DNA多態(tài)性分型技術2013

1、第三節(jié)第三節(jié) DNA多態(tài)性分型技術多態(tài)性分型技術四川大學華西公共衛(wèi)生學院四川大學華西公共衛(wèi)生學院 汪川汪川什么是DNA多態(tài)性?多態(tài)性（多態(tài)性（polymorphism）是指在一個生物）是指在一個生物群體中，同時和經(jīng)常存在兩種或多種不連續(xù)群體中，同時和經(jīng)常存在兩種或多種不連續(xù)的變異型或基因型或等位基因，亦稱遺傳多的變異型或基因型或等位基因，亦稱遺傳多態(tài)性（態(tài)性（genetic polymorphism）或基因多態(tài)）或基因多態(tài)性。性。從本質上來講，多態(tài)性的產(chǎn)生在于基因水平從本質上來講，多態(tài)性的產(chǎn)生在于基因水平上的變異，一般發(fā)生在基因序列中不編碼蛋上的變異，一般發(fā)生在基因序列中不編碼蛋白的區(qū)域和沒有

2、重要調(diào)節(jié)功能的區(qū)域。白的區(qū)域和沒有重要調(diào)節(jié)功能的區(qū)域。DNA多態(tài)性對微生物有哪些實際意義？多態(tài)性對微生物有哪些實際意義？將導致將導致不同的細菌亞型不同的細菌亞型耐藥菌株出現(xiàn)耐藥菌株出現(xiàn)毒力變異株出現(xiàn)毒力變異株出現(xiàn)抗原漂移與抗原變異抗原漂移與抗原變異。在疾病預防控制中的應用在疾病預防控制中的應用同源性追蹤同源性追蹤細菌分型細菌分型傳染控制傳染控制DNA多態(tài)性分析常用的方法多態(tài)性分析常用的方法限制性片段長度多態(tài)性分析限制性片段長度多態(tài)性分析 隨機擴增多態(tài)性隨機擴增多態(tài)性DNA分析技術分析技術細菌基因組重復序列細菌基因組重復序列PCR技術技術擴增片段長度多態(tài)性分析技術（自學要考）擴增片段長度多態(tài)性分

3、析技術（自學要考） 脈沖場凝膠電泳脈沖場凝膠電泳。一、限制性片段長度多態(tài)性分析一、限制性片段長度多態(tài)性分析restriction fragment length polymorphism，RFLP 以以DNA-DNA雜交為基礎的第一代遺傳雜交為基礎的第一代遺傳標記，是限制性內(nèi)切酶、核酸電泳、印跡技標記，是限制性內(nèi)切酶、核酸電泳、印跡技術、探針術、探針-雜交技術的綜合應用雜交技術的綜合應用每種生物基因型具有其獨特的特征，及每種生物基因型具有其獨特的特征，及獨特的限獨特的限制酶識別序列分布制酶識別序列分布，其基因組，其基因組DNA在限制性內(nèi)在限制性內(nèi)切酶作用下，產(chǎn)生相當多的大小不等片段，這些切酶作

4、用下，產(chǎn)生相當多的大小不等片段，這些片段經(jīng)電泳以后幾乎是連續(xù)排列的，如用放射性片段經(jīng)電泳以后幾乎是連續(xù)排列的，如用放射性同位素標記的同位素標記的DNA作探針，將與被標記的作探針，將與被標記的DNA相關的片段檢測出來，即可構建出多態(tài)性圖譜。相關的片段檢測出來，即可構建出多態(tài)性圖譜?；?本本 原原 理理因此，因此，RFLP即是基于限制性核酸內(nèi)切酶即是基于限制性核酸內(nèi)切酶酶切消化核酸及標記的酶切消化核酸及標記的DNA探針能與任探針能與任何序列相似的片段雜交，通過片段長度何序列相似的片段雜交，通過片段長度變異性來檢測生物體多態(tài)性。變異性來檢測生物體多態(tài)性。基基 本本 原原 理理基本基本方法方法 提取

5、基因組提取基因組DNA制性內(nèi)切酶酶切制性內(nèi)切酶酶切 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 DNA變性、轉膜、固定變性、轉膜、固定核酸雜交核酸雜交 顯影、顯色、分析顯影、顯色、分析限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶(restriction endonuclease(restriction endonuclease， RERE） 一類能識別環(huán)狀或線性雙鏈一類能識別環(huán)狀或線性雙鏈DNADNA特定特定核苷酸序列的核苷酸序列的DNADNA水解酶，在合適反應條水解酶，在合適反應條件下，使每條鏈的一個磷酸二酯鍵斷開，件下，使每條鏈的一個磷酸二酯鍵斷開，產(chǎn)生多種可測量的寡核苷酸片段的酶。產(chǎn)生多種可測量的寡核苷酸片段的酶。 內(nèi)切

