CIRISPR背景介紹

1、CIRISPR背景介紹及其操作流程一、CIRISPR背景介紹CRISPR/Cas系統(tǒng)全稱為常間回文重復(fù)序列叢集 /常間回文重復(fù)序列叢集關(guān)聯(lián)蛋白系統(tǒng)（clustered regularly in terspaced short pali ndromic repeats/CRISPR-associatedprotei ns）。這一系統(tǒng)是源于細(xì)菌中的一種后天免疫系統(tǒng)（圖1）。該系統(tǒng)可以把侵入細(xì)菌的噬菌體遺傳物質(zhì)整合到自身基 因組一個或者多個CRISPR位點(diǎn)作為永久的 記憶”當(dāng)細(xì)菌被再次入侵的時候，CRISPR位點(diǎn)被轉(zhuǎn)錄生成 CRISPR RNAs （ crRNAs）。crRNA 隨后會引導(dǎo) DNA

2、剪切酶Cas9根據(jù)序列互補(bǔ)的原則剪切入侵的外源核酸序列，消滅外來遺傳物質(zhì)，發(fā)揮保護(hù)功能（圖2）。簡而言之，源于CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)被 工程化為一段介導(dǎo)定位作用的 RNA序列（guide RNA 和crRNA合二為一的雜 合RNA序列，稱為sgRNA）加上一個DNA水解酶Cas9組成的二元系統(tǒng)。圖1 CRISPR/Cas系統(tǒng)來源于細(xì)菌的“免疫系統(tǒng)”3. interference圖2細(xì)菌利用CRISPR/Cas 系統(tǒng)攻擊噬菌體入侵示意圖。COD1* Adaptation2. crRNA研究者把這一系統(tǒng)工程化成可以用于編輯哺乳動物細(xì)胞的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)。具體包括適于

3、哺乳動物表達(dá)的 Cas9基因和定位作用的sgRNA （圖3） 方便起見，研究者把這兩者放在了一個載體之中（all in one plasmid）。如果計劃利用這一系統(tǒng)編輯某個目的基因， 我們唯一要做的就是定制一條有效的 sgRNA。Cas9Genomic DNA飽血71曲#飾也伸MidiiiiiinnnTTTrTarget sequence /圖3工程化的CRISPR/Cas系統(tǒng)。該系統(tǒng)是個二元系統(tǒng)：負(fù)責(zé)切割的Cas9核酸酶和定位用的 guide RNA （ sgRNA ）。這一革命性的基因編輯技術(shù)極其強(qiáng)大，可以在一般的分子實驗室進(jìn)行基因的敲除（K0）、基因組片段的刪除、堿基位點(diǎn)矯正、大片段的

4、敲入（KI ）等操作。1、 CIRISPR操作流程1、建立基因敲除細(xì)胞系流程1.1確定基因名稱及其物種，選擇好合適的細(xì)胞系，優(yōu)先選擇較容易建系的細(xì)胞系;1.2 設(shè)計定制gRNA;1.3構(gòu)建可表達(dá)sgRNA和Cas9 載體，可以構(gòu)建瞬轉(zhuǎn)和各種病毒版本的載體;1.4 gRNA 表達(dá)載體切割活性檢測；1.5構(gòu)建KO細(xì)胞系2、基因組片段刪除流程1.1確定要刪除的片段，選擇好合適的細(xì)胞系，優(yōu)先選擇較容易建系的細(xì)胞系；1.2針對刪除片段兩段合適的位置各設(shè)計定制一條gRNA;1.3構(gòu)建可表達(dá)sgRNA和Cas9 載體，可以構(gòu)建瞬轉(zhuǎn)和各種病毒版本的載體;1.4 gRNA 表達(dá)載體切割活性檢測；1.5構(gòu)建片段刪除細(xì)胞系。3、堿基位點(diǎn)矯正流程1.1選擇好合適的細(xì)胞系，優(yōu)先選擇較容易建系的細(xì)胞系；1.2在需要矯正堿基位點(diǎn)或其附近設(shè)計定制gRNA;1.3設(shè)計合成Do nor模板；1.4構(gòu)建可表達(dá)sgRNA和Cas9 載體，可以構(gòu)建瞬轉(zhuǎn)和各種病毒版本的載體;1.5 gRNA 表達(dá)載體切割活性檢測；1.6構(gòu)建點(diǎn)矯正的細(xì)胞系。4、大片段敲入流程1.1選擇好合適的細(xì)胞系，優(yōu)先選擇較容易建系的細(xì)胞系；1.2在需要敲入的位點(diǎn)或其附近設(shè)計定制gRNA;1.3設(shè)計構(gòu)建同源重組模板載體；1.4構(gòu)建可表達(dá)sgRNA和Cas9 載