(yùn)輸管理規(guī)定、人間傳染的高致病性病原微生物實(shí) 驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)活動(dòng)生物安全審批管理辦法和全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范。7.2安全細(xì)則721進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室應(yīng)穿工作服、戴口罩、戴一次性乳膠手套。嚴(yán)禁在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)食、飲 水和吸煙以及使用化妝品。7.2.2所有樣品包括試劑盒中的人源性成份（如陰、陽(yáng)性對(duì)照）都應(yīng)在生物安全柜內(nèi)進(jìn) 行處理。7.2.3樣品應(yīng)盛裝在有螺旋蓋的管子中，以防樣品濺出或產(chǎn)生交叉污染。當(dāng)具

35、有潛在傳 染性的物質(zhì)溢出時(shí)，立即用0.1%次氯酸鈉溶液或其它消毒劑處理污染區(qū)及器材；接觸過標(biāo) 本的器材應(yīng)置有專用消毒劑的容器，與一次性物品一起在丟棄前進(jìn)行高壓滅菌處理。7.2.4避免試劑盒中各種有毒有害化學(xué)成分（如疊氮鈉、二甲基亞砜、異硫氰酸胍）對(duì) 人體或環(huán)境可能造成的危害。7.3生物安全培訓(xùn)7.3.1所有涉及HIV-1病毒載量檢測(cè)的人員都應(yīng)經(jīng)過嚴(yán)格的技術(shù)培訓(xùn)，要掌握生物安全 保障的原則、措施。每個(gè)人的安全教育均應(yīng)記錄在實(shí)驗(yàn)室和人事檔案中。7.3.2省級(jí)及以上疾控中心艾滋病實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé) HIV/AIDS檢測(cè)生物安全培訓(xùn)及HIV-1病 毒載量檢測(cè)培訓(xùn)。7.3.3檢測(cè)相關(guān)人員應(yīng)主動(dòng)接受實(shí)驗(yàn)室生物安全

36、員以及安全負(fù)責(zé)人的監(jiān)督。所有實(shí)驗(yàn)室意外事件均應(yīng)進(jìn)行記錄和報(bào)告。7.3.4所有人員要保護(hù)自身和環(huán)境的安全。7.3.5參照實(shí)驗(yàn)室安全指南和標(biāo)準(zhǔn)操作程序的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行具體操作。7.4職業(yè)暴露處理7.4.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立完善的艾滋病職業(yè)暴露后的預(yù)防機(jī)制。7.4.2發(fā)生職業(yè)暴露后，首先進(jìn)行應(yīng)急處理，然后根據(jù)暴露級(jí)別和暴露源頭嚴(yán)重程度， 評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，并決定是否進(jìn)行預(yù)防性用藥和用藥程序，如需要時(shí)，盡早開始服用抗病毒 藥物。743按規(guī)定進(jìn)行職業(yè)暴露登記、檢測(cè)和報(bào)告，注意做好保密工作。21HIV-1病毒載量檢測(cè)及質(zhì)量保證指南附表1常見問題分析(一) NASBA問題原因處理方法血清或血漿樣品 中有特殊物質(zhì)化凍緩慢

37、引起的細(xì)胞裂解離心至上清清亮硅膠難以重新懸 浮樣品中核酸水平太高劇烈震蕩混懸，由于洗滌/洗脫效率不高可影 響敏感度。樣品最多帶有相當(dāng)于106個(gè)細(xì)胞 的 DNA。硅膠干燥不佳丙酮剩余太多用100-1000卩槍頭吸干凈干燥溫度太低干燥時(shí)間最多延長(zhǎng)2分鐘檢查加熱模塊的溫度加入硅膠的樣品 離心后難以溶解硅膠孵育時(shí)間太長(zhǎng)(> 12mi n)增加震蕩時(shí)間和強(qiáng)度無效結(jié)果；信號(hào)太低酶未完全溶解保證酶稀釋和使用前平衡至室溫，充分溶解 并在一小時(shí)內(nèi)使用磁珠未充分混勻或加入的 量太少每次加入前先震蕩混勻，保證磁珠快速沉在 管底樣品濃度太高檢查檢測(cè)稀釋液、樣品及已稀釋樣品加入的 量擴(kuò)增時(shí)溫度偏差調(diào)整加熱溫度，應(yīng)