6、酶的命名規(guī)則內(nèi)切酶的命名規(guī)則前三個字母代表其來源的細菌種名，用前三個字母代表其來源的細菌種名，用斜體字母，第四個字母代表菌株名稱，斜體字母，第四個字母代表菌株名稱，如果同一株菌有不同限制性內(nèi)切酶系統(tǒng)，如果同一株菌有不同限制性內(nèi)切酶系統(tǒng)，則不同的內(nèi)切酶系用羅馬數(shù)字區(qū)分。則不同的內(nèi)切酶系用羅馬數(shù)字區(qū)分。 例：例：EcoEcoRIRI代表該酶來源于代表該酶來源于E. coliE. coli的的R R菌株。菌株。 瓊脂糖凝膠電泳槽和電泳儀瓊脂糖凝膠電泳槽和電泳儀轉移電泳槽轉移電泳槽核酸分子雜交的概念及原理核酸分子雜交的概念及原理核酸雜交核酸雜交: :兩個不同來源的、含有互補核苷酸順兩個不同來源的、含有

7、互補核苷酸順序的單股核酸分子，通過堿基配對形序的單股核酸分子，通過堿基配對形成一個新的、穩(wěn)定的雙股分子的過程。成一個新的、穩(wěn)定的雙股分子的過程。 核酸經(jīng)加熱變性后，在低于變性溫度核酸經(jīng)加熱變性后，在低于變性溫度2020 3030時，反應系統(tǒng)中加入的時，反應系統(tǒng)中加入的核酸探針核酸探針與待測核酸樣品中具有互補序列的單鏈與待測核酸樣品中具有互補序列的單鏈DNADNA或或RNARNA形成雙鏈結構，通過檢測標記信號即形成雙鏈結構，通過檢測標記信號即可檢測特定的核苷酸片段?？蓹z測特定的核苷酸片段。 核酸分子雜交技術原理核酸分子雜交技術原理根據(jù)探針上的標記，可用放射自顯影根據(jù)探針上的標記，可用放射自顯影或

8、加入酶底物顯色的方式觀察結果。或加入酶底物顯色的方式觀察結果。優(yōu)點優(yōu)點1可靠性較高可靠性較高2來源于自然變異來源于自然變異 3標記覆蓋面廣標記覆蓋面廣優(yōu)優(yōu) 缺缺 點點缺點：缺點：檢測步驟多，周期長；檢測步驟多，周期長；對對DNA需求量大，一般需要需求量大，一般需要5l0g，純度要求較高；純度要求較高；技術復雜，操作繁瑣，工作量大；技術復雜，操作繁瑣，工作量大；具有放射性的危害；具有放射性的危害；檢測成本高。檢測成本高。討論：討論：RFLP與脈沖場凝膠電泳都是根據(jù)與脈沖場凝膠電泳都是根據(jù)基因組上的限制性內(nèi)切酶位點的基因組上的限制性內(nèi)切酶位點的多態(tài)性來對生物進行基因分型的，多態(tài)性來對生物進行基因分

9、型的，那么它們兩者的異同點有哪些呢？那么它們兩者的異同點有哪些呢？基于上述基于上述RFLP的缺點，一種更好的的缺點，一種更好的分析技術分析技術聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應-限制性限制性片段長度多態(tài)性分析技術片段長度多態(tài)性分析技術 （PCR-RFLP ）應運而生。）應運而生。結合結合PCR技術與技術與RFLP技術的優(yōu)點，其基本原技術的優(yōu)點，其基本原理是對目的基因片段理是對目的基因片段PCR擴增后，利用多種擴增后，利用多種限制性內(nèi)切酶，對擴增產(chǎn)物進行酶切，不同基限制性內(nèi)切酶，對擴增產(chǎn)物進行酶切，不同基因序列，不同限制性內(nèi)切酶酶切擴增產(chǎn)物，在因序列，不同限制性內(nèi)切酶酶切擴增產(chǎn)物，在電泳后可產(chǎn)生不同電泳圖

10、譜，通過對電泳圖譜電泳后可產(chǎn)生不同電泳圖譜，通過對電泳圖譜的分析，得出基因多態(tài)性結果。的分析，得出基因多態(tài)性結果。思考：需要和探針做核酸雜交嗎？為什么？思考：需要和探針做核酸雜交嗎？為什么？基本原理基本原理根據(jù)名稱：根據(jù)名稱： PCR-RFLP猜想本方法的原理？猜想本方法的原理？1. 提取提取DNA2. 設計特異引物進行目的基因設計特異引物進行目的基因PCR反應反應3. 將將DNA擴增產(chǎn)物選用合適限制性內(nèi)切酶酶擴增產(chǎn)物選用合適限制性內(nèi)切酶酶切切4. 將酶切出來的具各種長度的將酶切出來的具各種長度的DNA片段在瓊片段在瓊脂糖凝膠上電泳分離脂糖凝膠上電泳分離5. 對顯示出來的帶譜進行分析。對顯示出

