DNA測序儀的原理

1、DNAM序儀的原理原理：（一）雙脫氧鏈末端終止法測序原理（二）新生鏈的熒光標(biāo)記原理（三）熒光標(biāo)記DNA勺檢測原理（一）、Sanger等人：雙脫氧鏈末端終止法雙脫氧鏈末端終止法通過使用鏈終止劑一類似于正常dNTP的2' ,3'-雙脫氧核甘三磷酸（ddNTP）,將延伸的DNAJ特異性地終止。 其反應(yīng)體系也包括單鏈模板、引物、4種dNTP和DNA聚合酶。共分 四組，每組按一定比例加入一種（ddNTP）,它能隨機滲入合成的 DNA 鏈，一旦滲入合成即終止，于是各種不同大小片段的末端核甘酸必定 為該種核甘酸，可以從放射自顯影帶上直接閱讀 DNA勺核甘酸序列。與dNTP相比，ddNTP在脫

2、氧核糖的位置上缺少一個羥基，反應(yīng) 過程中雖然可以在DNAt合酶作用下，通過其磷酸基團與正在延伸的 DNA鏈的末端月氧核糖-OH發(fā)生反應(yīng)，形成磷酸二酯鍵而摻入到 DNA 鏈中，但它們本身沒有-OH,不能同后續(xù)的dNTP1成磷酸二酯鍵，從 而使正在延伸的DNAJ在此終止。據(jù)此原理分別設(shè)計四個反應(yīng)體系， 每一反應(yīng)體系中存在相同的DNA模板、引物、四種 dNTP和一種ddNTP側(cè)ddATP）,則新合成的DNAJ在可能摻入正常dNTP的位置者B 有可能摻入ddNTP而導(dǎo)致新合成鏈在不同的位置終止。由于存在 ddNTP與dNTP的競爭，生成的反應(yīng)產(chǎn)物是一系列長度不同的多核昔酸片段（二）、新生鏈的熒光標(biāo)記原

3、理多色熒光標(biāo)記法-熒光標(biāo)記引物法定義：將熒光染料預(yù)先標(biāo)記在測序反應(yīng)所用 引物的5'端一組（4種）熒光標(biāo)記引物，其序列相同，但標(biāo)記的熒光染料顏色不 同。多色熒光標(biāo)記法-熒光標(biāo)記終止底物法4種ddNT吩別用4種不同的熒光染料標(biāo)記，帶有熒光基團 的ddNT而摻入DN時段導(dǎo)致鏈延伸終止的同時，也使該片段端標(biāo)上了 一種特定的熒光染料根據(jù)熒光顏色的不同來判斷所代表 的不同堿基信息。（三）、熒光標(biāo)記DNA勺檢測原理測序反應(yīng)一般以單引物進行DN麋合酶延伸反應(yīng)，絕大多數(shù)產(chǎn)物均 為單鏈反應(yīng)結(jié)束后，樣品經(jīng)簡單純化處理就可以放置到自動測序儀中開 始電泳兩極間極高的電勢差推動著各個熒光 DN砧段在凝膠高分子聚合物中從負極向正級泳動并達到相互分離，且依次通過檢測窗口由激光器發(fā)出的極細光束，通過精密的光學(xué)系統(tǒng)被導(dǎo)向檢測區(qū)，在這里激光束以與凝膠垂直的角度激發(fā)熒光 DNA段DN的段上的熒光發(fā)色基團吸收了激光束提供的能量而發(fā)射出特征波長的熒光代表不同堿基信息的不同顏色熒光經(jīng)過光柵分光后再投射到CCD攝像機上同步成像。收集的熒光信號再傳輸給計算機加以處理整個電泳過程結(jié)束時在檢測區(qū)某一點上采集的所有熒光信號就轉(zhuǎn)化為一個以時間為橫軸坐標(biāo)，熒光波長