38、該在41 ±0.5 °.(二) RT-PCR問題原因處理方法QS_無效(QSNVALID )QS稀釋系列的A660數(shù)值未 在檢測(cè)的吸光度范圍內(nèi)。該樣品檢測(cè)的結(jié)果無效。結(jié)果無效的樣品 應(yīng)從樣品和質(zhì)控的制備開始重新進(jìn)行逆轉(zhuǎn) 錄、擴(kuò)增和檢測(cè)。靶序列吸光度偏 低(TARGETOD LO)所有HIV-1的稀釋度的A660 數(shù)值低于檢測(cè)的線性范圍。報(bào)告結(jié)果根據(jù)所米取的標(biāo)準(zhǔn)的或極度敏感 的提取方法可以是“ HIV-1 RNA沒有檢測(cè) 到(HIV-1 RNA低于400拷貝/毫升)”或“ HIV-1 RNA沒有檢測(cè)到(低于50拷貝/ 毫升)”靶序列吸光度偏 高(TARGETOD HI)所有H

39、IV-1的稀釋度的A660 數(shù)值咼于檢測(cè)的線性范圍。報(bào)告結(jié)果形式為“不能確定”。(1)如果米 用標(biāo)準(zhǔn)樣品處理程序，用HIV陰性的人血 漿稀釋原始樣品并用標(biāo)準(zhǔn)的樣品處理程序 重新檢測(cè)。報(bào)告的結(jié)果應(yīng)乘以稀釋因子。(2)如果采用極度敏感的樣品處理程序， 稀釋原始血漿樣品，用標(biāo)準(zhǔn)的樣品處理程 序重新檢測(cè)。報(bào)告的結(jié)果應(yīng)乘以稀釋因子。結(jié)果偏低(RESULT_LO)計(jì)算的拷貝數(shù)低于測(cè)疋下 限。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的樣品處理程序，結(jié)果可以報(bào)告 為“檢測(cè)到HIV-1 RNA,含量低于400拷 貝/毫升”。如果需要定量的結(jié)果，原始樣 品應(yīng)該使用極度敏感的樣品處理程序重新 檢測(cè)。對(duì)于極度敏感的樣品處理程序，可以報(bào)告為“檢測(cè)到H

40、IV-1 RNA,含量低于 50拷貝/毫升”。結(jié)果偏咼(RESULT_HI)計(jì)算的拷貝數(shù)高于測(cè)定上 限。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的樣品處理程序，結(jié)果可以 報(bào)告為“ HIV-1 RNA含量高于7.5105拷 貝/毫升”。如果需要定量的結(jié)果，原始樣 品可以用HIV-1陰性的人血漿稀釋并重新 檢測(cè)。報(bào)告的結(jié)果應(yīng)乘以稀釋因子。對(duì)于 極度敏感的樣品處理程序，重新檢測(cè)。對(duì) 于極度敏感的樣品處理程序，結(jié)果可以報(bào) 告為“ HIV-1 RNA含量高于1.0燈05拷貝/ 毫升” o如果需要定量的結(jié)果，稀釋原始樣 品用標(biāo)準(zhǔn)的樣品處理程序重新檢測(cè)。TARG_GANGE所有靶模板的 A660數(shù)值都 不在線性測(cè)定范圍之內(nèi)。可以報(bào)告為“未