11、來的帶譜進行分析。 基基 本本 程程 序序根據(jù)基本原理思考基本程序？根據(jù)基本原理思考基本程序？優(yōu)優(yōu) 缺缺 點點 優(yōu)點：優(yōu)點：敏感性高。敏感性高。操作簡便省時。操作簡便省時。缺點：缺點：影響因素較多。影響因素較多。不能完全區(qū)分基因非常相似，甚至只有一不能完全區(qū)分基因非常相似，甚至只有一個核苷酸差異的生物類型。個核苷酸差異的生物類型。 RFLP與與PCR-RFLP的應用的應用 結核分枝桿菌結核分枝桿菌IS6110-RFLP分分析析 厭氧菌厭氧菌16SrRNA基因基因PCR-RFLP分析分析 其他其他 二、隨機擴增多態(tài)性二、隨機擴增多態(tài)性DNA分析技術分析技術random Amplified Pol

12、ymorphism DNA， RAPD 以以PCR技術為背景，以人工合技術為背景，以人工合成的堿基順序隨機排列的寡核成的堿基順序隨機排列的寡核苷酸單鏈為引物，對所研究的苷酸單鏈為引物，對所研究的基因組基因組DNA進行進行PCR擴增，經(jīng)擴增，經(jīng)電泳分離后產(chǎn)生電泳分離后產(chǎn)生DNA指紋圖譜。指紋圖譜。 模板模板DNA經(jīng)經(jīng)9294變性解鏈后，在較低溫度變性解鏈后，在較低溫度下退火，此時，有許多位點能與隨機合成的短下退火，此時，有許多位點能與隨機合成的短引物互補而形成雙鏈結構。如果某兩位點間在引物互補而形成雙鏈結構。如果某兩位點間在可擴增范圍之內(nèi)，且分別位于互補的兩條單鏈可擴增范圍之內(nèi)，且分別位于互補的

13、兩條單鏈上，并且與引物的上，并且與引物的3端相對應，就可以通過端相對應，就可以通過PCR得到一個擴增產(chǎn)物。得到一個擴增產(chǎn)物?；?本本 原原 理理RAPD所用的一系列所用的一系列DNA引物序列各不相同，但引物序列各不相同，但對于任意特定引物，它同基因組對于任意特定引物，它同基因組DNA序列有其序列有其特定結合位點，如果基因組在這些區(qū)域發(fā)生片段特定結合位點，如果基因組在這些區(qū)域發(fā)生片段插入、缺失或堿基突變就可能導致這些特定結合插入、缺失或堿基突變就可能導致這些特定結合位點分布發(fā)生相應變化，而使位點分布發(fā)生相應變化，而使PCR產(chǎn)物增加、產(chǎn)物增加、減少或發(fā)生分子量改變，產(chǎn)生多態(tài)性圖譜。減少或發(fā)生分子

14、量改變，產(chǎn)生多態(tài)性圖譜。基基 本本 原原 理理總總DNA提取提取隨機引物合成隨機引物合成PCR擴增擴增隨機引物篩選隨機引物篩選電泳檢測電泳檢測圖譜分析圖譜分析采用隨機引物，無需預先知道被研究生物采用隨機引物，無需預先知道被研究生物基因組核苷酸序列；基因組核苷酸序列；引物短，在整個基因組內(nèi)的結合位點多，引物短，在整個基因組內(nèi)的結合位點多，2種甚至多種引物可混用；種甚至多種引物可混用；成本較低；成本較低；操作簡便，快速；操作簡便，快速；DNA分析效率較高；分析效率較高；所需所需DNA樣品少。樣品少。優(yōu)優(yōu) 點點重復性不高（最大缺點）；重復性不高（最大缺點）；只能區(qū)分不同大小的片段，而不能區(qū)分有只能區(qū)

15、分不同大小的片段，而不能區(qū)分有不同堿基序列但大小相同片段；不同堿基序列但大小相同片段；需對引物進行篩選，難以進行標準化。需對引物進行篩選，難以進行標準化。缺缺 點點三、細菌基因組重復三、細菌基因組重復序列序列PCRPCR技術技術（repetitive-element PCR, repetitive-element PCR, rep-PCRrep-PCR）一種基于一種基于PCRPCR的的DNADNA標記技術標記技術 rep-PCR rep-PCR技術是利用基因組中廣泛技術是利用基因組中廣泛分布的分布的短重復序列（短重復序列（repetitive repetitive sequences)sequ