41、檢出?！敝匦聶z測(cè)原始樣品， 重復(fù)樣品和質(zhì)控制備、逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和檢 測(cè)步驟。OD_SEQUENCE提示有不合乎稀釋順序的A660值出現(xiàn)。重復(fù)整個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟包括樣品和質(zhì)控的制 備、擴(kuò)增和檢測(cè)。QS_SEQUENCE提示QS有不合乎稀釋順序 的A660值出現(xiàn)。重復(fù)整個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟包括樣品和質(zhì)控的制 備、擴(kuò)增和檢測(cè)。(三)Easy Q問題原因處理方法分子信標(biāo)沒有檢測(cè)絕對(duì)信號(hào)水平太低用洗脫液重新檢測(cè)Q值設(shè)定（q大 小 ）的大小不 同于WT值設(shè)定（WT大?。?的大小內(nèi)參照數(shù)據(jù)設(shè)定的大小不 同于WT數(shù)據(jù)設(shè)定的大小重新設(shè)定內(nèi)參照數(shù)據(jù)測(cè)定的曲線不連 續(xù)所測(cè)定曲線不連續(xù)性用洗脫液重新檢測(cè)沒有擴(kuò)增內(nèi)參照和WT最大/最小信

42、 號(hào)的比值都低于閾值用洗脫液或者樣品再開始測(cè)擴(kuò)增弱曲線斜率太低:用洗脫液重新檢測(cè)計(jì)算錯(cuò)誤曲線擬合程序產(chǎn)生錯(cuò)誤用洗脫液重新檢測(cè)不正確的擴(kuò)增動(dòng) 力學(xué)擬合曲線沒有正確地描述 所觀察的數(shù)據(jù)用洗脫液重新檢測(cè)延遲時(shí)間太短起始熒光增加的速度太快用洗脫液重新檢測(cè)。確信加入酶和開始此輪 運(yùn)行之間的時(shí)間少于8分鐘。擴(kuò)增弱內(nèi)參照值和WT值都沒有達(dá) 到一個(gè)平臺(tái)值用洗脫液重新檢測(cè)沒有測(cè)到內(nèi)參 照。沒加內(nèi)參照或者沒有測(cè)到內(nèi)參照的信號(hào)，可 能是因?yàn)樵诤怂岬姆蛛x物 中沒有加內(nèi)參照或者WT的用（稀釋過的）樣品重新檢測(cè)樣品的加入水平 太高加入太高（四）bDNA問題原因處理方法注射器含有氣 泡洗液瓶，水瓶，漂白液瓶是 空的或管道連

43、接松弛。加適量的溶液在空瓶里；管路都在各自的瓶 內(nèi)液面下。分析儀底部的 加熱托盤上有 液體管路連接松弛或一洗頭的 分液或吸液針管堵塞。檢查管路連接。管路有堵塞或 細(xì)菌滋生管路和試劑瓶沒有正確保 養(yǎng)。每次實(shí)驗(yàn)后清洗并晾干洗液瓶和水瓶，倒空 廢液瓶；每周清洗洗液瓶，水瓶和廢液瓶， 管路系統(tǒng)。分析儀不能從 孔內(nèi)吸取足夠 的液體洗頭中有堵塞，洗頭針頭彎 曲，廢液管連接松弛，吸液 泵損壞。檢查廢液管連接頭RLU值低試劑漏掉，用錯(cuò)試劑，某種 試劑配制錯(cuò)誤，漂白液污 染，孵育時(shí)間或溫度不正 確,或檢測(cè)板冷卻不足。 在實(shí)驗(yàn)前確定盛水試劑瓶 已滿。確定按產(chǎn)品要求儲(chǔ)存、配制試劑；環(huán)境溫度 在18-30r;試劑盒沒

44、有過期；實(shí)驗(yàn)中所使 用的試劑來自同一批次；每周清洗過程中在 管道和試劑瓶中沒有殘留。RLU值高實(shí)驗(yàn)被污染，清洗不充分， 或有光泄露。確定全使用干凈的一次性無菌實(shí)驗(yàn)材料；使 用防氣溶膠的加樣槍頭；殘留的底物沒有倒 回原瓶；用70%乙醇定期擦洗微量加樣器； 盛洗液的試劑瓶?jī)?nèi)有足夠量的洗液；檢查分 液、吸液操作；每周進(jìn)行保養(yǎng)；分析倉(cāng)門關(guān) 閉嚴(yán)實(shí)；檢查背景RLU值。變異系數(shù)（CV）高移液操作錯(cuò)誤，樣品質(zhì)量差， 孔有污染,清洗不充分，試 劑沒有預(yù)熱充分，試劑沒有 充分混勻，孔內(nèi)樣液蒸發(fā)， 孔內(nèi)樣液濺灑，有光漏。確定微量加樣器經(jīng)校準(zhǔn)；使用防氣溶膠的槍 頭；槍頭緊密套在加樣器上；加試劑時(shí)槍頭 位置在孔的中部