16、ences)為引物進行為引物進行PCRPCR擴增，通過擴增，通過對對PCRPCR產(chǎn)物的電泳結果進行比較，來分產(chǎn)物的電泳結果進行比較，來分析菌株間基因組存在的差異。析菌株間基因組存在的差異。rep-PCR-原理原理 目前研究最多、最常用的細菌基因組短目前研究最多、最常用的細菌基因組短重復序列有：重復序列有：rep-PCR-短重復序列短重復序列基因外重復回文序列基因外重復回文序列（Repetitive Intergenic Palindrome,REP)腸細菌基因間共有重復序列腸細菌基因間共有重復序列（Entero-bacterial Repetitive Intergenic Consensus

17、, ERIC) 兩者的兩者的共同特征共同特征是它們在細菌基因組中是它們在細菌基因組中存在著菌株、種、屬水平上的分布和拷貝數(shù)量存在著菌株、種、屬水平上的分布和拷貝數(shù)量的差異，而序列本身在進化過程中又具有較強的差異，而序列本身在進化過程中又具有較強的的保守性保守性。 基于這兩種短重復序列的基于這兩種短重復序列的PCR就成為就成為rep-PCR的的2個重要的技術個重要的技術REP-PCR和和ERIC-PCR。rep-PCR-短重復序列短重復序列兩種短重復序列的特點及功能：兩種短重復序列的特點及功能： 基因外重復回文序列（基因外重復回文序列（REP）又稱回文單）又稱回文單位，其結構特點是位，其結構特點

18、是回文性質回文性質，其轉錄的，其轉錄的mRNA有形成莖有形成莖-環(huán)（環(huán)（stem-loop）結構的潛能。）結構的潛能。 REP家族序列由家族序列由38bp構成，含有構成，含有6個非常個非常保守的位點及保守的位點及5bp構成的位于非常保守的回文構成的位于非常保守的回文臂之間的保守環(huán)。臂之間的保守環(huán)。REP序列序列rep-PCR-REP序列序列 REP REP家族序列廣泛分布在家族序列廣泛分布在大腸埃希菌大腸埃希菌和和沙門菌沙門菌基因組內(nèi)基因組內(nèi)( (提示什么？）。提示什么？）。REPREP序列可以單獨出現(xiàn)或增加為序列可以單獨出現(xiàn)或增加為4 4個串聯(lián)的重個串聯(lián)的重復單位。在復單位。在E.coliE

19、.coli的染色體上，存在的染色體上，存在500500到到10001000個的個的REPREP串聯(lián)重復單位，在沙門菌串聯(lián)重復單位，在沙門菌上上REPREP串聯(lián)重復單位約占基因組的串聯(lián)重復單位約占基因組的1%1%。rep-PCR-REP序列序列REP序列的功能：序列的功能：rep-PCR-REP序列序列轉錄終止作用；轉錄終止作用；穩(wěn)定穩(wěn)定mRNA；在體內(nèi)染色體區(qū)段的組織作用。在體內(nèi)染色體區(qū)段的組織作用。 根據(jù)根據(jù)REPREP這段高度保守的重復序列設計這段高度保守的重復序列設計引物，擴增兩段引物，擴增兩段REPREP之間的片段，擴增產(chǎn)物之間的片段，擴增產(chǎn)物的的數(shù)量數(shù)量和片段和片段長短長短的不同就直

20、接反映了基的不同就直接反映了基因組因組DNADNA的差異，從而可對菌株進行分型和的差異，從而可對菌株進行分型和同源性分析，這就是同源性分析，這就是rep-PCRrep-PCR技術中的技術中的REP-REP-PCRPCR技術。技術。rep-PCR-REP-PCR技術技術 腸細菌基因間共有重復序列（腸細菌基因間共有重復序列（ERICERIC）長約）長約126bp126bp，其中包含幾個反向重復序列，具有非，其中包含幾個反向重復序列，具有非常保守的中央倒置重復區(qū)，轉錄后的常保守的中央倒置重復區(qū)，轉錄后的mRNAmRNA形成形成莖莖- -環(huán)結構。環(huán)結構。 當莖環(huán)結構中位于莖部位的一個堿基發(fā)生當莖環(huán)結構中位于莖部位的一個堿基發(fā)生改變時，與其相對應的堿基也要發(fā)生相應的改改變時，與其相對應的堿基也要發(fā)生相應的改變，從而保證二級結構的穩(wěn)定。變，從而保證二級結構的穩(wěn)定。rep-PCR-ERIC序列序列結構特點結構特點 ERIC序列的功能目前還不太清楚，在一序列的功能目前還不太清楚，在一些研究中，些研究中，ERIC被認為：被認