45、；樣品凝塊或殘?jiān)鼪]有被吸 ?。粯悠芳拥奈恢门c樣品ID和DMS規(guī)定的 位置一致；樣品按產(chǎn)品說明收集，處理和儲(chǔ) 存；只使用干凈的一次性無菌實(shí)驗(yàn)材料；檢 查分液吸液操作；盛洗液的試劑瓶?jī)?nèi)已裝有 足夠量的洗液；每種試劑在實(shí)驗(yàn)開始前被輕 輕混勻；每種試劑預(yù)熱充分，以防有沉淀；封 閉墊組裝正確；孔內(nèi)樣液沒有濺灑；分析倉(cāng) 門關(guān)閉嚴(yán)實(shí)；檢查RLU背景。標(biāo)準(zhǔn)曲線平坦 或不正常加標(biāo)準(zhǔn)時(shí)板的缺口在右邊， 或標(biāo)準(zhǔn)加入順序有誤。加標(biāo)準(zhǔn)時(shí)板的缺口在左邊強(qiáng)或弱對(duì)照定 量高強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照受污染，吸取誤 差,或標(biāo)準(zhǔn)曲線有冋題。確定各孔仔細(xì)加樣，未觸及鄰孔；使用無菌 槍頭；封閉墊組裝無誤；加樣器定期校準(zhǔn)； 使用防氣溶膠的槍頭；標(biāo)準(zhǔn)和

46、對(duì)照加樣位置正確；按產(chǎn)品說明要求儲(chǔ)存，配制。強(qiáng)或弱對(duì)照定 量低對(duì)照降解，對(duì)照濺灑，對(duì)照 孔液蒸發(fā)，對(duì)照加樣有誤， 或?qū)φ諞]有充分混勻。確定試劑盒在運(yùn)輸和到貨后儲(chǔ)存在正確的 溫度；使用無菌槍頭；沒有吸取氣泡；封閉 墊組裝無誤；加樣器經(jīng)校準(zhǔn)；小心處理測(cè)試 板，防止濺灑；標(biāo)準(zhǔn)和對(duì)照加樣位置正確；按 產(chǎn)品說明要求儲(chǔ)存，配制；樣品，標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)照在 吸取前至少震蕩5秒。附表2 HIV-1病毒載量檢測(cè)樣品送檢/接收單送檢單位送檢日期接收單位接收時(shí)間采樣時(shí)間采樣管抗凝劑樣品保存溫度樣品運(yùn)輸條件姓名性另y年齡職業(yè)國(guó)籍或民族戶籍所在地既往病史使用藥物抗HIV病毒藥 物樣品編號(hào)樣品性質(zhì)樣品量（ml）備注送樣人接收人附表3 HIV-1病毒載量檢測(cè)能力驗(yàn)證樣品接收專用單實(shí)驗(yàn)室名稱接收日期收到樣品量編號(hào)體積（ul）樣品狀態(tài)外包裝是否完整是口否匚1冰塊是否融化是口否樣品是否融化是口否計(jì)劃?rùn)z測(cè)日期檢測(cè)方法接收樣品后存放溫度4C 口 -20C | -80°C | | 其它匚|接收人實(shí)驗(yàn)室 負(fù)責(zé)人填表日期:附表4 HIV-1病毒載量檢測(cè)報(bào)告單送檢單位姓名性另y年齡國(guó)籍或民族職業(yè)戶籍所在地送檢日期送檢樣 品編號(hào)HIV-1病毒載量 (copies/ml)檢測(cè)人簽發(fā)人報(bào)告日期年 月曰復(fù)核人檢測(cè)單位或?qū)嶒?yàn)室（公章）備注1